专利名称：一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。
背景技术：
禽蛋的蛋壳颜色按主要色系可分为三种类型，白壳、褐壳和绿壳(Lang，Μ. R.， and J. W. Wells. 1987. A review of eggshell pigmentation. World' s Poult. Sci. J. 43 238-245.)。绿壳蛋以其独特的蛋壳颜色，一直以来都吸引着国内外研究者的目光。国外研 究比较多的是智利的安克纳(Araucano)绿壳蛋鸡。在我国，产绿壳蛋的品种有四川旧院 鸡、河南卢氏鸡、湖北江汉鸡及江西东乡绿壳蛋鸡。在这些品种中，研究最多的是东乡绿壳 蛋鸡。Punnett (1933)发现绿壳性状是由显性单基因控制的质量性状(Purmett RC. Genetic studies in poultry IX. The blue egg. J Genet，1933，27 :465 470.)，显性 纯合子和杂合子均表现出绿壳特性。这意味着对于绿壳个体，无法根据表型来判断其基因 型是否纯合，也就无法彻底从群体中淘汰隐性(非绿壳)基因。绿壳蛋鸡生产中存在的一 个关键问题是绿壳性状很难提纯，后代经常会出现褐壳个体。绿壳鸡蛋在市场上非常受消费者欢迎，不仅在我国，日本的绿壳鸡蛋价格也远高 于其他鸡蛋。现在，绿壳蛋鸡饲养量在逐步加大，江西、上海、湖北、河南、北京等地是绿壳蛋 鸡主要饲养地。目前，绿壳蛋鸡品种选育和商品化生产面临着一些技术难题，主要问题是蛋 壳颜色的保持和产蛋数量的提高。蛋壳颜色方面，由于绿壳性状由显性基因控制，隐性基因 不易淘汰，使得绿壳蛋鸡群体中总是出现一些产褐壳蛋的个体，群体的纯度难以提高；产蛋 数量方面，由于绿壳基因还没有被克隆，绿壳蛋鸡的杂交利用受到限制，杂交以后易出现绿 壳基因的分离。在实际生产中，因蛋壳颜色属限性性状，只能在母鸡产蛋后表现。所以，利 用常规育种手段，选育绿壳群体至少要等24周后个体开产才能进行，而对公鸡的选择也只 能通过后裔测定来完成，选择的周期长，进展缓慢。此外，要想在绿壳群体中彻底淘汰隐性 基因，需要通过测交的方法检出杂合个体。当对某一待测个体进行测交时，需观测到5个以 上的后代均产绿壳时，才有95%的把握认定待测个体基因型为显性纯合。这样需要进行大 量的测交，不仅延长选育的周期，还造成很高的财力、人力负担。尽管，对绿壳基因的定位工作已经开展了有30多年，但目前该基因尚未被准确定 位。早在上世纪30年代Bruckner和Zartman就注意到绿壳(0)和豆冠(P)存在连锁关系 (Bruckner, J. H. ,and F. B. Hutt,1939. Linkage of pea comb and blue egg in the fowl. Science 90 :88.)。在1973年Zartman利用两个转座子标记将豆冠基因定位于1号染色 体短臂上，从而证明绿壳基因也位于鸡1号染色体上(Zartman DL. Location of the pea comb gene. Poult Sci.，1973，52(4) 1455-62.) Bitgood 等(1980，1983，1985，2000)通 过回交设计，首次将绿壳基因定位于鸡1号染色体短臂，并得出绿壳和豆冠间的遗传距离 是3. 1-4. 23cM(Bitgood JJ,Shoffner RN,Otis JS,Briles WE. Mapping of the genes for pea comb,blue egg, barring,silver,and blood groups A, E,H,and P in the domesticfowl. Poult Sci.，1980，59(8) :1686-93· ；Bitgood JJ, Otis JS，Shoffner RN. Refined Linkage Value for Comb and Blue Egg :Lack of Effect of Pea Comb，Blue Egg，and Naked on Aage at First egg in the Domestic Fowl. Poult Sci.，1983，62 :235_238.； Bitgood J. J. Locating pea comb and blue egg in relation to the centromere of chromosome 1 in the chicken. Poult Sci. ,1985,64 1411 1414. ；Bitgood JJ, Briles RW, Briles WE. Further tests for genetic linkages of three morphological traits，three blood groups，and break points of two chromosome translocations on chromosome one in the chicken. Poult Sci.2000,79(3) :293_5·)。Bartlett 等(1996) 利用鸡的内源病毒evl对绿壳基因进行了定位，结果是O和P间的距离是4. lcM(Bartlett, J. R. , C. P. Jones, and Ε. J. Smith. 1996. Linkage analysis of endogenous viral elementl,blue eggshell, and pea comb loci in chickens. J. Hered. 1996,87 :67_70.)。 这项工作较Bitgood改进之处在于Bartlett所用的evl标记，在染色体上插入位点已知 (Chrlp :68，099，410bp-68，099，950bp)。王晓通(2008)利用 1 个 SNP 标记和 3 个微卫星 标记，将绿壳基因定位到Chrlp :67，296，991bp-69，140，571bp之间1. 8Mb的区段内(王晓 通.鸡绿壳蛋色素形成的生理学与遗传学分析.中国农业大学博士论文，2008，6)。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。本发明提供的专用引物对是序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA 组成的引物对。本发明还保护所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(00)、绿壳基 因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(OO)中的应用。本发明提供的辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子(00)、绿壳基因杂合子 (Oo)和非绿壳基因纯合子(Q0)的方法，包括如下步骤(1)提取待测鸡的基因组DNA ；(2)以基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(3)根据PCR产物辅助鉴定如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列3所 示，待测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增产物有两种，分别如序列表的序列3和 序列4所示，则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表 的序列4所示，则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。所述待测鸡具体可为东乡绿壳蛋鸡。步骤(3)中，具体可通过SSCP电泳检测所述PCR产物。目前有多种SNP分型方法，如SNP芯片、时间飞行质谱、直接测序、焦磷酸测序、 SNPlex, taqman探针法等；这些方法虽然通量高、准确性好，但也存在费用昂贵、对仪器 试剂要求高的缺点；在很大程度上限制了这些技术的推广普及。在传统的SNP分型方法 中，应运最普遍的是 SSCP 法(single strand conformation polymorphism)禾口 RFLP 法 (restriction fragment length polymorphism)。这两禾中方法虽然在通量上无法与上述方 法相比，但具有操作简便、廉价、对仪器试剂要求低，易普及推广的优点。SSCP是基于DNA构 象检测PCR产物单链碱基微小差异的方法，因其检测敏感、快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用；但该方法的试验结果受多种因素的影响，如试验操作的技巧、环 境温度、PCR产物浓度、PCR扩增位点碱基构成、电压、PAGE胶的浓度和交联度等，因而重复 性比较差。SSCP操作时必须经过变性的步骤，对于一些高GC位点，因为退火温度较高，一 般很难维持单链状态，这样的位点不适合用此项技术来分型。本发明提供的标记的本质是 13bp缺失，多碱基缺失远比单碱基的转换或颠换对单链构像的影响大，所以更适合用SSCP 技术检测标记的基因型。所述的引物对可用于制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合 子和非绿壳基因纯合子的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非 绿壳基因纯合子的试剂盒，包括所述的引物对。所述引物对，所述方法或所述试剂盒均可用于绿壳蛋鸡育种。如需对绿壳蛋鸡进 行杂交以提高产蛋数，而同时要求保留绿壳特性，该标记可用以对绿壳位点的变化进行跟 踪，从而在杂交后代中保持绿壳性状。本发明还保护一种绿壳蛋鸡育种方法，是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行 育种；所述绿壳基因纯合子是所述方法鉴定的。本发明可以弥补常规育种方法的不足，缩短育种周期，提高育种的准确性。本发明 的优点(1)建立在绿壳基因精细定位的基础之上，在定位区域内找到13bp缺失标记，该标 记与绿壳性状显著关联，根据标记基因型推断个体为绿壳的准确性大于93 %，依据标记基 因型推断绿壳基因型的准确性可达92. 16% ； (2)不受性别限制；(3)绿壳蛋鸡开产时间通 常为21-24周，本发明在个体雏鸡阶段即可推断出个体表型及基因型，可以早选择早淘汰， 可缩短育种时间，加快育种进程，节省饲养成本。
图1为SSCP检测结果及对应基因型测序结果；测序结果中，方框内为13bp缺失序 列，箭头标出了缺失位置。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Gene Amp PCR System 9700 PERKIN ELMER 公司，USA。凝胶成像系统Alpha Innotech 公司。实施例l、13bp缺失多态的发现及引物对的设计东乡绿壳蛋鸡是我国著名的绿壳蛋鸡品种，因绿壳基因(0)为显性基因，所以群 体中仍存在部分携带隐性基因(ο)的杂合子。绿壳基因纯合子之间产生的后代，产蛋性状 不发生分离，都产绿壳蛋。绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子之间会产生约1 1的绿壳基 因纯合子和绿壳基因杂合子，从而使非绿壳基因传代下去。绿壳基因杂合子之间产生的后 代，会出现产褐壳蛋的个体(非绿壳基因纯合子)，造成纯种不纯的尴尬局面。即东乡绿壳 蛋鸡中，根据绿壳基因(0)可分为三种基因型绿壳基因纯合子(00)、绿壳基因杂合子(Oo)和非绿壳基因纯合子(OO)；其中绿壳基因纯合子和绿壳基因杂合子产绿壳蛋，为东乡绿壳 群体；非绿壳基因纯合子产褐壳蛋，为东乡褐壳群体。一、13bp缺失多态的发现在测序时发现一个与绿壳性状显著关联的SNP标记。与东乡绿壳群体相比，东乡 褐壳群体存在13bp的缺失(Chrlp :67，419，892bp-67，419，904bp)。将该标记命名为13bp缺失。二、引物对的设计基于该13bp缺失的上下游序列，设计特异引物对如下(5’ -3’ )F :ATCTATAAAGGAGCAAGG(序列表的序列 1)；R :ATGAGGGTAAGAGGACAC (序列表的序列 2)。目的片段长度342bp。如果仅得到342bp的PCR产物，样本为候选的绿壳基因纯合 予；如果仅得到329bp的PCR产物，样本为候选的非绿壳基因纯合子；如果同时得到342bp 和329bp的PCR产物，样本为候选的绿壳基因杂合子。实施例2、应用引物对辅助鉴定东乡绿壳蛋鸡289只东乡绿壳蛋鸡购自江西省东乡县华绿种禽养殖场。将每只东乡绿壳蛋鸡 分别与白来航鸡杂交如果子一代都产绿壳蛋，该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因纯合子；如果 子一代既有产绿壳蛋的个体又有产褐壳蛋的个体，该东乡绿壳蛋鸡为绿壳基因杂合子；如 果子一代都产褐壳蛋，该东乡绿壳蛋鸡为非绿壳基因纯合子。289只东乡绿壳蛋鸡中，104 只为非绿壳基因纯合子，150只为绿壳基因纯合子，35只为绿壳基因杂合子。1、提取基因组DNA各个样本翅静脉采血，提取高盐法提取基因组DNA。具体过程如下(1)配置溶液溶液A:100mM Tris-Cl (pH7. 5), IOOmM EDTA, IOOmM NaCl，0. 5% SDS，室温保存。 溶液B 取200ml 5M乙酸钾溶液和500ml 6M氯化锂溶液，充分混勻，4°C保存。(2)取50-100 μ 1鸡血，加500-550 μ 1溶液Α，充分混勻；(3) 65 V恒温水浴2-4小时； (4)加溶液B 850 μ 1,充分混勻后冰浴15-30分钟；(5) 12000rpm 常温离心 I5 分钟；(6)吸上清600-800 μ 1 (如有必要再次12000rpm常温离心15分钟，吸上清)；(7)加氯仿600 μ 1，充分混合2-3分钟；(8) 12000rpm 离心 10 分钟；(9)吸取上清约600 μ 1，加异丙醇600 μ 1，充分混合2_3分钟；(10) 12000rpm 常温离心 10 分钟；(11)去上清，加Iml 70%的酒精洗涤沉淀；(12) 12000rpm 常温离心 3-5 分钟；(13)去上清，真空离心抽风10分钟；(14)加 TE 200-400 μ 1，55°C水浴 10 小时；(15)0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测，电压140-150伏，电泳30分钟；
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(16) _20°C保存(基因组 DNA)。2、以基因组DNA为模板，用实施例1设计的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物。PCR 反应体系(25μ 1) 2. 5μ 1 IOXTaq DNA 聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl, IOOmmol/ L Tris ‘ Cl, 15mmol/L MgCl2,0· 01 % 明胶)，2 μ 1 dNTPs (ATP、TTP、GTP、CTP 的浓度均为 2. 5mmol/L)，两条引物的终浓度均为20ymol/L，lU Taq DNA聚合酶，50_100ng模板。PCR 反应条件94°C 5min;然后 94°C 30S，57°C 30S，72°C 40S，36 个循环；最后 72°C 7min。3、将PCR扩增产物进行电泳和基因分型以30%非变性聚丙烯酰胺贮液(丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺=29 1)制作Imm 厚凝胶为例，具体过程如下(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干，用75%乙醇擦拭玻璃板，自 然晾干，装板灌胶。(2)配置12%非变性丙烯酰胺凝胶。每35ml 12 %非变性丙烯酰胺胶14ml 30 %丙烯酰胺，3. 5ml 50%甘油，7ml 5 X TBE, 10. 2ml dH20, 280 μ 1 10% 过硫酸铵，20μ1 TEMED0(3)当浇灌至离玻璃板上沿0. Icm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合1小时，多余的 丙烯酰胺4°C保存，随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入IXTBE，用注射器冲洗加样孔。(5)预电泳10分钟，同时准备点样。(6)取2ul步骤2的PCR扩增产物置于PCR管中，加8ul变性Buffer,离心混勻， 98°C变性10分钟，迅速冰浴10分钟，用微量移液器点样。变性Bufffer 由98体积份的去 离子甲酰胺和2体积份的0. 5M pH = 8. OEDTA溶液组成。(7)打开电源，250伏电泳10分钟，将电压调至150伏，电泳18小时。(8)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心剥下凝胶，置染色液中染色30min。 染色液由硝酸银和ddH20组成，硝酸银浓度为0. 2%。(9)染色结束，回收AgNO3,去离子水洗胶3遍，每次2分钟，洗去多余染色液。(10)显色液显色，视单链清晰，背景淡黄(时间约10-20min)，立即倒掉显色液，用 10%乙酸终止显色反应。显色液为10% (体积百分含量)乙酸水溶液。(11)照相、保存。(12)根据染色结果进行基因分型。将未发生缺失的等位基因定义为A，缺失的等位基因定义为a。AA基因型个体、Aa 基因型个体和aa基因型个体的电泳图见图1。绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳 基因纯合子中，各种基因型的频率见表1。表113bp缺失标记在绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子中的 频率
权利要求
序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对。
2.权利要求1所述引物对在辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子 和非绿壳基因纯合子中的应用。
3.辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子的方 法，包括如下步骤(1)提取待测鸡的基因组DNA;(2)以基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(3)根据PCR产物辅助鉴定如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列3所示，待 测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增产物有两种，分别如序列表的序列3和序列4 所示，则待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表的序列 4所示，则待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述待测鸡为东乡绿壳蛋鸡。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于步骤(3)中，通过SSCP电泳检测所述 PCR产物。
6.权利要求1所述的引物对在制备辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因 杂合子和非绿壳基因纯合子的试剂盒中的应用。
7.一种辅助鉴定绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子、绿壳基因杂合子和非绿壳基因纯合子 的试剂盒，包括权利要求1所述的引物对。
8.权利要求1所述引物对，权利要求3至5中任一所述方法或权利要求7所述试剂盒 在绿壳蛋鸡育种中的应用。
9.一种绿壳蛋鸡育种方法，是采用绿壳蛋鸡中的绿壳基因纯合子进行育种；所述绿壳 基因纯合子是通过权利要求3至5中任一所述方法鉴定得到的。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定绿壳蛋鸡的方法及其专用引物对。本发明提供了序列表的序列1和2所示DNA组成的引物对。本发明的方法包括如下步骤以基因组DNA为模板，用所述引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增只有一种产物，且如序列3所示，待测鸡为候选的绿壳基因纯合子；如果PCR扩增有两种产物，分别如序列3和4所示，待测鸡为候选的绿壳基因杂合子；如果PCR扩增只有一种产物，且如序列4所示，待测鸡为候选的非绿壳基因纯合子。本发明在绿壳基因的定位区域内找到与绿壳性状显著关联的13bp缺失标记，不论是公鸡还是母鸡均可在当代的雏鸡中进行选择。本发明可以弥补常规育种方法的不足，缩短育种周期，提高育种的准确性。
文档编号A01K67/027GK101935653SQ201010217329
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者吴常信, 王哲鹏, 王晓通, 邓学梅 申请人:中国农业大学