专利名称：粗柄鸡枞菌种的快速制备方法
技术领域：
本发明涉及一种珍稀野生食用菌粗柄鸡揪(Termitomyces robustus (Beeli.) Heim)的菌种制备方法，属于生物技术领域，具体地说是属于大型真菌菌丝体室内人工培养范畴。
背景技术：
鸡揪菌属(Termitomyces)隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina )、层菌纲( Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑禾斗(Tricholomataceae)，因与白虫义有共生关系，又名蚁巢伞属。鸡揪，又名鸡宗(棕)、伞把菇、鸡肉丝菇、白蚁菇等，它是云南省一种名贵特产野生食用菌，也是世界上一种著名的美味食用菌，其营养丰富，肉质细嫩，味道鲜美，且具有明显的药理作用，深受国内外消费者的喜好及青睐。国内的鸡揪菌主要分布于云南，有报道指出，中国鸡揪菌约M种，其中云南达20种，但近年来由于生态破坏及过度的采挖，云南的鸡揪菌价格一涨再涨，每公斤鲜重售价在300-450元。
自1799 K0ning对蚁巢内菌圃的发现和描述算起，人们对鸡揪菌的科学研究已有两百多年的历史，对鸡揪菌的认识也不断深入，但至今为止，其人工培养仍然难以攻克，尚未见规模化成功栽培的例子。由于鸡揪菌的珍稀及宝贵，其人工驯化栽培一直是科研工作者奋斗的终极目标。目前人工栽培的研究仍然存在较多问题，其中菌丝在人工培养基上生长极其缓慢、难以扩繁、难以批量生产菌种等仍是一个主要问题，它是制约或影响人工培养的前提或基础。粗柄鸡揪是云南的一个主产种，分布于云南的富民、禄劝、武定等地，本发明征对其菌丝培养问题进行了重点突破。发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单，生产成本低，能使鸡揪菌丝快速生长及扩繁的固体菌种制备方法。
实现本发明的技术方案以未开伞的子实体为材料，通过菌丝体诱导、菌丝体扩大培养及其快速繁殖等途径制备栽培种，实现本发明的主要步骤如下(1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体；(2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；(3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. OOg /L、KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4N03 0. ；35 0. 45g/L、KN03 0. ；35 0. 45g /L、维生素B1 2. 00 2. 50mg/ L、琼脂12. 00g/L,控制PH值为4. 0 4. 5，培养温度为24 ~26°C,暗培养14 18天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状，覆盖原组织块，35 40天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状，色泽加深，渐变成浅褐色；(4)菌丝体扩大培养将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养基为马铃薯150. 00 180. 00g/L、葡萄糖 8. 00 10. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. 00g /L、KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 35 0. 45g/L、KN03 0. 35 0. 45g/L、维生素 B1 2. 00 2. 50mg/L、麦芽汁(15. 0 波美) 150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 20g/L,琼脂12. 00g/L,控制PH值为4. 0 4. 5，培养温度为 24 ，暗培养40 45天，菌丝基本长满三角瓶；(5)固体栽培种的制作将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，栽培种培养基为原生境土壤35 45%、麦麸35 45%、蔗糖3. 0 3. 5%、石膏 2. 0 2. 5%、尿素1. 0 2. 0%、草木灰2. 5 3. 0%、羊粪5 10%、牛粪5 10%，将以上原料混均，调节含水量为52 56%，PH值为4. 0 4. 5，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C灭菌60min，冷却后备用，培养温度为M ^°C，暗培养60 70天，菌丝长满培养袋。
本发明的有益效果是采用比较简单的培养基，使菌丝在短期内快速增殖，其特点如下，(1)培养基简单、生产成本低本发明使用的几种培养基都比较简单，母种培养基在 PDA基本培养基上主要增加了钾盐及无机氮，扩大培养基在母种培养基的基础上，只添加了麦芽汁、谷氨酸，栽培种培养基主要利用原生境土及麦麸，三种培养基的成本都很低，这一点非常重要，其关系到以后的生产规模及推广使用等问题；(2)周期短本发明克服了菌丝在固体培养基上生长速度缓慢、难以扩繁等问题，培养周期大大缩短；(3)便于推广所培养的固体栽培种方便推广和使用。
具体实施方式
以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实例一野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体； 将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO30.35g/L, KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 2. 50mg/L、琼脂 12. 00g/L，控制 PH 值为 4. 5，培养温度为^TC，暗培养15天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状，覆盖原组织块，35天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状，色泽加深，渐变成浅褐色；将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养基为马铃薯150. 00g/L、葡萄糖8. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl21.00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g/L、维生素 B1 2. 50mg/L、麦芽汁(15. 0波美)180ml，谷氨酸0. 20g/L,琼脂12. 00g/L,控制PH值为4. 5，培养温度为26°C，暗培养40天，菌丝基本长满三角瓶；将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，栽培种培养基为原生境土壤45%、麦麸35%、蔗糖3. 5%、石膏2. 5%、尿素1. 0%、草木灰3. 0%、羊粪5%、牛粪5%，将以上原料混均，调节含水量为52%，PH值为4. 5，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C灭菌60min，冷却后备用，培养温度为^°C，暗培养60天，菌丝长满培养袋。
实例二野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体； 将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50g/L、KH2PO4 0. 60g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KN03 0 . 45g /L、维生素 B1 2. 00mg/L、琼脂 12. 00g/L，控制 PH 值为 4. 5，培养温度为25°C，暗培养18天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状，覆盖原组织块，38天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状，色泽加深，渐变成浅褐色；菌丝体扩大培养将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养基为马铃薯180. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、 MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50g /L、KH2PO4 0. 60g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KNO3 0. 45g/L、维生素 B1 2. OOmg/L、麦芽汁(15. 0 波美)150ml，谷氨酸 0. 15g/L，琼脂 12. OOg/L,控制 PH 值为 4. 5， 培养温度为25°C，暗培养45天，菌丝基本长满三角瓶；固体栽培种的制作将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，栽培种培养基为原生境土壤35%、麦麸45%、蔗糖3. 0%、石膏2. 0%、尿素1. 5%、草木灰2. 5%、羊粪6%、牛粪5%，将以上原料混均，调节含水量为56%，PH值为4. 5，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C灭菌60min，冷却后备用，培养温度为 25 °C，暗培养65天，菌丝长满培养袋。
实例三野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体； 将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 80g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0.40g/L、KN03 0 . 40g /L、维生素 B1 2. 20mg/L、琼脂 12. 00g/L，控制 PH 值为 4. 0，培养温度为M°C，暗培养17天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状，覆盖原组织块，40天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状，色泽加深，渐变成浅褐色；将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养基为马铃薯170. 00g/L、葡萄糖9. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl20. 80g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0. 40g/L、KNO3 0. 40g/L、维生素 B1 2. 20mg/L、麦芽汁 (15.0波美)170ml，谷氨酸0. 10g/L，琼脂12. 00g/L，控制PH值为4.0，培养温度为24°C, Hf 培养42天，菌丝长满三角瓶；将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，栽培种培养基为原生境土壤40%、麦麸40%、蔗糖3. 0%、石膏2. 0%、尿素2. 0%、草木灰3. 0%、羊粪5%、牛粪5%，将以上原料混均，调节含水量为M%，PH值为4. 0，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C灭菌60min，冷却后备用，培养温度为M°C，暗培养70天，菌丝长满培养袋。
实例四野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体； 将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1. 00g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO30.45g/L、KN03 0 . 45g /L、维生素 B1 2. 00mg/L、琼脂 12. 00g/L，控制 PH 值为 4. 2，培养温度为25°C，暗培养14天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状，覆盖原组织块，37天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状、色泽加深，渐变成浅褐色；将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养基为马铃薯180. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、MgS04l. 00g/L,CaCl21.00g /L、KH2PO4 0. 40g/L、NH4NO3 0. 45g/L、KNO3 0. 45g/L、维生素 B1 2. OOmg/L、麦芽汁 (15. 0波美)160ml，谷氨酸0. 20g/L,琼脂12. OOg/L,控制PH值为4. 2，培养温度为25°C，暗培养44天，菌丝长满三角瓶；将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，栽培种培养基为原生境土壤38%、麦麸37%、蔗糖3. 5%、石膏2. 5%、尿素1. 0%、草木灰3. 0%、羊粪8%、牛粪7%，将以上原料混均，调节含水量为55%，PH值为4. 2，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C灭菌60min，冷却后备用，培养温度为25°C，暗培养63天，菌丝长满培养袋。
权利要求
1.一种珍稀野生食用菌粗柄鸡揪(Termitomyces robustus (Beeli. )Heim)菌种制作的方法，其特征为，采用未开伞的子实体诱导菌丝，对菌丝体进行优化扩大培养，使其快速地大量繁殖，主要包括下列步骤(1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗状、菌盖较肥厚的成熟子实体；(2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 20 0. 40cm2的小块；(3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面母种培养基表面，培养温度为M ^TC,暗培养14 18天，原组织块上萌生少量白色的菌丝，菌丝逐渐增多呈球状， 覆盖原组织块，35 40天，菌丝聚集成颗粒状、小团块状，色泽加深，渐变成浅褐色；(4)菌丝体扩大培养将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，将其轻轻嵌入500ml三角瓶的扩大培养基表面，培养温度为M ，暗培养40 45天，菌丝基本长满三角瓶；(5)固体栽培种的制作将以上长势良好的原种菌丝体挑出，转接入栽培种的袋装固体培养基中，培养温度为M ^°C，暗培养60 70天，菌丝长满培养袋。
2.根据权利要求1所述的鸡揪菌种制作方法，其特征在于步骤(3)中的母种培养基为马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1. 00g /L、KH2PO40.40 0. 60g/L、NH4N03 0. ；35 0. 45g/L、KN03 0. ；35 0. 45g /L、维生素B1 2. 00 2. 50mg/ L、琼脂12. 00g/L，控制PH值为4. 0 4. 5。
3.根据权利要求1所述的鸡揪菌种制作方法，其特征在于步骤(4)中的扩大培养基为马铃薯 150. 00 180. 00g/L、葡萄糖 8. 00 10. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 0. 50 1.00g /L, KH2PO4 0. 40 0. 60g/L、NH4NO3 0. 35 0. 45g/L、KNO3 0. 35 0. 45g/L、维生 SB1 2. 00 2. 50mg/L、麦芽汁(15. 0 波美)150 180ml，谷氨酸 0. 10 0. 20g/L，琼脂 12. 00g/L,控制 PH 值为 4. 0 4. 5。
4.根据权利要求1所述的鸡揪菌种制作方法，其特征在于步骤(5)中的栽培种培养基为原生境土壤；35 45%、麦麸；35 45%、蔗糖3. 0 3. 5%、石膏2. 0 2. 5%、尿素1. 0 .2.0%、草木灰2. 5 3. 0%、羊粪5 10%、牛粪5 10%，将以上原料混均，调节含水量为52 56%，PH值为4. 0 4. 5，得固体培养基，将其分装于塑料菌种袋中，每袋装约700ml，120°C 灭菌60min，冷却后备用。
全文摘要
本发明涉及一种珍稀名贵野生食用菌粗柄鸡枞的菌种制备方法，属于大型真菌培养技术领域。其特征为以未开伞的子实体为材料，通过菌丝体诱导、菌丝体扩大培养及快速繁殖等途径制备固体栽培种。鸡枞菌丝比较特殊，在固体培养基上生长极其缓慢、难以扩繁、更难以在栽培基质中生长，难以生产批量菌种，这是制约或影响人工培养的因素之一。本发明以云南的主产种粗柄鸡枞为例，对菌丝的固体培养技术进行了创新性突破，使菌丝能快速生长繁殖，培养周期大大缩短，且生产出了袋装栽培种。本发明所使用的母种、扩大及栽培种三种培养基，成份简单易得，成本低，便于推广，如栽培种培养基主要利用原生境土及麦麸，这为今后人工驯化栽培等提供了条件。
文档编号C05G3/00GK102487726SQ201110431260
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者张丽萍, 张曦予, 李宗菊, 李文莲, 杨振升, 陶乔双 申请人:云南大学