专利名称：一种防治烟草花叶病毒的精油制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物农药技术领域，具体涉及一种防治烟草花叶病毒的精油制剂及其应用。
背景技术：
植物病毒性病害全世界广泛存在，对现代农业造成严重危害。烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus, TMV)是一种最普遍的植物病毒，可感染9个科，至少125个属的植物，其中包括烟草、番茄、辣椒、黄瓜和一些观赏类花卉。目前控制烟草花叶病毒最主要的方式是使用化学制剂防控和转基因手段。然而，非生物降解的化学药品的滥用造成严重的环境污染，危及人类健康；另外转基因技术目前仍不被大部分人所接受。因此，寻求一种新颖、有效和环境相容型的抗病毒方法仍是当今面临的重要问题。植物精油是植物次生代谢的芳香成分和挥发性物质，主要取自植物的果实、叶片、 茎秆、种子、花和根等。精油的主要成分包括单萜、倍半萜、醇类、酯类、醛类和酮类等。由于精油成分的多样性赋予了精油广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化和抗突变等。目前已有大量文献对精油抗HSV-I、HSV-2、流感A/PR/8病毒、IBV, PVA和SARS-CoV活性进行了相关报道，然而植物精油抗烟草花叶病毒活性鲜有介绍。^iWM-^Cymbopogon ci tra tus )属禾本禾斗(Gramineae)香茅属{Cymbopogon )绿叶草本植物，在其病害调查中从未发现烟草花叶病毒病的发生，其原因可能在于其体内的次生代谢系统的抵御作用。柠檬草精油的抗病毒活性已有大量报道，其主成分柠檬醛的抗 HSV活性已经得到验证。柠檬醛可以破坏HSV外壳蛋白，从而影响病毒对寄主的吸附，并保护细胞表面免受侵害。陈皮是取自柑橘iXJitrus reiic^aia)的果皮，柑橘(^Citrus reiic^aia)属于芸香科(Rutaceae )柑橘属(CYir狀)植物，在食品、药品以及工业原料中广泛应用。陈皮挥发油主成分柠檬烯，是植物环状萜类最简单的化合物，是合成多数植物精油的重要前体化合物，对植物的防御体系有重要的调节作用。本发明从抗烟草花叶病毒和调节烟草防御系统两方面进行，从而控制烟草花叶病毒对烟草产业造成的危害。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备简便、成本低廉、纯天然和无残留的防治烟草花叶病毒病的精油制剂及其应用。本发明所提供的一种防治烟草花叶病毒的精油制剂，它的有效成分是柠檬草精油和陈皮精油。所述的柠檬草精油和陈皮精油的体积配比是柠檬草精油2 8份，陈皮精油是 4 10 份。所述的柠檬草精油和陈皮精油均用水蒸气蒸馏法提取得到。柠檬草精油按下述方法提取得到柠檬草干叶与蒸馏水的比为500g:3L，将柠檬草干叶碎片装入水蒸气蒸馏装置中，注入蒸馏水，浸泡30min，加热沸腾蒸馏60min完毕， 收集液面上层油状物，用无水硫酸钠干燥，即得柠檬草精油；
陈皮精油按下述方法提取得到按陈皮与蒸馏水的比为IOOOg:3L，将陈皮装入水蒸气蒸馏装置中，注入蒸馏水，浸泡池，加热沸腾蒸馏他完毕，收集液面上层油状物，用无水硫酸钠干燥，即得陈皮精油。此方法能使柠檬草精油、陈皮精油的提取率分别达到0. 92%、0. 85%。所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，还含有乳化剂和扩散剂。所述的乳化剂和扩散剂及其体积配比是吐温20 2 5份，二甲基亚砜6 10 份。本发明还提供了上述防治烟草花叶病毒的精油制剂在防治烟草花叶病毒的应用。所述的应用是将上述防治烟草花叶病毒的精油制剂用水稀释至800 1500倍液后喷施在烟草植株上，对烟草花叶病毒具有显著的钝化、预防和治疗作用。本发明精油制剂配方的有效成分来自纯天然的柠檬草精油和陈皮精油，具有无毒性、无污染、无残留的优点，是环境友好型的产品，能避免农业生产中环境污染及农药残留问题，对烟草花叶病毒具有显著的钝化、预防和治疗效果，效果分别平均达到64. 9%, 58. 7%， 42. 2%ο此外，柠檬草和柑橘在中国资源丰富，种植区域广泛，容易获得大量的柠檬草精油和陈皮精油，而且精油在农药中使用量较低，成本低廉，因此，为新型农药的开发奠定了良好的基础。
具体实施例方式以下方法无特殊说明，均为常规方法。实施例1 柠檬草精油和陈皮精油的制备
Ψ 14Cymbopogon ciiratos)属禾本禾斗(Gramineae)香茅属{Cymbopogon )
绿叶草本植物；
陈皮是取自柑橘(C/ir^s reiic^aia)的果皮，柑橘(CYir^s reiic^aia)属于芸香科 (Rutaceae )柑橘属 Wi trus )植物。柠檬草和陈皮均可从商业渠道购买到。(1)柠檬草精油提取使用剪刀将柠檬草干叶剪成2 3cm小片，准确称取500g， 装入容积为5L的水蒸气蒸馏装置内，再注入蒸馏水3L，浸泡30min。接通电源，待蒸馏瓶沸腾60min后蒸馏完毕，收集液面上层黄色油状物，用无水硫酸钠干燥，即得纯净柠檬草精油。将其置于棕色瓶内于4°C冰箱密封保存。(2)陈皮精油提取直接将陈皮掰成小块，准确称取1000g，装入容积为5L的水蒸气蒸馏装置内，再注入蒸馏水3L，浸泡2h。从接通电源开始至水蒸馏结束需他，待蒸馏结束后收集液面上层淡黄色油状物，用无水硫酸钠干燥，即得纯净陈皮精油。将其置于棕色瓶内于4°C冰箱密封保存。得油率=精油体积(ml) /植物材料质量(g) X 100%
通过水蒸气蒸馏提取装置分别提取柠檬草精油和陈皮精油，经上式计算得出柠檬草干叶精油提取率为0. 92%，陈皮精油提取率为0. 85%。
实施例2 防治烟草花叶病毒的精油制剂与应用
1、本实施例所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂的配方详见1。2、本实施例所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂的制备方法
按照体积配比将柠檬草精油2份、陈皮精油4份、吐温20 2份、二甲基亚砜8份混合制成乳浊液即为所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，该精油制剂中所述的柠檬草精油和陈皮精油是按实施例1所述的制备方法制备得到。3、所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂用于烟草花叶病毒的钝化、治疗和预防实验
将所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂用水稀释至1000倍，将其充分混合均勻制成精油制剂乳浊液用于烟草花叶病毒的钝化、治疗和预防实验。
具体实施方式
如下
①烟草花叶病毒悬浮液的制备取感染烟草花叶病毒病的烟草叶片(品种1(3 ) IOOg, 剪碎，置于研钵内，加少许石英砂和20ml磷酸缓冲液(0. 2M，pH5. 7-8.0)，充分研磨。使用量筒加入磷酸缓冲液定容至100ml，贮藏于4°C冰箱内用于接种实验。感染了烟草花叶病毒病的烟草叶片的鉴定方法按《GB/T23222-2008 (烟草病虫害分级及调查方法)》进行取样鉴定。本制备方法中烟草花叶病毒是利用该病毒致烟草花叶病毒病的致病共性，而不是利用病毒的特异性，因此具有致病力的各种烟草花叶病毒都能达到感染烟草叶片，按所述的鉴定即可获得感染烟草花叶病毒病的烟草叶片。②钝化实验试验采用枯斑法并稍加修改，具体操作是在绿色防虫温室内进行。取上述防治烟草花叶病毒的精油制剂180 μ 1与烟草花叶病毒悬浮液20 μ 1混合，室温下放置处理60min，期间间歇性震荡。60min后使用移液器准确取20 μ 1上述混合液，接种于位置、大小均一致的烟草花叶病毒枯斑寄主心叶烟的整片叶子上，随后使用药用棉签涂抹均勻。以蒸馏水处理为空白对照，宁南霉素溶液(500 μ g/mlL)处理为对照药剂。将上述烟苗在温度26 °C 48°C，湿度70-80%条件下培养3 4d后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据下面公式计算
抑制率/C] X 100%
C表示空白对照形成的枯斑数量；T表示处理后形成的枯斑数量。③预防作用试验采用枯斑法并稍加修改，具体操作是在绿色防虫温室内进行。 取上述精油制剂，使用药用脱脂棉蘸取后均勻涂抹于位置、大小均一致的枯斑寄主心叶烟整片叶子上，以药液不下滴为宜。处理池后，取病毒悬浮液20 μ L接种于上述处理的叶片上，使用药用棉签涂抹均勻。以蒸馏水处理为空白对照，宁南霉素溶液(500 μ g/mL)处理为对照药剂。将上述烟苗在温度26 °C -28 °C，湿度70-80%条件下培养3 4d后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据下面公式计算
抑制率/C] X 100%
C表示空白对照形成的枯斑数量；T表示处理后形成的枯斑数量。④治疗实验试验采用枯斑法并稍加修改，具体操作是在绿色防虫温室内进行。 使用移液器取烟草花叶病毒悬浮液20 μ L，接种于位置、大小一致的烟草花叶病毒枯斑寄主心叶烟的整片叶子上，使用药用棉签涂抹均勻。接种: 后，使用药用脱脂棉蘸取上述精油制剂涂抹于预先接种的病毒的叶片上，以药液不下滴为宜。以蒸馏水处理为空白对照，宁南霉素溶液(500 μ g/mL)处理为对照药剂。将上述烟苗在温度48°C，湿度70-80%条件下培养3 4d后，记录形成枯斑的数量。每个样品6个重复。抑制率根据下面公式计算 抑制率/C] X 100%
C表示空白对照形成的枯斑数量；T表示处理后形成的枯斑数量。所述的精油制剂应用于烟草花叶病毒的钝化、预防和治疗实验中的效果见表2。实施例3
实施例3除防治烟草花叶病毒的精油制剂的配方与实施例2不同外，其配方见表1，其余试验操作与实施例2相同，不再重述。其钝化、预防和治疗实验中的效果效果见表2。实施例4
实施例4除防治烟草花叶病毒的精油制剂的配方与实施例2不同外，其配方见表1，其余试验操作与实施例2相同，不再重述。效果见表2。
表1 实施例2 -实施例4防治烟萆花叶病毒的精油制剂的配方 \\SB方柠攆草精油陈皮精油吐温二甲基亚砜
权利要求
1.一种防治烟草花叶病毒的精油制剂，它的有效成分是柠檬草精油和陈皮精油。
2.根据权利要求1所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，其特征在于所述的柠檬草精油与陈皮精油的体积比是2 8份4 10份。
3.根据权利要求1或2所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，其特征在于所述的柠檬草精油和陈皮精油均用水蒸气蒸馏法提取得到。
4.根据权利要求3所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，其特征在于所述的柠檬草精油是按下述方法提取得到柠檬草干叶与蒸馏水的比为500g:3L，将柠檬草干叶碎片装入水蒸气蒸馏装置中，注入蒸馏水，浸泡30min，加热沸腾蒸馏60min完毕，收集液面上层油状物，用无水硫酸钠干燥，即得柠檬草精油；所述的陈皮精油是按下述方法提取得到按陈皮与蒸馏水的比为1000g:3L，将陈皮装入水蒸气蒸馏装置中，注入蒸馏水，浸泡池，加热沸腾蒸馏他完毕，收集液面上层油状物，用无水硫酸钠干燥，即得陈皮精油。
5.权利要求1至4中任一所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，还含有乳化剂和扩散剂。
6.根据权利要求5所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂，其特征在于所述的乳化剂和扩散剂及其体积配比是吐温20 2 5份，二甲基亚砜6 10份。
7.权利要求6所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂用于烟草花叶病毒的防治。
8.根据权利要求7所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂在防治烟草花叶病毒的应用， 其特征在于将所述的防治烟草花叶病毒的精油制剂用水稀释至800 1500倍液后喷施在烟草植株上。
全文摘要
本发明公开了一种防治烟草花叶病毒的精油制剂及其应用，属生物农药技术领域的制剂。该精油制剂的有效成分是柠檬草精油和陈皮精油。用本发明的精油制剂对烟草花叶病毒的钝化、预防和治疗效果分别平均达到64.9%，58.7%，42.2%。本发明的精油制剂的有效成分来自纯天然的柠檬草精油和陈皮精油，具有无毒性、无污染、无残留的优点，是环境友好型的产品，能避免农业生产中环境污染及农药残留问题。
文档编号A01P1/00GK102487970SQ20111042984
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者卢敏, 姚雷, 彭云, 徐云, 李忠环, 詹莜国, 韩智强, 高则睿, 高福宏 申请人:云南烟草科学研究院