专利名称：一种丹参毛状根合成丹参酮ⅱa的技术的制作方法
技术领域：
本发明属于农杆菌转化药用植物技术领域，具体的，涉及农杆菌转化野生丹参并采用6-苄氨基嘌呤诱导合成丹参酮II A的技术。
背景技术：
野生丹参由于有效成分不稳定，且生产周期长，不能满足市场的需求。由发根农杆菌感染野生植物丹参形成的丹参毛状根系统，生产速度较快，遗传性稳定，是生产丹参有效成分的良好培养系统。目前，诱导毛根产生丹参酮II A的诱导子主要有酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌诱导子、茉莉酸甲酯等生物诱导子及Ag +、C+和α —氨基异丁酸等非生物诱导子。真菌诱导子、寡半乳糖醛酸及酵母提取物等生物诱导子诱导效率虽高，其质量控制也较为复杂，需通过测定其中糖的质量浓度即蒽酮比色法来判断其浓度，而寡半乳糖醛酸多需自己制备，不方便易得。此外，生物诱导子需经高压灭菌后4°C保存，保存期不可超过 30d，又增加了诱导子的保存成本。茉莉酸甲酯、Ag +、Co+和α —氨基异丁酸等不常见，且成本远超出6 — BA (6-苄氨基嘌呤)等常用植物激素。6-苄氨基嘌呤是一种细胞分裂素，属广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，能诱导芽的分化，促进侧芽生长，促进细胞分裂，具有抑制衰老、保绿作用。本发明将其加入毛状根培养用培养基中，不仅促进毛状根生长，同时通过本发明对环境条件的调节，由其诱导后对有效成分丹参酮II A的合成也具有促进作用。有的毛状根成分诱导需维持环境温度在25°C左右，在北方的冬季和南方的夏季存在着能耗过高的问题。而本发明环境温度控制在8-23°C，降低了能耗。此外，目前已建立起来的丹参毛状根培养系统存在着成本、技术以及环境条件要求过高的问题，都不利于培养的进一步放大和工业化生产。
发明内容
本发明首先以购自中国农业大学的发根农杆菌A4菌株感染野生植物丹参获得毛状根系统，然后以MS培养基为基础培养基，通过在其中添加6-苄氨基嘌呤，并调节诱导过程的环境温度实现诱导毛状根促进丹参酮II A的合成。MS培养基基本配方(1L)为
大量元素(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl. 2H20440MgSO4. 7H20370KH2PO4170微量元素(mg/L)KI0.83
H3BO36. 2
MnSO4. 4H2022. 3
ZnSO4. 7H208. 6
Na2MoO4. 2H200. 25
CuSO4. 5H200. 025
CoCl2. 6H200. 025
FeSO4. 7H2027. 8
EDTANa2. 2H2037. 3
有机物(mg/L)
肌醇100
盐酸吡哆醇0. 5
盐酸硫胺素0. 5
甘氨酸2
烟酸0.5
在丹参酮:A诱导试验时，向MS培养基中添加6 — BA (6-苄氨基嘌呤)至终浓度为 1. 5 - 2. 5mg/L,分装于体积200mL的标准组培瓶中，每瓶装量20mL。在15psi (约1. 05kg/ cm2)高压灭菌20min后冷却至室温，备用。一、丹参毛状根的培养
将发根农杆菌ATCC 15834菌种用无菌水稀释后，均勻涂布于LB固体培养基上，培养 3-4天，待长出菌斑后，挑取单菌落活化3次，再挑取单菌落于YEB液体培养基中^°C，200 r/min震荡黑暗培养2_3天(使菌细胞处于对数生长期，0D600=0. 6-0. 8)，取适量菌液于 5000rpm离心5min，弃去上清，沉淀用V2MS-N液体培养基重悬至0D600=0. 2-0. 4，即可用于丹参毛状根的侵染实验。将丹参无菌苗叶片切成0.5 cm2左右的小块，接种于预培养基上，(25 士 2)°C，黑暗培养2-4天后，将外植体浸入已制备好的菌液中30 min，取出后用无菌滤纸吸干菌液，置于共培养培养基上共培养2-3天，取出后，用无菌水冲洗5次，转移至除菌培养基上暗培养2-3 周，期间每隔5天继代一次，至无菌斑生成后转移至1/2MS培养基上培养6代(20d/代)后可以用作诱导材料。二、6-苄氨基嘌呤诱导的丹参酮II的合成实验
接种0. 2g诱导材料一新鲜毛状根，于配好的添加有6-BA的MS培养基组培瓶中，将接种好的组培瓶置于培养箱中，调整温度为8 — 15°C，黑暗培养2d。然后，将温度调整到18 -23°C，继续黑暗培养培养4周，收获瓶中的毛状根。整个过程保持培养环境的清洁无菌。同时设置一个不添加激素的毛状根培养处理作为对照。采用超声波提取法提取丹参酮II A并按照药典规定方法进行含量测定。测定含量高达0. 0451%，高于对照0. 015%的3倍。具体提取方法说明取2 g鲜根，精密称定，置于研钵中研磨5 min，加甲醇10 mL, 精密称重，超声萃取1 h，取出放冷，加甲醇溶液补足至原重，摇勻，静置，过0.45 ym微孔滤膜，即得。丹参酮类成分测定方法采用RP-HPLC方法，利用C-18反相硅胶柱(Econosphere C18 5 μ m，250 mmX 4. 6 mm)进行恒速洗脱，体积流量控制在1 mL/min，流动相组成为色谱甲醇-水(61 39)，检测波长为270 nm，用外标一点法计算其含量。本发明的有益效果
1、以6 — BA为诱导子，其成本与生物诱导子相仿，灭菌后室温即可保存，保存期远远超出生物诱导子，可节约能耗。2、以6 — BA为诱导子，与现有的非生物诱导子莉酸甲酯、Ag +、Co+和α —氨基异丁酸相比减少数倍至数百倍的成本。3、以6 — BA为诱导子，与Ag +、Co +相比可大大减少毛状根提取物重金属超标的几率。4、低温预处理及18 - 23°C培养降低了毛状根培养的环境条件要求，也能有效节约能耗及生产成本。
具体实施例方式
实施例1
接种0. 2g新鲜毛状根系统材料于配好的添加有6-BA浓度为1. 5mg/L的MS培养基的标准组培瓶中，培养基装量20mL。置于培养箱中，调整温度为15°C，黑暗培养45小时。然后，将温度调整到18°C继续黑暗培养培养30天，收获瓶中的毛状根。采用超声波提取法提取丹参酮II A并按照药典规定方法进行含量测定。含量达 0. 0035mg/g,比对照(不添加6-BA的培养基)的含量0. 0015mg/g,高2. 3倍。实施例2
接种0. 2g新鲜毛状根系统材料于配好的添加有6-BA浓度为2. 5mg/L的MS培养基标准组培瓶中，置于培养箱中，调整温度为8°C，黑暗培养50小时。然后，将温度调整到23°C 继续黑暗培养培养沈天，收获瓶中的毛状根。采用超声波提取法提取丹参酮II A并按照药典规定方法进行含量测定。含量达 0. 0040mg/g,比对照(不添加6-BA的培养基)的含量0. 0015mg/g,高2. 7倍。实施例3
接种0. 2g新鲜毛状根系统材料于配好的添加有6-BA浓度为2. Omg/L的MS培养基标准组培瓶中，置于培养箱中，调整温度为12°C，黑暗培养48小时。然后，将温度调整到20°C 继续黑暗培养培养观天，收获瓶中的毛状根。采用超声波提取法提取丹参酮II A并按照药典规定方法进行含量测定。含量达 0. 0045mg/g,比对照(不添加6-BA的培养基)的含量0. 0015mg/g,高3倍。以上所述，仅为本发明其中的较佳实施案例而已，并非用来限定本发明的实施范围即凡根据本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆为本发明权利要求的范围所涵盖。
权利要求
1.一种丹参毛状根合成丹参酮II A的技术，其特征在于，丹参酮II A是通过6-苄氨基嘌呤诱导丹参毛状根系统并控制诱导过程中的环境温度而促进其合成的。
2.根据权利要求1所述的丹参毛状根合成丹参酮IIA的技术，其特征在于，诱导因子选用6-苄氨基嘌呤，浓度为1. 5 — 2. 5mg/L。
3.根据权利要求1所述的丹参毛状根合成丹参酮IIA的技术，其特征在于，诱导过程环境温度的控制为先调整为8 - 15°C黑暗培养45-50小时，然后调整为18 — 23°C继续黑暗培养洸-30天。
4.根据权利要求1所述的丹参毛状根合成丹参酮IIA的技术，其特征在于，丹参毛状根系统是经农杆菌A4侵染并置于1/2MS培养基上培养6代获得。
5.根据权利要求4所述的丹参毛状根合成丹参酮IIA的技术，其特征在于，农杆菌A4 是采用购买自中国农业大学的发根农杆菌A4菌株。
全文摘要
本发明是以购自中国农业大学的发根农杆菌A4菌株感染野生植物丹参获得毛状根系统，再采用6-苄氨基嘌呤作为诱导子，通过调节环境温度促进毛状根中丹参酮ⅡA的合成。采用6-苄氨基嘌呤作为诱导子，大大降低了使用生物诱导子及非生物诱导子成本高、能耗高等缺点，环境温度的调节也使得有效成分丹参酮ⅡA的合成大幅度提高。
文档编号A01H4/00GK102487815SQ201110354598
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者单成钢, 宋康, 朱京斌, 朱彦威, 王志芬, 王维婷 申请人:山东省农业科学院农产品研究所