专利名称：一种提高紫花苜蓿组织培养效率的方法
一种提高紫花苜蓿组织培养效率的方法技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的组织培养方法。本发明通过开发了新的组培技术方法，重点对培养步骤中种子消毒和愈伤组织形成与分化两大技术节点进行改进与创新，从而获得高效、低毒、低褐化的苜蓿组培新技术方法。
背景技术：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是重要的豆科牧草，因其具有营养价值高、适口性好等优点，被誉为“牧草之王”。紫花苜蓿组织培养主要是指是利用苜蓿离体器官(子叶、 胚根等)，通过人工培养，进行植株再生的技术方法。该方法对于苜蓿珍贵遗传材料的繁殖、 保存与苜蓿转基因植物培育等方面具有重要意义。苜蓿组培技术主要包括五个步骤外植体培养、愈伤组织诱导、胚状体形成与芽分化、根诱导、再生植株。
目前苜蓿组织培养中，愈伤组织诱导培养基一般采用单一植物激素或生长调节剂，该方法虽然简单，但愈伤组织分化慢、分化率低、愈伤组织质量也较差。例如，舒文华等(舒文华，耿华珠，闫伦兴等，紫花苜蓿胚轴愈伤组织培养与植株再生，草业科学，1993， 10(3) :65-67)以和田苜蓿为材料，通过单一 2，4-W2，4-二氯苯氧乙酸)激素诱导愈伤，出愈率为81 %，愈伤形成需7 8天，每块愈伤平均出芽数0. 75 1. 0个；
此外，梁慧敏等(梁慧敏，黄剑，夏阳等，苜蓿组织培养高频率再生体系的建立，农业生物技术学报，2003，11 (3) =321-322)研究发现，经过优化后，胚状体诱导率58% ；
此外，肖荷霞(肖荷霞，苜蓿转化再生体系的建立及LEA-3基因研究D，河北大学，200 研究发现，以下胚轴、茎、叶为材料进行培养，其中下胚轴效果最好，最佳诱导培养基为MS+2. Omg/L 2,4-D+O. 5mg/L 6-BA，胚状体诱导率45%，褐化率为22%。
此外，赵金梅(赵金梅，李芳，周禾等，紫花苜蓿组织培养体系的建立，核农学报， 2010,24(3) :507-51 研究发现，经过优化后，形成两种方法。其方法一苜蓿愈伤组织后期分化率最高可达90%，但早期愈伤组织诱导困难，黄色、水渍状，质量较差，而且褐化率高达为25%。其方案二苜蓿早期愈伤组织诱导率高达100%，且呈黄绿色，疏松、质量高。但该方法形成的愈伤组织后期分化率低，仅为10%，褐化也将为严重。
此外，徐春波等(CN101946711A)研究发现，经过优化后，苜蓿愈伤组织后期诱导率达85%，但愈伤组织呈黄色、水渍状，质量较差。褐化率高达为33%。后期分化率也较低， 仅为63%。
尽管紫花苜蓿再生体系已趋于成熟，但仍存在两大关键技术难题
(1)种子消毒当前种子消毒方法，要不消毒效果好，但对种子损伤大，影响种子萌发；要不对种子损伤小，但效果差，容易出现污染，致使组培失败；
(2)愈伤组织形成与分化目前技术体系早期紫花苜蓿愈伤组织形成速度慢、胚性愈伤组织少，中后期胚状愈伤分化速度慢、出芽少、褐化现象严重等缺点，严重影响苜蓿组织效率乃至成败。经过优化后，虽然愈伤组织质量和分化率有所提高，但仍存在要么是高质量愈伤组织，低愈伤组织分化；要么是高愈伤组织分化率，低愈伤组织诱导效率的关键技术难题。因此，开发一种新的高效培养技术方法，既能保证高的愈伤组织诱导率，又能保证高的愈伤组织分化率，是十分必要的。
因此，开展一种高效、低毒的种子消毒技术方法是十分必需的；同时，在愈伤组织形成与分化阶段需要开发一种技术方法，既能在早期促进苜蓿愈伤组织的形成，又能提高胚性愈伤的分化能力，降低褐化率。
本发明重点围绕这两大技术难题，开发了新的组培技术方法，重点对这两个关键技术难题进行改进与创新，从而获得高效、省时、低毒、低褐化的苜蓿组培新技术方法。发明内容
目前苜蓿组织培养中，主要存在外植体污染严重、愈伤组织形成和分化不足这两大技术难题，这导致苜蓿组培诱导时间长、效率低、质量差、褐化严重等问题。
外植体污染严重主要是由于种子消毒不彻底造成的。目前种子消毒方法主要分为升汞消毒法、次氯酸钠消毒法和双氧水消毒法三种(参见表1)。其中升汞消毒法消毒效果最好，但毒性大，对种子损伤严重，不利用后期外植体培养；次氯酸钠消毒效果仅次于升汞， 但也有一定毒性。如果消毒时间过短，则存在消毒不彻底，种子污染严重的问题；如果消毒时间过长，同样也造成种子损伤；双氧水对种子损伤最小，但消毒效果不理想，种子污染严重。通过反复实验，本发明通过采用升汞与双氧水复合消毒法，实现既消毒效果彻底，污染率低，又对种子损伤最小的目的，最终解决当前外植体污染严重的问题。
表1 不同消毒方法对苜蓿种子萌发及种苗生长的影响
消毒方法种子数发芽率污染率畸变率发芽时间升汞消毒法10053%5%15%10-15天次氯酸钠消毒法10085%45%2%7-10 天双氧水消毒法10080%10%5%7-10 天
同时，紫花苜蓿愈伤组织诱导与培养过程中，存在愈伤组织形成慢，胚状体诱导率低，出芽数少，分化率低，褐化严重，一般愈伤组织出现需要5 7天时间，最终胚状体诱导率50%，愈伤褐化严重，褐化率高达20 60%。目前苜蓿组培愈伤诱导主要使用的是2， 4-D或KT。使用2，4-D，愈伤组织诱导率低、形成速度慢；如果加大使用量，因2，4-D是一种生长抑制剂，不利于胚状体分化与芽的形成，而且还容易出现褐化现象，导致组培失败。
本发明通过优化激素配比与组培技术流程，形成新的技术方法，本技术首次采用 TDZ+6-BA配合使用的方法，不仅可以显著提高愈伤诱导率、形成速率，提高愈伤质量，而且还最大限度保留了愈伤组织的分化能力，促进胚状体芽的形成。该技术出愈快、愈伤组织质量好、褐化率低，可以解决当前愈伤培养存在的出愈时间长、质量差，褐化严重的技术难题。 应用该技术后，愈伤诱导时间为3天，缩短40%;愈伤组织诱导率达100%，且愈伤组织呈黄4绿色，疏松、质量较高；后期愈伤组织分化率达75%，褐化情况基本消失。本发明的目的是提供了一种紫花苜蓿的组织培养方法，其由种子灭菌及无菌苗的获得、外植体培养、愈伤组织的诱导与继代培养、胚状体的诱导、胚性愈伤的分化、生根培养阶段组成，具体制各步骤如下选取健壮幼苗，截取下胚轴，将其切成Icm小段，置于愈伤培养基培养，培养4周，将愈伤组织转入继代培养基，培养5-8天；将愈伤组织转入胚状体诱导培养基诱导胚状体的形成，培养7-10天，每隔Mh，更换一次培养基。将诱导出的胚状体转入分化培养基进行分化培养，连续培养4周。将分化出的植株转入生根培养基中，进行生根培养，连续培养4周而得，愈伤培养基配方为SH+2，4-D(2. Omg/ L)+6-BA(0.5mg/L)+琼脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/L)；继代培养基配方为 SH+2，4_D (2. Omg/ L) +6-BA (0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/L) +7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖；胚状体培养基配方 MS0+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) + 水解酪蛋白 Gg/L) +7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖；分化培养基 MS0+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) + 琼脂(7. 5g/L) + 蔗糖(30g/L)；生根培养基配方为 1/2MS+ 琼脂(7. 5g/L) + 蔗糖(30g/L)。本发明的另一个目的就是提供一种苜蓿种子的灭菌方法，具体步骤如下选取籽粒饱满的种子，75 %酒精浸泡Imin后，1 %升汞浸泡5min，接着30 %过氧化氢浸泡30min，然后用蒸馏水冲洗3-4次，将冲洗干净的种子放在滤纸上吸干水，接种于固体培养基中(pH = 6. 0)，固体培养基配方MS+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖；培养条件25°C，光照强度25001k，分为光暗周期16/8h，培养5-7天。综上所述，本发明不仅对种子消毒过程进行了优化，采用升汞和过氧化氢混合灭菌法，该方法不仅消毒效果好，种子污染率低；而且对苜蓿种子损伤小，处理后种子2-3天即可萌发；还首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不仅可以显著提高愈伤诱导率、形成速率，提高愈伤质量，而且还最大限度保留了愈伤组织的分化能力，促进胚状体芽的形成。以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。对其中的一些本领域常用培养基及其成分进行了阐释如下SOC培养基每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨209克，酵母提取物59克，NaCl 0. 59 克，250mmol/L KCL 溶液 IOml, ρΗ7· 0。临用前加人 2mol/L MgCl2 溶液 5ml 禾口 lmol/L 葡萄糖溶液20ml。SH培养基硝酸钾Q830mg/L)，硝酸铵(46;3mg/L)，七水合硫酸镁(185mg/L)，二水合氯化钙(166mg/L)，磷酸二氢钾GOOmg/L)，七水合硫酸锌(8. 6mg/L)，二水合钼酸钠 (0. 25mg/L)，五水合硫酸铜(0. 025mg/L)，六水合氯化钴(0. 025mg/L)，盐酸吡哆醇(9. 5mg/ L)，盐酸硫胺素(9. 9mg/L)，烟酸(4. 5mg/L)，乙二胺四乙酸二钠(37. 3mg/L)，七水合硫酸亚铁(27. 8mg/L)。MSO培养基硝酸钾(1900mg/L)，硝酸铵(1650mg/L)，七水合硫酸镁(370mg/L)， 二水合氯化钙(440mg/L)，磷酸二氢钾(170mg/L)，四水合硫酸锰3mg/L)，七水合硫酸锌(8. 6mg/L)，硼酸(6. 2mg/L)，碘化钾(0. 83mg/L)，二水合钼酸钠(0. 25mg/L)，五水合硫酸铜(0.025mg/L)，六水合氯化钴(0. 025mg/L)，肌醇(100mg/L)，盐酸吡哆醇(1. 0mg/L)， 盐酸硫胺素(10. 0mg/L)，烟酸(1. 0mg/L)，乙二胺四乙酸二钠(37. :3mg/L)，七水合硫酸亚铁 (27. 8mg/L)。
MS培养基硝酸钾(1900mg/L)，硝酸铵(1650mg/L)，七水合硫酸镁(370mg/L)，二水合氯化钙(440mg/L)，磷酸二氢钾(170mg/L)，四水合硫酸锰3mg/L)，七水合硫酸锌 (8. 6mg/L)，硼酸(6. 2mg/L)，碘化钾(0. 83mg/L)，二水合钼酸钠(0. 25mg/L)，五水合硫酸铜 (0. 025mg/L)，六水合氯化钴(0. 025mg/L)，肌醇(100mg/L)，甘氨酸(2. Omg/L)，盐酸吡哆醇 (0. 5mg/L)，盐酸硫胺素(0. lmg/L)，烟酸(0. 5mg/L)，乙二胺四乙酸二钠(37. 3mg/L)，七水合硫酸亚铁、2 . 8mg/L)。苯基噻二唑基脲(TDZ)—种新兴的植物生长调节剂。2，4-二氯苯氧乙酸Q，4-D)—种植物生长调节剂，是用于诱导愈伤组织形成。6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)—种植物生长调节剂，是用于诱导愈伤组织形成。a-萘乙酸(NAA)—种植物生长调节剂，是用于诱导愈伤组织形成。N6-呋喃甲氨基嘌呤(KT):又名激动素，一种植物生长调节剂，是用于诱导愈伤组织形成。
图1 紫花苜蓿的组织培养效果对比，左图(L)为使用前愈伤组织，右图(R)为使用该技术后的愈伤组织；图2 紫花苜蓿的组织培养效果图，A 无菌苗；B 愈伤组织诱导；C 胚状体诱导； D 不定芽形成；E 分化植株；F 再生植株。
具体实施例方式实施例1.种子灭菌及无菌苗的获得选取籽粒饱满的种子，75 %酒精浸泡Imin后，1 %升汞浸泡5min，接着30 %过氧化氢浸泡30min，然后用蒸馏水冲洗3-4次，将冲洗干净的种子放在滤纸上吸干水，接种于固体培养基中(pH = 6. 0)。培养基配方MS+琼脂(7. 5g/L) +蔗糖(30g/L)。培养条件，25°C， 光照强度25001k，分为光暗周期16/8h，培养5-7天。通过采用升汞与双氧水复合消毒法，实现既消毒效果彻底，污染率低，又对种子损伤最小的目的，最终解决当前外植体污染严重的问题。2.愈伤组织的诱导选取健壮幼苗，截取下胚轴(根上部分茎以下部分)。将其切成Icm小段，置于愈伤培养基培养。愈伤培养基配方SH+2，4-D (2. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/L) +7. 5g/L琼脂+30g/ L蔗糖。培养四周。(参见图1)。3.愈伤组织的继代将愈伤组织转入继代培养基进行培养。愈伤组织产生后，转移到继代培养基继续培养。愈伤培养基配方SH+2，4-D(2. Omg/L)+6-BA(0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/L) +7. 5g/L 琼脂+30g/L蔗糖。培养条件，25°C，光照强度25001k，分为光暗周期16/8h，培养5_8天。4.胚状体的诱导将愈伤组织转入胚状体诱导培养基诱导胚状体的形成。胚状体培养基配方 MS0+NAA(1. Omg/L)+6-BA (0. 5mg/L)+ 水解酪蛋白(4g/L)+7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖。培养7-10天，每隔Mh，更换一次培养基。5.植物组织的分化将诱导出的胚状体转入分化培养基进行分化培养。分化培养基MS0+NAA(1. Omg/ L) +6-BA (0. 5mg/L) +7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖。连续培养 4 周。6.生根培养将分化出的植株转入生根培养基中，进行生根培养。生根培养基1/2MS+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖。连续培养4-5周，整个紫花苜蓿的培养过程参见图2。应用该技术后，愈伤诱导时间为3天，缩短40% ；胚状体诱导率达到90%，增加 40% ；褐化情况基本消失，褐化率降低20%。而且愈伤不定芽的形成数量增加，增加近150% (出芽数从1. 0个/每块愈伤增加到2. 1个/每块愈伤)，出芽时间缩短30%。
权利要求
1.一种紫花苜蓿的组织培养方法，其特征在于其由种子灭菌及无菌苗的获得、外植体培养、愈伤组织的诱导与继代培养、胚状体的诱导、胚性愈伤的分化、生根培养阶段组成，具体制备步骤如下选取健壮幼苗，截取下胚轴，将其切成Icm小段，置于愈伤培养基培养，培养4周，将愈伤组织转入继代培养基，培养5-8天；将愈伤组织转入胚状体诱导培养基诱导胚状体的形成，培养7-10天，每隔Mh，更换一次培养基。将诱导出的胚状体转入分化培养基进行分化培养，连续培养4周。将分化出的植株转入生根培养基中，进行生根培养， 连续培养4周而得，愈伤培养基配方为SH+2，4-D(2. 0mg/L)+6-BA(0. 5mg/L)+琼脂(7. 5g/ L) + 蔗糖(30g/L)；继代培养基配方为 SH+2，4-D(2. Omg/L) +6-BA(0. 25mg/L) +TDZ (0. 25mg/ L)+7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖；胚状体培养基配方MS0+NAA(1. Omg/L)+6-BA (0. 5mg/L) + 水解酪蛋白 Gg/L) +7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖；分化培养基 MSO+NAA (1. Omg/L) +6-BA (0. 5mg/ L)+琼脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/L)；生根培养基配方为1/2MS+琼脂(7.5g/L) +蔗糖(30g/ L)。
2.—种权利要求1中所述的紫花苜蓿的组织培养方法，其特征在于，种子灭菌的具体步骤为选取籽粒饱满的种子，75%酒精浸泡Imin后，升汞浸泡5min，接着30%过氧化氢浸泡30min，然后用蒸馏水冲洗3-4次，将冲洗干净的种子放在滤纸上吸干水，接种于固体培养基中(pH = 6. 0)，固体培养基配方MS+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖；培养条件25°C， 光照强度25001k，分为光暗周期16/8h，培养5-7天。
全文摘要
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种紫花苜蓿(Medicago sativa L.)的组织培养方法。本发明通过开发了新的组培技术方法，重点对培养步骤中种子消毒和愈伤组织形成与分化两大技术节点进行改进与创新，本发明通过采用升汞与双氧水复合消毒法，实现既消毒效果彻底，污染率低，又对种子损伤最小的目的，最终解决当前外植体污染严重的问题；同时，首次采用TDZ+6-BA配合使用的方法，不仅可以显著提高愈伤诱导率、形成速率，提高愈伤质量，而且还最大限度保留了愈伤组织的分化能力，促进胚状体芽的形成，从而获得高效、省时、低毒、低褐化的苜蓿组培新技术方法。
文档编号A01H4/00GK102499094SQ20111037753
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者任卫波, 刘雅学, 张文静, 李晶, 王茅雁, 解继红, 赵海霞, 郭慧琴 申请人:中国农业科学院草原研究所