专利名称：小鼠原位左肺移植模型及其构建方法
技术领域：
本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种小鼠原位左肺移植模型及其构建方法。
背景技术：
在动物实验中，小鼠比大鼠有诸多优点，不仅试剂资源丰富、可选品系众多、实验消耗低，而且基因操控性更好，可以方便获得多种转基因和基因敲除品系。相对于其他小鼠肺病模型，例如呼吸机肺损伤、脂多糖吸入损伤，本模型所复制的急性肺损伤、慢性免疫损伤、肺纤维化过程具有起始点明确、背景噪声更易控制等优点。这些优点可满足一些实验设计的特殊要求，使其在肺移植领域以及病理生理学和免疫学等的一些基础研究领域具有更好的应用前景[1-2]。1971年Asimacopoulos等报道了大鼠原位肺移植模型，Mizuta等1989年报道了套管法改良技术，将建模时间由4小时缩短到2小时之内[3-4]。此后，套管法大鼠原位肺移植模型很快取代犬、猪肺移植模型，成为最常用的单肺移植模型。随着基因敲除技术等新技术的成熟，小鼠原位肺移植模型有了现实而迫切的需求。大鼠和小鼠解剖结构相似，但由于体重相差悬殊(250g 300g vs. 25g 30g)，小鼠原位肺移植对显微外科技术的要求更高。美国Washington University的研究者于2007年首次报道了小鼠原位肺移植技术，并于2009年报道了改良方案[5-6]。2009年，瑞士 University Hospital ^irich的研究者报道了类似的模型制作方法[7]。截至2011年4月，仅此两家实验室报道过这项技术。小鼠原位肺移植模型的技术流程与大鼠模型一致，技术关键点在于如何处理比大鼠更为细微的肺门结构。尽管美国和瑞士的研究者都提出了各自的解决方案，但都没有达到“简便、可重复性好”的建模要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、可重复性好、效果优异的小鼠原位左肺移植模型及其构建方法。本发明提供的小鼠原位左肺移植模型有下述方法构建获得。构建方法的具体步骤如下
1、制备套管(CUff)
要求左肺支气管、肺静脉、肺动脉所用套管分别由18/20G、20G、24G血管导管 (angiocatheter)制备；支气管、肺静脉套管体长1. 0mm，肺动脉套管体长0. 5mm ；套管延伸柄长1. Omm,宽度占1/4 1/3管壁周径。操作血管导管用砂纸打磨后，24G导管切成1. 5mm小段，其余型号切成2. Omm小段；将显微血管镊的一个尖头插入小段管腔，以其内侧面为切割平面，用刀片横向和纵向切割，做出套管的延伸柄。2、建立供肺灌洗系统(perfusion system)要求稳定提供与正常肺动脉压相当的灌洗压力。操作依次连接50ml针筒、输液器、22G血管套管，针筒固定于15--25cm高度(例如为20cm)，注入肺保存溶液(例如为30ml)的冰水混合物，并使其充满管路。3、小鼠麻醉、气管内插管与机械通气
要求适度麻醉，经口气管插管，建立机械通气；插管位置恰当，不损伤供肺及所属血管、支气管。操作腹腔注射麻醉。用“两端固定、中间拉开”法快速经口气管插管，小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫塑料板，胸骨上部用左手环指抵住，左手拇指和食指牵拉舌头，暴露声门；右手持20G血管导管接近声门，在其开启瞬间轻轻插入；连接呼吸机输出管路，根据小鼠体重大小提供0. 5 1. 0 ml潮气量，呼吸频率120 140/min。4、供者手术，获取供肺
要求完全灌洗清除供肺血管床内血液，在双肺半充气状态下完整取出心肺块；不损伤供肺及所属血管、支气管。操作建立机械通气后，胸腹正中切口开胸；将100U/0. Iml肝素钠稀释液在供者心尖处注入右心室；左手持显微蚊式钳夹住心脏下1/3左右处、但不上齿，小指勾住供肺灌洗系统的输液器下端、使22G导管尖端恰好抵在右心上；打开输液器控制装置，将喷涌肺保存液的22G导管插入右心室；用眼科剪迅速剪开膨胀的左右心耳、腹腔动静脉，使灌洗液和血液快速流出；两肺数秒钟之后变白，在半充气状态下用显微蚊式钳夹闭气管，自上而下锐性解剖，将心肺块完整取出，生理盐水冲洗后置于铺有纱布的培养皿中，肺保存液制成的冰块恰使纱布浸透。保持灌洗流速和适当的双肺通气幅度、灌洗液流出畅通是保证供肺灌洗质量的三个要素。一旦灌洗初期未能将供肺血管床内的血液冲洗干净，则延长灌洗无益于改善灌洗质量。5、放置套管，准备移植肺
要求切下左肺，保留尽可能长的血管和支气管，并为其分别放置套管；不损伤供肺及所属血管、支气管。操作在手术显微镜下，左肺静脉、动脉、支气管全长游离、在尽可能靠近总干处切断；显微镊两尖并拢穿过肺静脉套管，牵拉肺静脉残端，在另一把显微镊的协助下将套管套上并推向左肺静脉远端，延伸柄指向后肺门；左手显微镊夹住肺静脉，尽可能靠近其远端， 右手用微血管夹把套管柄及肺静脉一并夹住，蚊式钳夹住微血管夹尾部并搁在培养皿边沿上，以稳定微血管夹；将肺静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管的外面，然后用10-0单纤尼龙线固定；用同样方法给肺动脉放置套管，然后心肺块用纱布覆盖后4°c冰箱保存；冷藏期间供肺保持半充气状态、整个气道保持完全封闭状态，以维持供氧、并防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同样方法放置支气管套管。6、受者手术，胸腔内左肺原位移植
要求快速、准确吻合左肺血管及支气管，不损伤供肺及所属血管、支气管。操作受者以同样方法麻醉并建立机械通气，左胸后外侧切口，第3肋间进胸，将受者左肺从切口后部牵出胸腔，在肺血管进入肺实质处用显微蚊式钳夹住，以作牵拉之用； 从肺门前入路，全程游离左肺门血管及支气管，用3-0丝线打活结暂时阻断血管、微血管夹阻断支气管，尽可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管结构在无张力状态下贴近受者肺门；用10-0线环绕肺静脉并预留一个线结，先切开肺静脉远端前壁1/3周径、做横切口，然后纵向切开切口远端的肺静脉前壁，做成“T”形切口 ；切口内注入肝素稀释液，用显微镊将“T”形切口的横切缘牵开、使之呈袋状，用显微镊持住供者肺静脉套管的延伸柄，沿着“T”形切口的纵切口轻轻滑入，将套管结构送入一个合适的位置；在收紧线结之前，血管壁自身弹性可使肺静脉套管保持原位；肺静脉吻合成功后，依次吻合支气管和肺动脉；全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次开放肺静脉、肺动脉和支气管，然后切断肺血管支气管吻合时未剪断的后壁，将移植肺纳入胸腔；清理胸腔内积液及组织碎屑，在深吸气屏气状态下关闭胸腔。注意三个套管结构的相对位置应保持同一水平，以免相互交错而出现套管挤压血管的现象；操作准确、快速，避免误伤，尽可能减少吻合时间(即热缺血时间)。受者苏醒后拔管，允许进食进水。观察期结束后重新麻醉，获取组织标本。与现有方法的比较
小鼠和大鼠的解剖学差异仅在于大小有别，因此二者的手术流程完全一致，小鼠原位左肺移植模型的关键在于如何应对更为严苛的显微外科操作要求。除去基本类似的流程， 小鼠原位移植模型主要有4项关键技术。我们提出的方法显著优于现有方法。(一)经口气管内插管
这项操作虽小，却是整个模型建立过程中第一个关键步骤。我们原先在做通气机肺损伤模型时采用的是蚊式钳压舌法暴露声门，操作繁琐，误伤和失败率较高。插管失误可能导致整个移植手术连贯性的中断，影响移植肺缺血时间的控制。我们改进了经口插管方法，通过“固定两端”(上颚与上段胸骨)、“牵拉中点”(舌头)的方法暴露声门，符合解剖学原理， 所以暴露效果很好。同时，由于要领明确，该操作易于掌握、可重复性高、费时少，单人操作一般能在5 IOs内完成。根据美国Washington University的报道，他们在供者手术中采用经气管造口插管，受者则在手术显微镜下经口插管[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich的报道未写明方法[7]。经气管造口插管一般需要5min方可完成，如果不是他们所用的经口插管法更费事的话，则不会推荐使用气管造口法。(二)供肺灌洗方法
供肺灌洗质量严重影响再灌注损伤程度。供肺灌洗的压力控制，传统上一直沿用流体静压，例如大鼠采用的是20ml灌洗液以20cm H20的压力灌洗[8]。瑞士 University Hospital ^lrich采用“2ml灌洗液、IOcm H20压力”，应该也是承接这种理念[7]。但是，灌洗时起作用的是流体动压，而非流体静压。小鼠心输出量大致在22 32ml/min [9]，故我们选择 BD 公司标准流速为 ^ml/min 的 22G 导管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd., China)作为灌注管。我们用心输出量来取代流体静压作为关系压力控制的标尺，理论基础更合理。在操作上，我们的方法也更加简便、效果更好。我们的方法是，在直视下将22G导管插入小鼠右心室，操作简单，且因流速恒定而灌洗效果稳定。瑞士 University Hospital ^lrich所采用的方法是，在肺动脉根部做横切口，然后经该切口灌洗[7]。除操作复杂外， 该方法存在效果不稳定的可能。水柱高度确定只能保证静水压恒定，灌洗压力还受到管路长度、走向和灌洗导管口径等因素的影响。灌洗压力过大、易损伤肺血管床，过小则影响灌洗效果。美国Washington University所采用的方法是，用3ml注射器经27G针头直接将 3ml肺保存液推注到心脏中[5-6]。这种方法很简单，但即使同一人操作，也无法保持推注压力的大小与恒定，这可能是文献所示照片中肺灌洗质量差强人意的原因。至于全身肝素化，我们的方法是在心尖部直接注射到右心室中，随后用显微蚊式钳夹住心脏下1/3，肝素化效果快速、直接，注射处也不会有很多出血。而文献中所提的下腔静脉内注射、肝叶内注射、甚至阴茎血管内注射，操作都要复杂得多，全身肝素化效果也不及心内注射好[5-7，10]。(三)套管放置
美国Washington University所采用的方法是，用血管夹先将套管延伸柄夹住，然后固定在自制的架子上；调整支架，使套管悬在血管上方3mm处，然后把血管塞进套管中，从上端拉出[5-6]。瑞士 University Hospital ^lrich未详细说明其操作方法。我们曾试用上述方法，发现两个问题。首先，套管悬空高度很难调整。如果太低，影响下一步操作；如果太高，则在卷折血管袖时张力很大，不易成功。其次，如果先用血管夹夹住套管柄，则套管管腔常被遮挡，影响显微镊操作。因此，我们改变方案，套管先放置、后固定，其优点在于①操作简单，操作时只要尽可能将套管推向外周端即可，不必精确调整相对距离；②成功率高，由于血管和套管柄被夹在一起，所以袖套卷折时血管的张力几乎没有，基本能一次成功。(四)吻合术的手术入路与吻合口制作
文献采用的手术入路是，将受者左肺拉向切口前方，供肺放在受者自体肺上，从肺门后方进行吻合操作[5-6]。由于自体肺通常拉到胸腔外，置于其上的供肺通常距纵膈更远，吻合张力较大，所以文献建议供者套管结构插入受者血管/支气管之后，先用血管夹夹住受者血管/支气管和套管柄，再用结扎线固定。但在有张力情况下，将供者套管结构插入受者结构本身就有难度，而且在上血管夹之前供者套管结构常常因弹性回缩力而自行跳出。有鉴于此，我们改后入路为前入路，把移植肺放入下胸腔，这样使供受者肺门结构紧密接触， 吻合时几乎没有张力。吻合术的另一个关键是吻合口制作，切口太小不易插入供者套管结构，而太大则不宜维持吻合口的张开状态。美国Washington University所采用的方法是，先在受者血管或支气管上剪开一个小口，然后用显微镊轻柔扩张W]。这是一个模糊的描述，可操作性差，小切口往往在不希望的地方扩大，结果往往靠运气。有鉴于此，我们将横切口长度限定在1/3周径，以保证吻合口的张开度；然后将横切口远端纵行剪开，形成一个“T”形切口，确保入口直径足够大。由于事先选定了切口延伸的方向，插入套管结构时一般不会造成意外方向的撕裂。“T”形切口使吻合口的口径和张开度都能最大化，效果优于单纯的横切口。通过降低吻合张力和改良吻合口形态，吻合操作更容易。而且，如果操作顺利，则每例实验所需时间差异不大，人为因素造成的个体差异可降至最低。综上所述，我们创立的方法具有操作方法简单、确切、合理等优点，比现有方法更容易掌握、操作，受个人因素的影响也很低，更加接近动物模型“操作简单、可重复性好”的理想状态。本发明作为一种研究工具，可复制急性肺损伤、慢性免疫损伤、肺纤维化等疾病过程，主要用于肺移植领域，也可用于免疫学、病理生理学等学科中涉及肺泡与肺血管的一些领域。
具体实施例方式(一)设备仪器
1、手术显微镜1台，放大倍数5 45X
2、啮齿类动物呼吸机1台
3、普通手术器械手术无影灯，眼科剪1把，弯头眼科镊2把。4、显微外科手术器械显微蚊式钳(直)2把，显微蚊式钳(弯)1把；尖头直径
0.05mm 的显微剪(Vannas spring scissors)l 把；头宽 0. Imm 的显微摄(micro forceps) 2把；头宽0. 3mm的显微结扎镊(suture tying forceps) 2把
5、耗材
微血管夹(颚长5mm、夹宽0. 75mm)，动脉血管夹(颚长15mm)；
10-0单纤尼龙线，3-0编织丝线；
Iml注射器，20ml注射器，50ml注射器，输液器，输液架；
18G,20G,22G,24G 血管导管(Angiocatheter)；
培养皿，纱布，橡皮筋，泡沫塑料板，刀片；
肺保存液，生理盐水，肝素钠。(二)实验动物
根据实验设计，选择小鼠品系。一般情况下，小鼠在清洁级环境中饲养。除非特别要求， 术前正常供给食水。小鼠体重一般应> 25g，供、受者体重大致相当。小鼠的饲养、使用遵守《实验动物管理条例》，保护实验动物权益。实验中，供受者采用8周龄雄性ICR小鼠(体重约30 32g)，购自上海史莱克公司，饲养于清洁级环境中。制备支气管、肺静脉、肺动脉套管的材料分别选用BD公司的18G、 20G和 24G血管导管(BD Angio, Becton Dickinson Medical Devices Co Ltd. , China)。皆用腹腔注射戊巴比妥钠(0. 2 mg/kg)麻醉，经口气管内插管(20G)，连接小鼠呼吸机(Model 683 Harvard Rodent Ventilator, Harvard Apparatus, South Natick, MA), Bf ^ ^ 潮气量1.0 ml、呼吸频率120/min。肺保存液采用低价右旋糖酐液(Perfadex solution, Vitrolife, Sweden)。(三)操作方法 1、制备套管
要点支气管、肺静脉、肺动脉所用套管分别由18/20G、20G、24G血管导管制备。支气管、肺静脉套管体长1. 0mm，肺动脉套管体长0. 5mm。套管延伸柄长1. 0mm，约占1/3周径。 套管表面打磨粗糙(必要时可加浅切痕)、以增加摩擦力，套管边缘切割整齐、以防尖端刺破
血管壁。血管套管用砂纸打磨后，24G导管切成1. 5mm小段、其余型号导管切成2. Omm小段。将显微血管镊的一个尖头插入导管小段的管腔中，内表面朝上、尖端露出。在距离远端
1.Omm处横切，直到刀片碰到显微血管镊分枝的内表面。刀片抵在显微血管镊分枝的尖端， 紧贴其内表面，纵向切割，直至横切口处。2、建立供肺灌注系统
要点提供稳定的、压力与正常肺动脉压相当的肺循环灌流。
拔去50ml针筒的内芯，置于高度约20-30cm的输液架上。剪去输液器的金属针头， 与50ml针筒对接，另一头接驳22G血管套管。在50ml针筒内注入30ml肺保存溶液，并添加由肺保存溶液制备的冰块1块。打开输液器阀门排气，使管路内充满溶液。3、小鼠麻醉与机械通气
要点适度麻醉，不损伤口腔组织条件下快速经口气管内插管，维持稳定人工机械通气。小鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(0. 2 mg/kg)麻醉。泡沫塑料板(2X IOX 15cm) —端箍上橡皮筋，将小鼠置于其上，橡皮筋拉起后勒住小鼠上颚。竖起泡沫塑料板，将无影灯灯光从前上方投射至其颈部。术者左手环指抵住小鼠胸骨上段，与橡皮筋固定的上颚形成两个固定点，然后用左手拇指和食指捏住小鼠舌头轻拉，暴露咽喉部。此时可见声门随呼吸做 “关闭-张开”运动，右手持20G血管导管(无针芯)，缓慢接近声门，在其开启瞬间轻轻插入。 连接呼吸机输出管路，根据小鼠体重大小提供0. 5 1. 0 ml潮气量，呼吸频率120 140/
mirio4、供者手术(获取供肺)
要点供肺彻底灌洗、血管床无血液残留，供肺及所属血管、支气管无损伤。建立机械通气后，供者小鼠取仰卧位，从剑突下开始做胸腹正中联合切口，用2把显微蚊式钳(直)分别钳夹胸骨两边，起到止血和协助暴露的作用。用动脉血管夹拉起胸腺， 暴露右心室流出道及主动脉起始部。用Iml针筒将100U/0. Iml肝素钠稀释液在心尖处注入右心室。左手用1把显微蚊式钳(弯)夹住心脏下1/3处、但不上齿，左手小指勾住供肺灌注系统的输液器下端，并使22G血管导管的尖端恰好抵在右心上。打开输液器控制装置，迅速将喷涌肺保存液的22G血管导管插入右心室。此时可见左右心耳立即膨胀。轻轻抬起左手，使左右心耳暴露更好，然后用眼科剪迅速剪开左右心耳、剪断腹腔动静脉。灌洗液和残留血液快速流出，两肺数秒钟之后变白。在充气状态下用显微蚊式钳(弯)夹闭气管，自上而下剪开，将心肺块整块取出，生理盐水冲洗后放置在铺有纱布的培养皿内。纱布浸透肺保存液，并放置肺保存液制成的冰块以保持低温。保持灌洗流速和适当的双肺通气幅度、灌洗液流出畅通是保证供肺灌洗质量的三个要素。一旦灌洗初期未能将供肺血管床内的血液冲洗干净，则延长灌洗无益于改善灌洗质量。5、放置套管(移植肺准备)
要点套管位置恰当，不损伤供肺及所属血管、支气管。在5 45X手术显微镜下，解剖左肺门，全长游离左肺静脉、动脉、支气管。必须清除这些结构上附着的脂肪与结缔组织，否则线结容易滑脱。在左肺静脉与左心房、左肺动脉与肺动脉干交界处切断，保留尽可能长的血管用于放置套管。显微镊先穿过肺静脉套管， 再提住肺静脉残端，在另一把显微镊的协助下将套管套在左肺静脉上，套管的延伸柄指向后肺门。左手所持显微镊夹住尽可能长的肺静脉残端，右手持弯头眼科镊、把微血管夹夹在套管的延伸柄及肺静脉上。1把显微蚊式钳(弯)夹住微血管夹尾部，搁在培养皿边沿上，通过自身重力使微血管夹相对固定。用2把显微镊交替，将肺静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管的外面，然后用10-0单纤尼龙线固定。返折后的肺静脉残端必须超越结扎线固定的位置，否则吻合之后漏血。用同样方法给肺动脉放置套管，然后心肺块用纱布覆盖后4°C冰箱保存。冷藏期间供肺保持半充气状态、整个气道保持完全封闭状态，以维持供氧，并防止保存液流入供肺。在移植操作前，放置支气管套管。6、受者手术(三套管法左单肺移植)
要点准确、快速操作，避免误伤，尽可能减少吻合时间(即热缺血时间)。建立机械通气后，受者小鼠取右侧卧位，左后外侧开胸切口，经第3肋间进胸。切口上下缘肋骨各缝1根3-0丝线，用于牵开切口。将受者左肺从切口后部牵出胸腔，在肺血管进入肺实质处用纤维蚊式钳(弯)夹住，从肺门前入路，全程游离左肺门血管及支气管。用 3-0丝线套在肺静脉、肺动脉基底部，打一滑结并收紧，暂时阻断血管。用微血管夹在尽可能靠近隆突处夹住左肺支气管。把移植肺放入下胸腔内，使供肺肺门套管结构在无张力状态下贴近受者肺门。用10-0线环绕肺静脉并预留一个线结，先切开肺静脉远端前壁1/3周径、做横切口，然后纵向切开切口远端的肺静脉前壁，做成“T”形切口。切口内注入肝素稀释液，左手持1把显微镊将“T”形切口的横切缘轻轻牵开、使之呈袋状，右手显微镊持住供者肺静脉套管的延伸柄，沿着“T”形切口的纵切口轻轻滑入，将套管结构送入一个合适的位置。在收紧线结之前，血管壁自身弹性可使肺静脉套管保持原位。肺静脉吻合成功后，依次吻合支气管和肺动脉。不同的一点是，吻合支气管时不注射肝素，而是清理其中的积液与组织碎屑。注意三个套管结构的相对位置应保持同一水平，以免相互交错而出现套管挤压血管的现象。全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次开放肺静脉、肺动脉和支气管，然后切断肺血管支气管吻合时未剪断的后壁，将移植肺纳入胸腔。清理胸腔内积液及组织碎屑，在深吸气屏气状态下关闭胸腔。受者苏醒后拔管，允许进食进水。观察期结束后重新麻醉，获取组织标本。参考文献,Gelman AE, Okazaki M, Lai J, Kornfeld CG, Kreisel FH, et al. CD4+ T lymphocytes are not necessary for the acute rejection of vascularized mouse lung transplants. J Immunol. 2008 Apr 1;180(7):4754-62. PMID: 18354199.Kreisel D, Sugimoto S, Tietjens J, Zhu J, Yamamoto S, et al. Bcl3 prevents acute inflammatory lung injury in mice by restraining emergency granulopoiesis. J Clin Invest. 2011 Jan 4;121(1):265-76. PMID: 21157041.Asimacopoulos PJ, Molokhia FA, Pegg CA, Norman JC. Lung transplantation in the rat. Transplant Proc. 1971 Mar;3(1):583-5. PMID: 4937944.MizutaT, Kawaguchi A, Nakahara K, Kawashima Y. Simplified rat lung transplantation using a cuff technique. J Thorac Cardiovasc Surg 1989; 97 (4) :578 - 81..Okazaki M, Krupnick AS, Kornfeld CG, Lai JM, Ritter JH, et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 2007 Jun；7(6):1672-9..Krupnick AS, Lin X, Li W, Okazaki M, Lai J, et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 2009;4(1):86-93. PMID: 19131960.Jungraithmayr WM, Korom S, Hillinger S, Weder W. A mouse model oforthotopic, single-lung transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 2009 Feb; 137(2) :486-91..Sugimoto Rj Nakao A，Nagahiro I，Kohmoto J，Sugimoto S，Okazaki M， Yamane M，Inokawa H，Oto T，Tahara K，Zhan J，Sano Y，McCurry KR. Experimental orthotopic lung transplantation model in rats with cold storage. Surg Today. 2009;39 (7):641-5. PMID: 19562458..Zanotti-CavazzoniSLj Guglielmi M， Parrillo JEj Walker T， Dellinger RPj Hollenberg SM. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 2009 Apr; 35 (4) :748-54.
Li W, Sugimoto S，Lai J，Patterson GAj Gelman AEj Krupnick AS, Kreisel D. Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Jun;139(6):1637-43. PMID: 20219214 。
权利要求
1. 一种小鼠原位左肺移植模型构建方法，其特征在于具体步骤如下(1)、制备套管左肺支气管、肺静脉、肺动脉所用套管分别由18/20G、20G、24G血管导管制备；支气管、 肺静脉套管体长1. 0mm，肺动脉套管体长0. 5mm ；套管延伸柄长1. Omm,宽度占1/4 1/3管壁周径；具体操作是血管导管用砂纸打磨后，24G导管切成1. 5mm小段，其余型号切成2. Omm 小段；将显微血管镊的一个尖头插入小段管腔，以其内侧面为切割平面，用刀片横向和纵向切割，做出套管的延伸柄；(2)、建立供肺灌洗系统稳定提供与正常肺动脉压相当的灌洗压力；具体操作是依次连接50ml针筒、输液器、22G血管套管，针筒固定于15--25cm高度， 注入肺保存溶液的冰水混合物，并使其充满管路；(3)、小鼠麻醉、气管内插管与机械通气适度麻醉，用“两端固定、中间拉开”法快速经口气管插管，建立机械通气；具体操作是腹腔注射麻醉；小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫塑料板，胸骨上部用左手环指抵住，左手拇指和食指牵拉舌头，暴露声门；右手持20G血管导管接近声门，在其开启瞬间轻轻插入；连接呼吸机输出管路，根据小鼠体重大小提供0.5 1.0 ml潮气量，呼吸频率 120 140/min ；(4)、供者手术，获取供肺采用独特的供肺灌洗系统，借助简单操作完全清除供肺血管床内血液；具体操作是建立机械通气后，胸腹正中切口开胸；将100U/0. Iml肝素钠稀释液在供者心尖处注入右心室；左手持显微蚊式钳夹住心脏下1/3处、但不上齿，小指勾住供肺灌洗系统的输液器下端、使22G导管尖端恰好抵在右心上；打开输液器控制装置，将喷涌肺保存液的22G导管插入右心室；用眼科剪迅速剪开膨胀的左右心耳、腹腔动静脉，使灌洗液和血液快速流出；两肺数秒钟之后变白，在半充气状态下用显微蚊式钳夹闭气管，自上而下锐性解剖，将心肺块完整取出，生理盐水冲洗后置于铺有纱布的培养皿中，肺保存液制成的冰块恰使纱布浸透；(5)、放置套管，准备移植肺游离、切断血管和支气管，用“先套管、后固定”法为其分别放置套管；具体操作是在手术显微镜下，左肺静脉、动脉、支气管全长游离、在尽可能靠近总干处切断；显微镊两尖并拢穿过肺静脉套管，牵拉肺静脉残端，在另一把显微镊的协助下将套管套上并推向左肺静脉远端，延伸柄指向后肺门；左手显微镊夹住肺静脉，尽可能靠近其远端，右手用微血管夹把套管柄及肺静脉一并夹住，蚊式钳夹住微血管夹尾部并搁在培养皿边沿上，以稳定微血管夹；将肺静脉残端像卷袖口那样翻转，套在套管的外面，然后用10-0 单纤尼龙线固定；用同样方法给肺动脉放置套管，然后心肺块用纱布覆盖后4°C冰箱保存； 冷藏期间供肺保持半充气状态、整个气道保持完全封闭状态，以维持供氧、并防止保存液流入供肺；在吻合操作前，同样方法放置支气管套管；(6 )、受者手术，胸腔内左肺原位移植采用吻合张力最低的前肺门入路、吻合口的口径和张开度俱佳的“T”形吻合口，依次吻合左肺静脉、动脉和支气管；具体操作是受者以同样方法麻醉并建立机械通气，左胸后外侧切口，第3肋间进胸， 将受者左肺从切口后部牵出胸腔，在肺血管进入肺实质处用显微蚊式钳夹住，以作牵拉之用；从肺门前入路，全程游离左肺门血管及支气管，用3-0丝线打活结暂时阻断血管、微血管夹阻断支气管，尽可能靠近根部；移植肺放入下胸腔，使供肺套管结构在无张力状态下贴近受者肺门；用10-0线环绕肺静脉并预留一个线结，先切开肺静脉远端前壁1/3周径、做横切口，然后纵向切开切口远端的肺静脉前壁，做成“T”形切口 ；切口内注入肝素稀释液，用显微镊将“T”形切口的横切缘牵开、使之呈袋状，用显微镊持住供者肺静脉套管的延伸柄， 沿着“T”形切口的纵切口轻轻滑入，将套管结构送入一个合适的位置；在收紧线结之前，血管壁自身弹性可使肺静脉套管保持原位；肺静脉吻合成功后，依次吻合支气管和肺动脉； 全部吻合成功后，剪掉套管延伸柄，依次开放肺静脉、肺动脉和支气管，然后切断肺血管支气管吻合时未剪断的后壁，将移植肺纳入胸腔；清理胸腔内积液及组织碎屑，在深吸气屏气状态下关闭胸腔。
2. 一种由权利要求所述方法构建的小鼠原位左肺移植模型。
全文摘要
本发明属于医学动物模型技术领域，具体为一种小鼠原位左肺移植模型及其构建方法。作为一种研究工具，该模型复制急性肺损伤、慢性免疫损伤、肺纤维化等疾病过程，主要用于肺移植领域，也可用于免疫学、病理生理学等学科中的一些领域。该模型的构建步骤包括制备套管；建立供肺灌注系统；小鼠麻醉、气管内插管与机械通气；供者手术，获取供肺；供肺放置套管；受者手术，胸腔内左肺原位移植。本发明在建立供肺灌洗系统，在小鼠气管内插管、供肺灌洗、放置套管、套管法吻合肺血管支气管等方面均进行重要改进。实践表明，本发明比现有方法更容易掌握、操作，受个人因素的影响也更低，更接近动物模型“操作简单、可重复性好”的理想状态。
文档编号A61D1/00GK102247219SQ201110104989
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者王兴安, 白春学, 高文 申请人:同济大学附属上海市肺科医院