专利名称：小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分离克隆、酶活性测定方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦叶绿素、类胡萝卜素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分离克隆、酶蛋白的原核表达、 酶蛋白的分离纯化及酶活性体外检测技术。
背景技术：
类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质。目前，已经发现了 3万余种植物类异戊二烯， 而且这个数字还在逐年增加。该类物质在生物体中具有各种不同的作用，可作为光合色素 (如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷留醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如作为食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素和橡胶等。类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，法呢基焦磷酸合酶(FPS ；EC2. 5. 1. 1/EC2. 5. 1. 10)是该代谢途径中分支点的关键酶，通过类异戊二烯1 ‘ -4顺序缩合的方式催化异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，首先形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)，然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩合形成一个多分支点的、特别重要的中间产物法呢基焦磷酸(FPP)，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、7jC 禾S (Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghum bicolor)、橡胶(Hevea brasiliensis)等40种植物中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因， 在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于从小麦(Triticum aestivum)中分离克隆法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数等研究资料信息。
发明内容
针对现有技术中在小麦中法呢基焦磷酸合酶基因相关技术的缺失，本发明的发明人提供了一整套关于小麦特别是品种“济南13”法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术。 测得自小麦品种济南13克隆获得的法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、 异戊烯焦磷酸(IPP)和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的Vmax分别为22. 7士 1.5、73. 5士 16. 9和 73. 0 + 10. 8ymol/min/mg ；Km 值分别为 0. 84士0. 14、1. 83士0. 79 禾口 1. 51 士0. 43 μ M ；Kcat 分别为 1.67士0.11、5. 42士 1.25 和 5. 38士0. 80S、Kcat/KM 分别为 1. 99xl06、2. 96xl06 和 3. Sexio6M-1S-1,由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。本发明提供的小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的编码区基因序列如SeqID No 1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No 2所示。上述的小麦品种济南13中的法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS是从小麦品种济南13 中克隆获得的，其中小麦品种济南13中该基因cDNA总长为1399bp，翻译起始密码子ATG自 49位核苷酸开始，终止密码子TAG位于1111位核苷酸处，在1310位核苷酸处有polyA尾巴。因此，小麦品种济南13TaFPS全长cDNA包括1个48bp的5'非编码区、1065bp编码区和1个257bp的3'非编码区，编码一条包含354aa的多肽，分子量约为42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq ID No 3所示；本发明的发明人提供了该基因的具体的分离克隆方法及其原核表达及酶活性检测的方法为1.小麦叶片RNA的分离提取根据Trizol试剂盒的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。2.第一链cDNA的合成按照Takara反转录试剂盒说明书进行。3.基因中间序列扩增、连接与转化根据植物中FPS氨基酸序列的高度保守区设计基因中间序列扩增引物，扩增小麦 FPS的相应序列。上游引物为DFFPS:5' TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3‘，其基因序列如Seq ID No 4 所示；下游引物为DRFPS 5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘，其基因序列如Seq ID No :5所示。根据一定条件进行PCR，利用DNA胶回收试剂盒回收461bp特异条
市ο将回收的DNA片段与pGEM-T Easy载体进行连接。利用热激法转化大肠杆菌DH 5 α，挑取阳性克隆，制备质粒DNA并进行DNA测序，通过NCBI比对获得目的基因片段。4.利用RACE技术快速获得基因末端序列4. IRACE 引物设计根据所获得的461bp的基因中间序列，设计5' RACE和3' RACE引物。5' RACE 引物(DRFPS) :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘，其基因序列如 Seq ID No 5 所示；3' RACE 引物(Fps-IS) :5' ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3‘，其基因序列如 SeqID No 6所示。4. 2基因末端序列快速扩增根据Clontech Laboratories INC 的 SMARTTmRACE cDNA Amplification kit 的方法快速扩增基因的5'和3'末端，筛选重组子，并测序。4. 3基因中间序列和RACE序列使用Contig Express 9. 1拼接全长序列，然后对所得的contig序列进行人工校对。5基因全长序列的扩增
5.1基因全长引物的设计根据中间序列和RACE序列contig结果，设计全长扩增引物。上游引物序列为FPS-2F :5' GCTCCTTCTCGTCCCTTCT3 ‘，其基因序列如 Seq IDNo 7所示下游引物序列为1FPS-2R. 1 TAGCACCGTAGTTTATTGTTG3‘，其基因序列如 Seq ID No 8 所示；5. 2全长基因的PCR扩增以第一链cDNA为模板扩增全长目的基因，进行全长基因PCR产物的胶回收、连接、 转化、PCR重组子检测、质粒提取和测序，获得全长序列为1399bp。6基因的原核表达6. 1基因原核表达引物设计根据所得全长序列测序结果，利用DNAMAN软件把所得的基因序列翻译成氨基酸序列，然后同NCBI已知生物法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列进行比对来确定小麦法呢基焦磷酸合酶基因的0RF，设计连入pLMl表达载体的引物。在基因的5'端，设计带有核糖体结合位点(AGGAGGA)、限制性内切酶SalI酶切位点(GTCGAC)、起始密码子、6个组氨酸密码子以及含有法呢基焦磷酸合酶基因中编码7个氨基酸的正向引物5' CGCGCGTCGACAGGAGG AATTTAAAATGAGAGGATCGCATCATCACCACCATCACGCGGCGGCGGCGGTGGCGTTGTC3 ‘基因序列如 Seq ID No :9所示；在基因的3'端，设计具有限制性内切酶Hind III酶切位点(AAGCTT)、终止密码子(TAG)以及含有编码7个氨基酸的反向引物5' CTGCAGAAGCTTCTATTTCTGCCTCTTGT AGATCTTC3‘，基因序列如 Seq IDNo 10 所示。6. 2基因原核表达载体的构建包括基因原核表达序列PCR扩增产物的酶切、酶切产物与载体的连接、转化、阳性克隆重组子PCR鉴定、酶切鉴定、质粒DNA提取、DNA测序验证。6. 3法呢基焦磷酸合酶基因表达首先进行法呢基焦磷酸合酶蛋白表达条件的优化，包括IPTG浓度、诱导温度的优化等。根据确定的优化条件，进行法呢基焦磷酸合酶蛋白的大量表达。7法呢基焦磷酸合酶蛋白的纯化利用离子交换柱分离纯化法呢基焦磷酸合酶蛋白。过柱纯化的蛋白质，装于透析袋中在一定溶液中透析去盐，纯化的蛋白质于_86°C保存备用。8采用分光光度计检测克隆获得的法呢基焦磷酸合酶活性测得法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、异戊烯焦磷酸(IPP) 和栊牛儿基焦磷酸(GPP)的 Vmax 分别为 22. 7士 1. 5,73. 5士 16. 9 和 73. 0士 10. 8 μ mol/min/ mg;KM 值分另Ij 为 0. 84 + 0. 14、1.83士0. 79 禾口 1. 51 士0. 43 μ M ;Kcat 分别为 1.67 士0. 11、 5. 42 士 1. 25 和 5. 38 士0. 80S-1，Kcat/KM 分别为 1. 99xl06、2. 96xl06 和 3. 56x106IT1S-1,由此证明克隆的小麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。本发明为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
图1为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列示意图；图2为小麦叶片RNA电泳图谱，图中1为DNA Marker I ；2-6为小麦济南13的RNA样品；图3为小麦法呢基焦磷酸合酶基因中间序列PCR产物电泳图谱，图中IDNA marker ；2-11为小麦济南13法呢基焦磷酸合酶基因中间序列的PCR产物，长度为461bp ；图4为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因末端序列快速扩增PCR产物电泳图，图中 Al 为 DNA marker ；A2 为 3' RACE PCR产物，大小为 869bp ；Bl 为 DNAmarker ； B2为5' RACE PCR产物，大小为748bp ；图5为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因的全长cDNA电泳图，cDNA全长为 1399bp ；图6为小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶基因的ORF的PCR扩增电泳图，引物 FPS-PLM1-F/FPS-PLM1-R 的 PCR 扩增产物长度为 1102bp ；图7为含有小麦法呢基焦磷酸合酶基因ORF的pLMl质粒酶切电泳图，图中对含有目的基因的阳性克隆的质粒DNA利用Sal I和Hind III双酶切后，获得1085bp的目的片段；图8为原核基因表达载体pLMl结构示意图，图中Ampcilin表示氨苄青霉素抗性，T7promoter为启动子，poly linker为多克隆位点，EcoRI和Hind III为多克隆位点边缘的限制性内切酶；图9为纯化的小麦品种济南13法呢基焦磷酸合酶蛋白SDS-PAGE电泳图，图中1为纯化的蛋白；2为蛋白质分子量标准；图10为小麦法呢基焦磷酸合酶活性检测方法示意图。
具体实施例方式实施例1 (小麦叶片RNA提取)(1)用蛭石于恒温培养箱(28°C )培养小麦品种济南13长至三叶期。(2)液氮中将叶片研磨至粉末状，移到DEPC处理的EP管中。(3)加入适量 RNAiso Plus。(4)室温下静置5Hiin。(5)加入l/5RNAiso Plus体积的氯仿。振荡至乳白状。(6)室温下静置5Hiin。(7) 12000g，4°C 离心 15min。(8)上清移到新的DEPC处理的EP管中，加入与上清等体积的异丙醇，混勻。室温下静置lOmin。(9) 12000g，4°C离心 lOmin。
(10)向沉淀中加入ImL用DEPC水配制的75%乙醇。12000g 4°C离心5min。(11)保留沉淀，通风橱中干燥至无色。(12)加入40 ii L DEPC水溶解。半小时后分装并电泳检测。取0. 5 ii L和0. 8 ii L RNA样品，1. 0%琼脂糖非变性凝胶电泳，电压140V，电泳30min，凝胶成像系统拍照纪录，结 果如图2所示。实施例2 (cDNA第一条链的合成)按照Takara反转录试剂盒的说明进行。(1)在microtube管中配制下列混合液
Oligo dT primer (50[j,m)Iul
dNTP Mixture (IOmM each)Iul
Total RNA<5ドg
RNase free dH20up to 10ド1(2)在PCR仪上进行下列条件的变性、退火反应65度5分钟——冰上急冷。(3)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
上述变性、退火后反应液10 U 1
5XPrimerscript TM BF4 ド 1
RNase inhibitor (40U/ul)0. 5 ド1
Primescript TM RTase (200U/ul)1 ド1
RNase FreedH204. 5 ド1(4)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应42°C，60min ；70°C, 15min ；4°C冷却。实施例3 (中间序列扩增)1中间序列的引物设计用ft~imer5. 0引物设计软件和DNAMAN软件，根据植物中FPS的氨基酸序列的高度 保守区设计引物。上游引物DFFPS:5' TGGTGTATTGAATGGCTTCAAGC3 ‘ (Seq ID No 4)下游引物DRFPS :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3 ‘。(kq ID No 5)PCR 体系为cDNA 2ul、buffer 1. 5 ii L、Taq 酶 0. 3 ii L、dNTP 0. 7 ii L、DFFPS 0. 6 ii L、DRFFPS 0. 6 u L, ddH20 9. 8 ii しPCR 程序为94°C 3min、94°C 45s、55°C 45s,72°C lmin、72°C 6min，32cycles。2中间序列的PCR结果检测取8iiL PCR扩增产物与Iii L溴酚蓝混勻，点入1.5%琼脂糖凝胶中，在120V电压 下电泳45min，紫外凝胶成像系统观察并照相。如图3所示PCR得到一 461bp的DNA片段， 结果如图3所示。3扩增片段的回收PCR产物经常规琼脂糖凝胶(TaKaRa Agarose, 1. 5 %浓度)电泳，在紫外灯(波 长302nm)下观察，割取目的DNA条带。以DNA胶回收试剂盒(TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver2. 0，大连宝生物产品)回收特异条带。
(1)在紫外灯下用干净、无菌手术刀片切除含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不含有目的DNA部分的凝胶。(2)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。(3)混勻后75°C加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约 610min)。(4)加入DR-I Buffer 1/2体积量的DR-II Buffer,吹吸混勻，当分离461bp的 DNA片段时，在上述溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。(5)将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(6)将上述操作的溶液转移至Spin Column中，12000rpm，离心lmin，弃滤液。将滤液再加入Spin Column中，离心一次，可以提高DNA回收率。(7)加入 500 μ L Rinse A, 12000rpm 离心 lmin,弃滤液。(8)加入 700 μ L Rinse B, 12000rpm 离心 lmin,弃滤液。(9)重复 8—次。(10)将Spin Column安置于新的1. 5mL离心管上，在Spin Column膜中央处加入 25 μ L 60°C预热的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置lmin。(ll) 12000rpm 离心 lmin，洗脱 DNA，-20°C保存 DNA 备用。4回收产物的电泳检测取5μ L回收的中间序列PCR产物，用1. 5%琼脂糖凝胶中电泳检测回收效率。5PCR产物的连接根据回收片段的浓度确定产物和pGEM-T Easy Vector之间的比例。连接步骤如下(1)加入 DNA 3. 75 μ L，T 载体 0.25 μ L，轻轻混勻。(2)45°C水浴5min，立即转入冰上5min。(3)再加入 T4 DNA 连接酶 0. 5μ L 和 2xRapid Ligation BufferO. 5 μ L 混勻，于 PCR仪上16°C连接16h以上。6转化、培养(1)将5μ L连接液加入含50μ L感受态细胞的离心管中，吹吸混勻，冰上放置 30mino(2) 42°C水浴热激90s，立即冰浴2min。(3)加入950yL LB液体培养基，置于37°C摇床，230rpm振荡培养lh，使细胞复苏并表达抗性。(4)3000rmp离心3min。于超净工作台中去900 μ L上清，留100 μ L。(5)取70 μ L菌液均勻地涂布于LB固体培养基上，剩余30 μ L涂布在另外一个LB 固体培养基上。37°C倒置培养12 16h，直至出现菌落。7阳性重组子鉴定用灭菌枪头挑取单个白斑菌落于4mL含有100 μ g/mL Amp的LB液体培养基中， 230rpm，37°C过夜振荡培养。以菌液为模板，用PCR方法对含有插入片段的克隆进行筛选。 菌液PCR反应体系和反应程序参照以上方法。取2. 5 μ L PCR反应产物，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。
8质粒DNA提取(1)取1500μL菌液加入Eppendorf管中，12000rpm，离心lmin，弃上清，浙干残液。(2)加250yL solution I，置于涡旋振荡器上振荡，充分悬浮菌体。(3)加250 μ L solution II，轻轻颠倒混勻4-6次，室温下lmin。整个过程不要超过 5min。(4)加 350 μ L solution III，轻轻混勻，室温下放置 5min。(5) 12000rmp，离心 lOmin。(6)取上清液，移入柱中。8000rmp离心2min。(7)去废液，力口入 500 μ L washing solutions, lOOOOrmp，lmin。(8)重复(7)。(9)去废液，柱子于IOOOOrmp离心2min。(10)柱子室温下放置lOmin。(11)将柱子套到新的Eppendorf管中，加入50 μ L Elution Buffer。室温下放置 2min, IOOOOrmp 离心 2min。(Elution Buffer 预热到 60°C效果最好)(12)-20°C 保存备用。9质粒DNA浓度检测和测序取2. 5 μ L质粒于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳检测浓度。取15个阳性质粒送上海生工生物技术有限公司测序。10DNA序列分析通过DNAMAN和NCBI比对分析，获得小麦法呢基焦磷酸合酶基因的部分序列。实施例4 (通过RACE技术快速获得末端序列)RACE是基于PCR技术基础上由已知一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。该方法同筛库法相比较，有许多优点首先RACE技术是通过 PCR技术实现的，无需建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有价值的信息。其次，只要引物设计正确，在初级产物基础上就可以获得感兴趣基因的全长。再次，该技术节约了实验时间和经费。IRACE引物的设计根据所获得的461bp的基因中间序列，设计5' RACE和3' RACE引物。5' RACE 引物(DRFPS) :5' TCATCCTGAACTTGAAAGTATGCTCCCAT3‘ ； (Seq ID No 5)3' RACE 引物(Fps-IS) :5' ACGGCTTCAGGGCAGTTGTTGGA3‘。(Seq ID No :6)2第一链cDNA合成(1)①对于 5' -RACE-ReadycDNA
5'-CDS primer A 1 |aL SMART II A oligo 1 μ L DEPC water1 μ L②对于3' -RACE-Ready cDNARNA2μ L
3' -CDS primer A1 u LDEPC water2u L(2)微离心。(3)在 PCR 仪上进行 70 °C anin。(4)冰上放置anin，微离心。(5)向上管中分别加入
权利要求
1.小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的编码区基因序列如SeqIDNo :1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No 2所示。
2.如权利要求1所述的小麦法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS在构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物上的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦叶绿素、类胡萝卜素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶活性体外检测技术。为进一步构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
文档编号A01H5/00GK102433349SQ201110383608
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者刘爱峰, 李永波, 李玉莲, 楚秀生, 樊庆琦, 隋新霞, 高洁, 黄承彦 申请人:山东省农业科学院作物研究所