专利名称：一种花生组培苗的无菌嫁接方法
技术领域：
本发明涉及花生育种领域，具体涉及一种花生组培苗的无菌嫁接方法。
背景技术：
花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和质量。尽管育种家们试图培育抗逆品种，但由于花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗病品种的选育一直是一个难以解决的问题。随着生物技术的发展，利用转基因技术及离体诱变技术来改进花生栽培种受到研究者的广泛重视。而遗传转化及离体诱变的成功与否依赖于花生组织培养高效植株再生体系的建立。研究者们通过器官发生和胚胎发生途径，建立了花生高效植株再生体系，但是通过转基因和突变体筛选等技术得到的具有优良性状的花生再生苗，由于生长势较弱，并且再生及生长周期长，其生根率低，即使能生根其移栽成活率也较低，并不能保证以高成活率移栽，这就严重影响了花生遗传转化及离体诱变育种工作的顺利进行。目前关于花生嫁接技术的研究仅有极少数报道，有研究采用14d苗龄的花生幼苗作砧木，组培苗经驯化2 3天后作接穗，进行常规嫁接(非无菌嫁接)，最终得到果针。另有报道，研究了花生常规嫁接(非无菌嫁接)及无菌嫁接方法，无菌嫁接，用无菌萌发12 15天苗龄的花生幼苗作砧木，组培苗长到2 3cm作接穗进行无菌嫁接。但在以上研究中， 嫁接切口均是在砧木子叶节以上的上胚轴。嫁接切口在上胚轴，由于有两片子叶，嫁接操作麻烦；移栽田间后，砧木子叶腋芽会长出第一对侧芽，由于此处具有分化原基，去除侧芽后还会不断再长，因此需经常去侧芽，增加了工作量，并且还会影响接穗的生长和结果。而且，由于现有花生嫁接技术的嫁接切口为上胚轴，而上胚轴较细，对于茎未伸长的再生小苗无法作为接穗进行嫁接(因为苗较小时，节间未拉长，比较粗)，小苗需长到2 3cm，节间拉长后才能用于嫁接，从而限制了其应用范围。
发明内容
针对上述现有花生嫁接技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种花生组培苗的无菌嫁接方法，嫁接技术是解决花生组培苗不易生根和移栽成活率低的有效手段。本发明利用无菌嫁接技术，以花生转基因苗或诱变定向筛选的抗性苗作为接穗，以无菌萌发的实生苗为砧木，砧木嫁接切口在实生苗子叶节以下的下胚轴，本发明克服转基因苗及离体诱变定向筛选的抗性苗生根及移栽难的障碍，省去诱导生根的步骤，缩短再生及生长周期。为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现 一种花生组培苗的无菌嫁接方法，它包括以下步骤
(1)选取饱满的花生种子，对其进行表面消毒和漂洗后，浸泡12 16h，切去子叶1/3 后置于固体培养基上培养，选下胚轴伸长至0. 8cm-2. Ocm的的花生幼苗为砧木，以花生组培苗为接穗；(2)切去砧木的子叶及其以上部分，将下胚轴中间纵切成切口，接穗下端削出与所述切口对应的V形伤口，将接穗下端插于切口中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，用封口膜包敷嫁接口，形成嫁接苗；
(3)将嫁接苗置于固体培养基中无菌培养3 4d使接口愈合；
(4)取出嫁接苗，洗净培养基后移栽于育苗基质中，在驯化室驯化3周；
(5)将所述嫁接苗移于户外炼苗3 5d，然后移栽到田间进行田间日常管理。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(1)中在表面消毒前还采用75%的酒精浸泡15 2 对花生种子杀菌。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(1)采用0. 1%的升汞浸泡20min 30min对花生种子进行表面消毒。对上述技术方案的进一步改进所述花生组培苗为转基因苗或离体诱变苗。对上述技术方案的进一步改进所述下胚轴切口的深度为0. 4 0. 6cm。对上述技术方案的进一步改进所述接穗下端V形伤口的两斜面长度为0. 2 0. 4cm。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(3)中培养条件为温度M ^rc、光照强度为2500 3000LX、每日光照10 15h。对上述技术方案的进一步改进所述步骤中育苗基质由包括蛭石、草炭土和珍珠岩。对上述技术方案的进一步改进所述步骤中第1周保持空气湿度80 90%， 光照强度1500 3000Lx，然后逐渐降低空气湿度至30% 40%，增加光照强度至3000 4000Lx。对上述技术方案的进一步改进所述步骤( 中移栽田间后，开始前2周用遮阴网
ο与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
1、本发明所述无菌嫁接方法中的砧木嫁接切口在子叶节以下的下胚轴，在嫁接前先将子叶及其以上部分都去掉，本发明技术方案使得嫁接时操作简单，而且由于去掉了子叶节， 第一对侧枝的分化原基也被去掉，能够生长的部分只有接穗，这样省去了移栽田间后需经常去除侧芽的麻烦，并且使营养充分供给接穗。2、由于本发明所述无菌嫁接方法中的砧木嫁接切口为比较粗的下胚轴，组培小苗不到Icm即可用于嫁接，因为转基因小苗及离体诱变定向筛选的小苗生长比较缓慢，较小的瓶苗能用于嫁接非常有利。3、本发明花生嫁接技术，利用无菌嫁接，嫁接苗无菌培养3 4d再进行移栽。由于培养瓶中湿度较大，又是无菌条件，可以促进嫁接伤口愈合，并防止杂菌的浸染。移栽后继续保持空气湿度在80% 90%，保证嫁接苗不易失水。嫁接苗在培养瓶培养3d后成活率达100%，移栽驯化室驯化3周后成活率达93%以上。花生转基因苗及离体诱变苗经嫁接后， 生长较快。
具体实施例方式实施例1本发明所述的花生组培苗的无菌嫁接方法包括如下步骤 (1)花生砧木材料的准备用固体MS培养基作花生种子萌发培养基进行无菌培养，将花生品种花育23号种子在培养基上培养，以萌发IOd龄的幼苗作砧木，固体培养基上培养的砧木种子生根质量好，与脱脂棉液体培养基相比，在嫁接操作及移栽时不易伤根。(2)花生接穗的准备以花生品种花育22号转化几丁质酶基因获得的转基因阳性苗作为嫁接接穗。
(3)嫁接及驯化，包括以下步骤
a嫁接砧木将花生品种花育23号种子用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 1%的升汞浸泡20min进行表面消毒，用无菌水漂洗5遍后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12 16h。将子叶切去1/3后，置于固体MS培养基上培养，使种子萌发。培养约10d，下胚轴伸长至0. 8cm以上，用作嫁接砧木。b嫁接当转基因阳性小苗长到Icm时即可用于嫁接。当砧木种子下胚轴伸长至 0. 8cm以上时切去子叶及其以上部分，将下胚轴中间纵切成0. 4 0. 6cm的切口 ；接穗下端削出两面约为0. 3 0. 4cm的V形伤口，如果再生苗较小时，接穗切口可缩短至0. 2cm。将接穗插于切口的中间，使砧木和接穗的形成层紧密接触。然后用封口膜包敷接口，避免失水，也能使接口紧密接触，促进愈合。c嫁接苗无菌培养将嫁接苗置于新的MS固体培养基中无菌培养3 4d，由于培养瓶中湿度较大，又是无菌条件，可以促进嫁接伤口愈合，并防止杂菌的浸染。此时统计嫁接苗成活率达100%。培养条件为温度M ^°C、光照强度为2500 3000Lx、每日光照10 15h。d移栽及管理无菌培养后，将嫁接苗从培养瓶中取出，将根部培养基清洗干净， 移栽于灭菌的育苗基质中，育苗基质由蛭石、草炭土和珍珠岩组成，育苗基质的草炭土、珍珠岩、蛭石的比例一般是1:1:1，育苗基质保水性能好，并且能供给嫁接苗营养成分，然后移于驯化室，开始1周保持空气湿度80 90%，光照强度1500 3000LX，然后逐渐降低空气湿度至30% 40%，增加光照强度至3000 4000Lx。3周后统计嫁接苗成活结果于表1。表1 花育22号转基因阳性苗嫁接移栽成活率
权利要求
1.一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于，包括以下步骤(1)选取饱满的花生种子，对其进行表面消毒和漂洗后，浸泡12 16h，切去子叶1/3 后置于固体培养基上培养，选下胚轴伸长至0. 8cm-2. Ocm的的花生幼苗为砧木，以花生组培苗为接穗；(2)切去砧木的子叶及其以上部分，将下胚轴中间纵切成切口，接穗下端削出与所述切口对应的V形伤口，将接穗下端插于切口中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，用封口膜包敷嫁接口，形成嫁接苗；(3)将嫁接苗置于固体培养基中无菌培养3 4d使接口愈合；(4)取出嫁接苗，洗净培养基后移栽于育苗基质中，在驯化室驯化3周；(5)将所述嫁接苗移于户外炼苗3 5d，然后移栽到田间进行田间日常管理。
2.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(1) 中在表面消毒前还采用75%的酒精浸泡15 25s对花生种子杀菌。
3.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(1) 采用0. 1%的升汞浸泡20min-30min对花生种子进行表面消毒。
4.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述花生组培苗为转基因苗或离体诱变苗。
5.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述下胚轴切口的深度为0. 4 0. 6cm。
6.根据权利要求5所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述接穗下端 V形伤口的两斜面长度为0. 2 0. 4cm0
7.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(3) 中培养条件为温度24 ^°C、光照强度为2500 3000Lx、每日光照10 15h。
8.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(4) 中育苗基质包括蛭石、草炭土和珍珠岩。
9.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(4) 中第1周保持空气湿度80 90%，光照强度1500 3000Lx，然后逐渐降低空气湿度至 30% 40%，增加光照强度至3000 4000Lx。
10.根据权利要求1所述的一种花生组培苗的无菌嫁接方法，其特征在于所述步骤(5) 中移栽田间后，开始前2周用遮阴网遮盖。
全文摘要
本发明提供了一种花生组培苗的无菌嫁接方法，以无菌发芽的花生幼苗作为砧木,切去子叶及其以上部分，将下胚轴中间纵切成切口，以花生组培苗为接穗，将接穗下端削出两斜面长度为0.2～0.4cm的V形伤口；将接穗插于切口的中间，使砧木和接穗的形成层紧密接触；嫁接口用封口膜包敷，避免失水，促进愈合；将嫁接苗置于固体培养基中无菌培养3～4天；然后移栽于灭菌的育苗基质中于驯化室进行驯化，后移栽到田间，按田间种植方式管理。本发明砧木嫁接切口在子叶以下的下胚轴，嫁接操作简单，省去了移栽田间后需经常去除砧木上侧芽的麻烦，并且使营养充分供给接穗；而且组培小苗不到1cm即可用于嫁接，应用范围广泛；还可以促进嫁接伤口愈合，并防止杂菌的浸染。
文档编号A01G1/06GK102388801SQ20111021154
公开日2012年3月28日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者乔利仙, 于新玲, 刘强, 王晶珊, 郝世俊, 隋炯明 申请人:青岛农业大学