专利名称：通过杂交种子生产期间的操纵进行的混合庇护区部署的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治理作物中的昆虫抗性的方法。
背景技术：
昆虫、线虫和相关的节肢动物每年在美国估计破坏15%的农作物，在发展中国家破坏的比例更高。单在美国，这些害虫每年造成的作物损害就超过1000亿美元。另外，与杂草及寄生植物和腐生植物的竞争也造成更多的潜在产量损失。这种损害有些是在植物病原体、昆虫和其他此类土生(soil borne)害虫在种子种植后攻击种子时在土壤中发生的。例如，在玉米的生产中，大多损害是由根虫(啃食或以别的方式损害植物的根的害虫)以及由切根虫(cutworms)、欧洲玉米螟和其他啃食或损害植物地上部分的害虫造成的。有关害虫攻击农作物的类型和机制的一般性描述在(例如)以下文献中提供Metcalf (1962)，Destructive and Useful Insects，第 4 版(McGraw-Hill Book Co. ，NY)；禾口 Agrios(1988)，Plant Pathology,第 3 版(Academic Press, NY)。在与这些害虫进行的季节性斗争中，农场主们必须施用上亿加仑的合成杀虫剂来抗击这些害虫。然而，合成杀虫剂会造成许多问题。它们昂贵，单美国农场主每年就差不多花掉80亿美元。它们促进抗杀虫剂害虫的出现，而且它们会损害环境。由于担忧杀虫剂对公众健康和环境健康的影响，人们已作出了极大的努力来寻找减少化学杀虫剂使用量的方法。最近，该努力在很大程度上集中在开发经工程改造而能表达源于微生物的昆虫毒物的转基因作物上。例如，授予Estruch等人的美国专利 No. 5，877，012公开了将来自诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞杆菌属(Peudomonas)、 棒形杆菌属(Clavibacter)和根瘤菌属(Rhizobium)之类的微生物的蛋白质克隆进植物中并在植物中表达，以获得对诸如小地老虎(black cutworm)、行军虫、数种钻蛀虫之类的害虫和其他昆虫害虫有抗性的转基因植物。Privalle等人的专利公布W0/EP97/07089教导了用编码过氧化物酶的重组DNA序列转化单子叶植物如玉米，以保护该植物免遭玉米螟、穗虫和切根虫的啃食。Jansens等人(1997)Crop Sci. ,37(5) :1616_1624报道了含有编码Bt的结晶蛋白的基因的转基因玉米的产生，该结晶蛋白控制了两代的东部玉米螟 (Eastern Corn Borer, ECB) 授予 Koziel 等人的美国专利 No. 5，625，136 和 No. 5，859，336 报道说，用来自Bt的编码δ -内毒素的基因转化玉米产生了 ECB抗性得到改善的转基因玉米。Armstrong等人，Crop Science, 35 (2) 550-557 (1995)已提供了表达苏芸金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis, Bt)的杀昆虫蛋白的转基因玉米的田间试验综合报告。环境友好的害虫控制方法是使用源自苏芸金芽胞杆菌(Bt)这种土壤细菌的杀虫晶体蛋白，这种蛋白质通常称为“Cry蛋白”或“Cry肽”。Cry蛋白是球状蛋白质分子，其在 Bt孢子形成阶段的后期以结晶形式作为原毒素(protoxin)积聚。在被害虫摄取后，该晶体在幼虫的碱性中肠环境中溶解而释放出原毒素。原毒素(约130kDa)被肠道蛋白酶转化成毒性片段(约66kDa N末端区域)。许多这些蛋白质对特定的目标昆虫毒性很大，但对植物和其他非目标生物体无害。已使一些Cry蛋白在作物中重组表达来提供抗害虫转基因植物。在这些植物当中，Bt转基因棉花和玉米已得到广泛种植。
很多Cry蛋白已得以分离、表征并且根据氨基酸序列同源性进行了分类 (Crickmore 等人，1998，Microbiol. Mol. Biol. Rev. ,62 :807_813)。该分类方案为新发现的 Cry蛋白的命名和归类提供了系统性机制。Cryl分类法是已知最好的分类法，包含的cry 基因数目最多，目前总数超过130种。西部玉米根虫(WCRW)会在大豆中产卵并且也可能会在其他的作物生境中产卵， 其有一种生物型目前能够给第一年玉米(即之前未有系统地种植玉米的玉米)造成重大伤害。该生物型常称为第一年玉米根虫或抗轮作(rotation-resistant)玉米根虫。当根虫卵保留在土壤中超过一年时，第一年玉米也可能易受根虫伤害。在该情况中，产在田地中的卵在随后一年中保持休眠，然后在下一年孵化，此时玉米可能在两年轮作周期中再次种植。 这种根虫活动性被称为长期滞育(extended diapause)，通常涉及北部玉米根虫(NCRW)，特别是美国玉米带(Corn Belt)的西北部地区的北部玉米根虫。该WCRW生物类型可引起关于抗性治理的额外问题，因为种植不作为该昆虫的宿主的作物不影响该昆虫。 此外，包括美国在内的大多数国家在使用转基因作物时都有大量的注册要求，以使抗性害虫的发展减至最低，从而延长已知的生物杀虫剂的使用寿命。庇护区(Refuge)的一个最普通的实例是，在给定的作物中，所种植的种子有80%可含有能杀死目标害虫(如 WCRff)的转基因事件，而20%的种子必须不含该转基因事件。这种庇护区策略的目的是防止目标害虫对转基因作物产生的特定生物杀虫剂产生抗性。由于在80%转基因区域中达到成熟的目标昆虫很可能会对那里所用的生物杀虫剂有抗性，该庇护区能让对转基因种子中所用的生物杀虫剂没有抗性的成体WCRW昆虫发育。结果，非抗性昆虫与抗性昆虫交配，并且由于抗性基因通常是隐性的，非抗性昆虫使得下一代昆虫中的大部分抗性被消除。该庇护区策略的问题是，为了产生易感昆虫，所种植的作物中有一些必须对害虫易感，从而会降低产量。如上文所述，一个关注的问题是会出现抗性ECB、WCRW或其他害虫。对抗抗性发展的一个策略是，选择表达高水平杀昆虫蛋白的重组玉米事件，使得害虫咬食转基因玉米植株一口或几口就会造成该害虫至少完全停止啃食并随后发生死亡，即使该害虫就抗性性状而言是杂合的(即该害虫是抗性害虫与非抗性害虫交配的结果)。另一个策略是，在同一植株中或在相邻植株中，以重组事件的形式组合第二 ECB 或WCRW特异性杀虫蛋白，例如另一 Cry蛋白或者另一杀昆虫蛋白如重组酰基脂质水解酶或其杀昆虫变体。参见例如WO 01/49834。优选地，第二毒素或毒素复合物将具有与第一毒素不同的作用模式，且优选地，如果受体参与到昆虫对重组蛋白的毒性的话，同一植株或相邻植株中的两种或更多种杀昆虫蛋白中的每一者的受体将不同，从而如果某个受体发生功能变化或某个受体发生功能丧失而造成对特定杀昆虫蛋白的抗性的话，那么该功能变化或功能丧失不应且可能不会影响其余的毒素的杀昆虫活性，该其余的毒素将显示能结合与该造成克隆至植物中的两种杀昆虫蛋白之一的功能丧失的受体不同的受体。因此，一种或多种第一转基因和一种或多种第二转基因优选对同一目标昆虫有杀灭作用并且无竞争地结合至该目标昆虫的肠膜中的不同结合位点。通过将杀昆虫剂直接施用至植物种子来控制害虫的其他实例在(例如)美国专利 No. 5，696，144中提供，该专利公开说，从用1_芳基吡唑化合物以500g/公担种子的比例处理的种子生长的玉米植株所遭受的ECB啃食损害比从未经处理的种子生长的对照植株少。另外，授予Turnblad等人的美国专利No. 5，876，739 (及其母专利美国专利No. 5，849，320) 公开了控制土传昆虫的方法，该方法涉及用含有一种或多种聚合物粘合剂和杀虫剂的涂料处理种子。该参考文献提供了确认为可用于该涂料的候选物的杀昆虫剂列表以及多种潜在的目标昆虫的名称。尽管植物遗传工程的最新进展已改善了不用化学杀虫剂就能保护植物免受害虫侵扰的能力，而且虽然诸如用杀虫剂处理种子之类的技术已减少了杀虫剂对环境的有害影响，但仍有很多问题限制着这些方法在实际田间条件下的成功应用。昆虫抗性治理(insect resistance management, IRM)这个术语用来描述旨在减少昆虫害虫变成对杀虫剂有抗性的潜在可能的措施。Bt IRM的保持是非常重要的，因为昆虫抗性会对掺入植物的Bt保护剂和Bt技术整体的未来使用造成威胁。特定的IRM策略 (如高剂量/结构化庇护区策略)能减轻昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的特定Bt蛋白的抗性。但是，这些策略会导致要让一部分作物保持对一种或多种害虫易感，以确保非抗性昆虫发育而可供与在受保护作物中产生的任何抗性害虫交配。因此，从农场主/生产商的观点来看，非常期望具有尽可能小的庇护区而又能治理昆虫抗性，使得在获得最大产量的同时仍保持所用的害虫控制方法的功效，无论所用的方法是Bt、化学杀虫剂、某种其他方法或它们的组合。目前最常用的IRM策略是高剂量和庇护区的种植(庇护区是总种植面积中用非Bt 种子种植的那部分)，因为通常认为这会通过保持昆虫易感性而延迟昆虫产生对Bt作物的抗性。高剂量被美国环境保护局(US Environmental Protection Agency)召集的专家组定义为植物产生毒素的浓度为杀死99%的易感群体所需的毒素浓度的25倍。高剂量/庇护区策略延缓抗性的理论基础取决于如下假设昆虫抗性的频率和隐性与害虫易感性成反比例；只有当害虫对毒素十分易感时抗性将是稀有的和隐性的；相反，当害虫不是十分易感时，抗性将更频繁且更少隐性。此外，高剂量/庇护区策略假定认为，对Bt的抗性是隐性的，且由具有导致以下三个基因型的两个等位基因的单个基因座赋予易感纯合体(SS)、 杂合体(RS)和抗性纯合体(RR)。还假定认为，会有低的初始抗性等位基因频率，以及抗性成虫和易感成虫之间会有广泛的随机交配。在理想的情形下，只有稀少的RR个体能幸免于 Bt作物所产生的高剂量。SS个体和RS个体都将易感Bt毒素。结构化庇护区是种植者田间中的非Bt区域或允许产生易感(SS)昆虫的一组田地，其中所述易感昆虫可与幸免于Bt 作物的稀少抗性(RR)昆虫进行随机交配而产生会被Bt作物杀死的易感RS杂合体。这会将抗性(R)等位基因从昆虫群体清除，延迟抗性的进化。高剂量/庇护区策略是最广泛认可的IRM策略，并且是管理机构的历史基础。非高剂量策略目前是通过增加庇护区面积在IRM策略中使用。增加庇护区是因为高剂量的缺乏会让部分抗性的昆虫(即具有一个抗性等位基因的杂合昆虫)存活，从而增加抗性基因在昆虫群体中的频率。由于这个原因，许多IRM研究者和专家小组已一致认为，一般而言非高剂量Bt表达相对于高剂量表达会呈现很大的抗性风险(Roush 1994、Gould 1998、Onstad & Gould 1998、SAP 1998、ILSI 1998、UCS 1998、SAP 2001)。但是，这种非高剂 量策略通常对于农场主是不可接受的，因为庇护区面积越大，导致的产量损失越高。目前，庇护区的大小、布置和治理对于高剂量/结构化庇护区策略成功减少昆虫对玉米、棉花和马铃薯中产生的Bt蛋白的抗性是至关重要的。通常要求结构化庇护区包括目标害虫的所有合适的非Bt宿主植物，这些植物由人进行种植和治理。可种植这些庇护区以在害虫可接触到Bt作物的同时提供庇护区，或者在害虫不可接触到Bt作物的时候提供庇护区。这种类型的庇护区的问题包括确保抗性昆虫和易感昆虫之间的随机交配、庇护区和Bt田地之间的不同治理措施(导致庇护区和Bt作物之间不同步，其产生的害虫群体之间也不同步)以及各农场主对单独庇护区要求的一致性(或缺少该一致性)。由于庇护区种植区域中产量降低，一些农场主选择规避庇护区要求，而其他农场主不遵从大小和/或布置要求。这些问题导致没有庇护区或效率低的庇护区，从而导致抗性害虫发展相应增加。因此，仍需要治理抗害虫作物的田地中的害虫抗性的方法。能提供保护植物特别是玉米植物免受害虫的啃食损害的改进方法将是有益的。如果这种方法会减少常规化学杀虫剂的所需施用频率的话，还有 如果会减少作物种植和栽培所需的单独田间操作数量的话，将是特别有益的。此外，拥有部署可排除上述会稀释或消除许多抗性治理策略的效率的一致性有关问题的转基因庇护区的方法，将是有用的。棺物育种技术植物育种的目的是在单个品种或杂种中组合多种期望的性状。对于大田作物，这些性状可包括对病害和昆虫的抗性、对热和干旱的耐受性、减少作物成熟的时间、较高产量和更好的农学品质。随着对许多农作物的机械化采收，诸如萌发、生长植物移植(stand establishment)、生长速率、成熟度以及植株和穗高之类的植物特性是重要的。传统的植物育种是开发新的和改良的商品作物的重要工具。大田作物通过利用植物的授粉方法的技术进行育种。如果花粉从一朵花转移至相同植株的同一朵花或另一朵花，则植物是自花授粉。当相同家系或品系内的个体用于授粉时，则植物是近缘授粉。如果花粉来自不同家系或品系的不同植株上的花时，则植物是异花授粉。本文所用的术语“异花授粉”和“远交”不包括自花授粉或近缘授粉。已自花授粉并且针对类型进行选择许多代的植物在几乎全部的基因座处变成纯合并且产生纯育子代的均质群体。两种不同纯合品系之间的杂交产生杂种植株的均一群体，该杂种植株对许多基因座来说可能是杂合的。各在许多基因座处为杂合的两株植株的杂交将产生异质植株的群体。玉米可通过自花授粉和异花传粉技术二者来进行育种。玉米在相同植株上具有单独的雄花和雌花，分别位于雄穗和雌穗上。当风将花粉从雄穗吹至从雌穗顶部突出的穗丝时在玉米中发生天然的授粉。在玉米植株育种程序中开发杂交玉米品种涉及三个步骤(1)从多个种质库选择植株用于最初的育种杂交；(2)使所选择的来自育种杂交的植株自交数代以产生一系列近交系，这些近交系是各自是纯育的并且高度均质；以及(3)使所选择的近交系与不相关的近交系杂交而产生杂种子代(Fl)。在足够量的近交后，连续子代将仅起到增加所开发的近交系种子的作用。优选地，近交系应该在其约95%或更多的基因座处包含纯合等位基因。在玉米的近交处理期间，品系的活力降低。当将两种不同的近交系杂交以产生杂种子代(Fl)时，活力恢复。近交系的纯合性和同质性的一个重要结果是，确定的一对近交株之间的杂种可无限地繁殖(只要近交亲本的同质性得以保持)。一旦已确定产生优良杂种的近交株，则可用这些近交亲本产生杂交种子的连续供应，然后可从这些杂交种子供应产生杂交玉米植株。
当使两种近交系杂交以 产生Fl子代时，单杂交种得以产生。双杂交种从以杂交对 (AXB和CXD)杂交的四个近交系产生，然后将两种Fl杂种再次杂交(AXB) X (CXD)。三系杂交种从三个近交系产生，其中使近交系中的两种杂交(AXB)，然后将所得的Fl杂种与第三近交系杂交(AXB) XC。在每种情况中，来自母本的果皮组织将是杂交种子的一部分并保护该杂交种子。正如目前所实践的，大规模商业化玉米杂交种子的生产需要使用某些形式的雄性不育系统，该雄性不育系统控制雄性能育性或使雄性能育性失活。控制植株中的雄性能育性的可靠方法还提供了改良植物育种的机会。对于玉米杂交种的开发而言特别是如此，玉米杂交种的开发依赖于某些雄性不育系统。存在着数种可对玉米植株进行操纵而使得其为雄性不育的方法。这包括人工或机械去雄(或去雄穗)、胞质遗传雄性不育、核遗传雄性不育、杀配子剂等的使用。杂交玉米种子通常通过结合了人工去雄或机械去雄的雄性不育系统产生。将两种近交品种的交替带种植于田间，在花粉散落之前从近交品种其中之一(“雌株”)除去带花粉的雄穗。假如与外来玉米花粉源足够分离，则去雄的近交株的雌穗将仅为另一近交品种 (“雄株”)所受精，因而所得的种子是杂交的并将形成杂种植株。通过使用胞质雄性不育(CMS)近交系可避免繁琐的去雄过程。CMS近交系的植株由于胞质(与细胞核相对)中的遗传因子而是雄性不育的。因而，该特性只通过“母”本在玉米植株遗传，因为仅雌配子为受精种子提供胞质。来自非雄性不育的另一近交系的花粉使CMS植株受精。来自第二近交系的花粉可能会或可能不会贡献使杂交植株雄性不育的基因，取决于杂种的预期用途，任一选项都可能是优选的。可将相同的杂交种子(一部分从去雄可育性玉米产生而一部分用CMS系统产生)掺混以确保在杂交植株生长时足够的花粉团可供受精。自二十世纪五十年代以来，CMS系统已得到成功使用，在常规上雄性不育性状被回交进近交系中。参见Wych，第585-586页，1998。有数种赋予遗传雄性不育的方法可用，例如在赋予雄性不育的基因组内独立位置处的多个突变基因，如授予Brar等人的美国专利No. 4，654，465和No. 4，727，219中所公开的，以及Patterson在美国专利No. 3，861，709和No. 3，710，511中描述的染色体易位。将这些专利以及全部专利以引用的方式并入本文。除了这些方法外，先锋高级育种国际公司 (Pioneer Hi-Bred)的Albertsen等人(美国专利No. 5，432，068)描述了一种核雄性不育的系统，其包括鉴定对雄性能育性关键的基因；使这个对雄性能育性关键的天然基因沉默；从该必需的雄性能育性基因移除天然启动子并用诱导型启动子代替；将该经遗传工程改造过的基因插回至植株中；从而产生了雄性不育的植株，因为该诱导型启动子未“开启” 从而导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导(或“开启”)启动子，其继而允许赋予雄性能育性的基因被转录，来恢复能育性。赋予遗传雄性不育的这些方法以及其他方法各具有它们自己的优点和缺点。一些其他的方法利用多种途径，例如向植株递送与雄性组织特异性启动子相关联的编码细胞毒性物质的基因，或递送反义系统，其中对能育性关键的基因得以鉴定并且将该基因的反义基因插入植物中(参见Fabinjanski等人，EPO 89/3010153. 8出版号329，308和以WO 90/08828 公布的 PCT 专利申请 PCT/CA90/00037)。可用于控制雄性不育的另一系统是利用杀配子剂。杀配子剂不是遗传系统，而是局部施用化学物质。这些化学物质影响对雄性能育性关键的细胞。这些化学物质的施用仅在其中施用杀配子剂的生长季节影响植物的能育性(参见Carlson，Glerm R.，美国专利 No. 4，936，904)。杀配子剂的施用、施用的时间选择和基因型特异性通常限制该方法的实用性并且其不是在所有情况下都合适。目前，除了一般考虑哪些杂交种子具有多种抗昆虫性状，或用可赋予抗昆虫性的特定种子处理法来处理外，在杂种产生过程中通常不考虑昆虫抗性治理问题。因此，存在通过开发如下方法来增加效率的潜能所述方法针对合适的昆虫控制性状或性状组合将昆虫抗性治理策略在杂交种子生产过程中实施。发明概述 本发明因此涉及减少抗性害虫发展的方法。本发明进一步涉及一种减少抗性害虫发展的方法，该方法包括操纵种子的生产以便在给定的生产源中具有合适量的一种或多种种子类型，以满足昆虫抗性治理要求。该方法可包括种植亲本品系，所种植的亲本品系的比率足以产生抗害虫植株与非抗害虫植株的期望的比率。作为另一种选择，该方法可包括种植亲本品系，所种植的亲本品系的比率足以产生第一类型的抗害虫植株(具有基于第一杀虫作用模式的抗害虫性)的种子与第二类型的抗害虫植株(具有基于第二杀虫作用模式的抗害虫性)的种子的期望的比率。本发明还涉及减少抗性害虫发展的方法，该方法包括生产第一和第二种子类型并用种子处理剂处理一种或多种所述第一和第二种子类型。此外，本发明还涉及一种减少抗性害虫的发展的方法，该方法包括在包装过程期间将多种种子类型组合进包装物中，其中所组合的种子通过至少一种杀虫作用模式对目标害虫具有抗性，从而使得可将所述组合的种子种植在没有独立的结构化庇护区或具有减少的庇护区的田地中。有关所公开的本发明的其他细节将在如下描述中提供。发明详述在下面的描述中，以广义方式使用到多个术语。提供以下定义以帮助理解本发明。本文所用的冠词“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))所述冠词的在语法上的宾语。举例说，“一种要素”是指一个或多个要素。本文所用的术语“包含”意指“包括但不限于”。“田地”旨在表示其中种植作物的区域，无论其大小如何。本文所用的术语“转基因抗害虫作物”意指源自转化的植物细胞或原生质体的植株或其子代(包括种子)，其中所述植株DNA含有能赋予对一种或多种玉米根虫的抗性的引入的异源DNA分子，该DNA分子原先不存在于同一株系的天然、非转基因植株中。该术语指包含该异源DNA的原始转化株和该转化株的子代。该术语还指通过该转化株和另一包含该异源DNA的品种之间的有性远交产生的子代。还应该理解，还可使两株不同的转基因植株交配而产生含有两个或多个独立分离的、所加入的异源基因的子代。合适子代的自交可产生针对该两个所加入的异源基因而言均是纯合的植株。还设想与亲本植株的回交和与非转基因植株的远交，还有无性繁殖。 有关常用于不同性状和作物的其他育种方法的描述，可在几个参考文献之一中找到，例如 Fehr (1987)，Breeding Methods for Cultivar Development，J. Wilcox (编辑)(American Society of Agronomy, Madison, WI) 0育种方法还可用来将任何天然抗性基因转移到作物中。 本文所用的术语“玉米”意指玉蜀黍或包谷，包括可与玉米交配的所有植物品种， 包括野生玉米物种在内。在一个实施方案中，所公开的方法可用于治理抗害虫玉米的田地中的抗性问题，该田地在玉米种植后系统性地种植玉米(即连作玉米)。在另一个实施方案中，所述方法可用于治理第一年抗害虫玉米的田地中的抗性问题，即该田地在两年轮作周期中第一年种植玉米后跟着种植另一作物(例如大豆)。在本发明上下文中还设想其他的轮作周期，例如其中种植玉米后接着多年种植一种或多种其他作物，以防止在其他滞育期长的害虫中可能随时间推移而发展的抗性。如果作物具有或产生的杀虫剂(例如Bt蛋白)的浓度为杀死99%的易感幼虫所需的杀虫剂浓度的至少约25倍，则认为其具有“高剂量”的杀虫剂。例如，在Bt作物的情形中，Bt栽培种(cultivar)必须产生足够高的毒素浓度来杀死几乎所有的抗性杂合昆虫， 当然，是假定单个基因能赋予对特定Bt蛋白或其他毒素的抗性。目前，如果通过以下五种方法中的至少两种得到验证，那么掺入植物的Bt保护剂通常被视为提供高剂量1)用来自非Bt植物的组织作为对照，用含有Bt植物的冻干组织的人工食物(artificial diet)进行的系列稀释生物测定；2)用经定量ELISA或一些更可靠的技术测定其表达水平比商业栽培种大约低25倍的植株进行的生物测定；3)对田间的大量商业植株进行观测，以确信该栽培种在1^)99.9或以上，以确保95%的杂合体会被杀死(参见Andow & Hutchison 1998) ；4) 与上面的3)相似，但使用具有与大田品系类似的LD5tl值的实验室害虫品系进行控制侵扰； 以及5)测定在比新生幼虫的LD5tl高约25倍的LD5tl下是否可找到被靶向的害虫的较后幼虫龄。如果是这样的话，对于单种Bt作物，可将该较后期幼虫在该Bt作物上进行测试，以确定是否95%或更多的较后期幼虫被杀死。本文所用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义使用，指某生物体或物质(例如蛋白质)的可通过以下方面测量的活性举以非限制性实例，为害虫死亡率、害虫发育的迟缓、害虫体重减轻、害虫排斥性以及害虫在啃食和暴露适当长度时间后出现的其他行为和身体变化。如此，杀虫活性往往影响害虫健康状况的至少一个可测量参数。例如，杀虫剂可以是多肽，以降低或抑制昆虫啃食和/或增加昆虫在摄食多肽后的死亡率。评估杀虫活性的测定法是本领域公知的。参见(例如)美国专利No. 6，570，005和No. 6，339，144。本文所用的术语“杀虫基因”或“杀虫多核苷酸”指编码显示杀虫活性的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“杀虫多肽”、“杀虫蛋白”或“昆虫毒素”旨在表示具有杀虫活性的蛋白质。本文所用的术语“杀虫(的)”是用来指针对害虫(例如CRW)的毒性作用，包括外部供应的杀虫剂和/或作物产生的杀虫剂之一或两者的活性。本文所用的术语“不同的杀虫作用模式”包括一种或多种抗性性状的杀虫作用(不管这些抗性性状是通过转化还是通过传统育种方法引入到作物中)，例如作物产生的杀虫毒素与玉米根虫肠膜中的不同结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)的结合。本文所用的术语“转基因(的)”包括其基因型已因异源核酸的存在而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初这样被改变的转基因植物， 也包括从最初的转基因植物通过有性杂交或无性繁殖产生的转基因植物。本文所用的术语 “转基因(的)”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。一“类型的种子”或“种子类型”旨在表示确定类型的种子，该种子在遗传上不与本文所公开的方法中使用的另一类型的种子相同。一般而言，在本发明的方法中“第一类型的种子”和“第二类型的种子”将是来自相同植物物种但基因型不同的种子。也就是说，“第一类型的种子”将具有与“第二类型的种子”的基因型不同的基因型。例如，第一类型的种子可包含转基因，而第二类型的种子可缺少转基因(或包含不同的转基因)，但其他方面在遗传上与第一类型的种子相同。在其中存在超过两种类型的种子的本发明实施方案中，所述种子 类型中各自将具有与其他类型种子中每一者的基因型不同。尽管本发明的方法不依赖于为来自相同植物物种的种子的类型的每一者，但两种或更多种类型的种子将为相同的植物物种或两种或更多种近缘植物物种，所述近缘植物物种例如是相同目标害虫或害虫的宿主。此外，尽管一种类型的种子将通常由单个基因型构成，但本发明的某些实施方案可涉及由两种或更多种基因型构成的第一类型的种子。在这类实施方案中，各额外的种子类型由一种或多种未在任何其他种子类型中发现的基因型构成。本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、植物原生质体、从中可再生植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块 (plant clump)和在植物或植物部分及它们的后代中完好的植物细胞。转基因植物的部分在本发明的范围内应理解为包括(例如)起源于用本发明的DNA分子转化的转基因植物或其子代并因此至少在部分上由转基因细胞组成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、花粉、胚珠、种子、枝、仁、穗、穗轴、壳皮、秆、茎、果实、叶子、根、根尖、花粉囊等等， 它们也是本发明的目标。谷物旨在表示商业化种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。本文所用的术语“植物细胞”包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物在内。本文所用的术语“产生或增强抗昆虫性”旨在表示已按本发明的方法进行了遗传修饰的植物，相对于除了本文描述的遗传修饰以外具有相似遗传组分的植物来说，具有增加的对一种或多种昆虫害虫的抗性。本发明的经遗传修饰的植物能够表达至少一种杀昆虫脂肪酶和至少一种Bt杀昆虫蛋白，所述杀昆虫脂肪酶和Bt杀昆虫蛋白的组合在影响植物的昆虫害虫的同时能保护植物免受昆虫害虫侵扰。“保护植物免受昆虫害虫侵扰”旨在表示通过(例如)抑制昆虫害虫生长、啃食和/或繁殖的能力或者通过杀死昆虫害虫，来限制或消除昆虫害虫相关的对植物的损害。本文所用的“影响植物的昆虫害虫”包括但不限于制止昆虫害虫进一步啃食植物，通过(例如)抑制昆虫生长、啃食和/或繁殖的能力来伤害昆虫害虫或杀死昆虫害虫。本文所用的术语“杀昆虫脂肪酶”是以其最广义的含义使用，包括但不限于对昆虫具有毒性或抑制作用的脂酰水解酶的家族的任何成员。同样，术语“Bt杀昆虫蛋白”是以其最广义的含义使用，包括但不限于对昆虫具有毒性或抑制作用的苏云金芽孢杆菌蛋白家族的任何成员，如本文描述和本领域公知的Bt毒素，包括例如植物杀昆虫蛋白和δ -内毒素或cry毒素。因此，如本文所述，可通过将编码杀昆虫脂肪酶的核苷酸序列与编码Bt杀昆虫蛋白的序列一起引入到生物体(例如植物或其植物部分)中，或者通过将包括但不限于杀昆虫蛋白在内的杀昆虫物质施用给生物体，来赋予生物体抗昆虫性。本领域技术人员会认识到，并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。实施方案的化合物显示出对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、 森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、風目(Anoplura)、圣目 (Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目和鳞翅目。下表将帮助读者认识昆虫害虫的首字母缩略词。注意，表中列出的是作为转基因害虫抗性策略的目标的最常见害虫，但本发明并不仅限于这些害虫。表1 昆虫害虫
权利要求
1.减少抗性害虫发展的方法，所述方法包括(a)操纵种子的生产以便在给定的生产源中具有合适量的一种或多种种子类型来满足昆虫抗性治理要求，其中所述一种或多种种子类型中的至少一种可通过第一杀虫作用模式杀灭第一目标害虫，和(b)在第一田地中种植所述一种或多种种子类型。
2.权利要求1的方法，其中所述操纵种子的生产包括在种子生产大田中种植一定比率的多个亲本品系，其中所述比率与对所述一种或多种种子类型的抗性治理要求大致相同。
3.权利要求1的方法，其中所述操纵种子的生产包括在包装过程期间将合适量的一种或多种种子类型包装进一个或多个包装物中。
4.权利要求2的方法，其中所述操纵种子的生产包括在所述田地中种植来自一个或多个所述包装物的种子。
5.权利要求1的方法，其中所述第一目标害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、和南部玉米根虫。
6.权利要求5的方法，其中所述第一目标害虫是西部玉米根虫。
7.权利要求1的方法，其中所述第一目标害虫选自欧洲玉米螟、玉米穗虫、和西南玉米螟。
8.权利要求7的方法，其中所述第一目标害虫是欧洲玉米螟。
9.权利要求1的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理所述一种或多种种子类型中的至少一种。
10.权利要求9的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、 杀细菌剂、除草剂、或它们的组合。
11.权利要求1的方法，其中所述一种或多种种子类型中的至少一种掺有除草剂抗性基因。
12.减少抗性害虫发展的方法，所述方法包括(a)确定种子组中存在的杂质的水平，所述种子组包含第一类型的种子和不是所述第一类型的种子，所述第一类型的种子通过第一杀虫作用模式杀灭第一目标害虫，(b)将所述种子组中不是所述第一类型的种子的水平与足以减缓抗性害虫发展的不是所述第一类型的种子的水平相比较，和(c)如有必要，调节不是所述第一类型的种子的水平以使不是所述第一类型的种子的水平为至少大约足以减缓抗性害虫发展的不是所述第一类型的种子的水平。
13.权利要求12的方法，其中所述杂质的水平被确定为不是所述第一类型的种子在所述种子组中的百分比。
14.权利要求12的方法，其中所述第一类型的种子还通过第二杀虫作用模式杀灭所述第一目标害虫。
15.权利要求12的方法，其中调节不是所述第一类型的种子的水平包括将不是所述第一类型的种子添加到所述种子组中。
16.权利要求12的方法，其中调节不是所述第一类型的种子的水平包括将所述第一类型的种子从所述种子组中去除。
17.权利要求12的方法，其中所述第一目标害虫选自西部玉米根虫、北部玉米根虫、墨西哥玉米根虫、和南部玉米根虫。
18.权利要求17的方法，其中所述第一目标害虫是西部玉米根虫。
19.权利要求12的方法，其中所述第一目标害虫选自欧洲玉米螟、玉米穗虫、和西南玉米螟。
20.权利要求19的方法，其中所述第一目标害虫是欧洲玉米螟。
21.权利要求12的方法，所述方法进一步包括用杀虫剂处理所述种子组。
22.权利要求21的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、 杀细菌剂、除草剂、或它们的组合。
23.权利要求12的方法，其中所述第一类型的种子掺有除草剂抗性基因。
全文摘要
本发明描述了用于治理昆虫抗性发展的昆虫庇护区策略。本发明总体上涉及控制通过其啃食活动导致根部损害而对作物造成损害，特别是对玉米植物造成损害的害虫，更具体地讲涉及控制此类植物害虫，其方式是通过在整个种子生产过程中确保足够的庇护区种子存在于给定种子组中来减少抗性害虫发展的速率，从而消除可能产生的与庇护区一致性相关的问题。此外，还公开了在种植所述种子之前用化学杀虫剂或肽相关的杀虫剂处理此类种子。
文档编号A01N63/02GK102317461SQ201080008235
公开日2012年1月11日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者J·L·弗莱克斯纳, L·S·希金斯, P·D·科亚尔德拉克, S·A·莱夫科, T·M·诺瓦茨基 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司