专利名称：一个甘蓝型油菜缺磷诱导表达启动子的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种油菜BnPR2基因启动子及其应用，本发明提供了一个油菜缺磷诱导表达启动子及应用。
背景技术：
磷是植物生长发育必需的大量营养元素，它不仅是植物体内核酸、磷脂、ATP等重要分子的组成成分，而且在能量传递和代谢途径调控中发挥着一系列重要作用。植物主要利用根以磷酸根的形式吸收磷。虽然土壤中磷的总量非常丰富，但由于磷酸根很容易被土壤颗粒以及金属离子吸附固定，所以土壤中磷的生物有效性非常低，缺磷经常成为限制作物产量的因素。施用磷肥成为目前保障作物产量的重要栽培措施。然而，施入土壤的磷肥当季利用率很低，往往随水土淋失而进入水体，造成了潜在的水体富营养化等环境问题。另外，磷矿属不可再生资源，估计60-90年后，易于开采的磷矿将被耗竭。为了实现农业的可持续发展，必须提高磷肥的利用效率，减少磷肥的施用量。培育耐低磷或磷高效的作物品种是一项经济有效且环境友好的办法。Gao等(Gao N, Su Y，Min J，Shen W,Shi ff.Transgenic tomato overexpressing ath_miR399d has enhanced phosphorusaccumulation through increased acid phosphatase and proton secretion as well asphosphate transporters.Plant and Soil, 2010, 334:123-136)将拟南芥miR399d 在番爺中超表达。转基因植株提高了磷转运子的表达，磷酸酶的活性和质子的分泌，最终表现出较高的憐吸收和叶片憐浓度。Li!等(LiiJ, Gao X, Dong Z, YiJ, An, L.1mproved phosphorusacquisition by tobacco through transgenic expression of mitochondrial malatedehydrogenase from Penicillium oxalicum.Plant Cell Reports, 2012, 31:49-56)的石开究表明，超表达线粒体苹果酸脱氢酶(MDH)的转基因烟草提高了对铝磷、铁磷和钙磷的利用能力，增加了对的磷吸收，累积了更多的生物量。现有的植物基因工程通常采用CaMV 35S、Ubi和Actl等组成型启动子。由于组成型启动子在不同组织和不同环境 条件下都能驱动下游基因的表达。这不仅浪费能量，而且影响植物正常的生理代谢。因此通过诱导型启动子或组织特异型启动子控制实现导入基因的环境诱导表达或组织特异表达具有重要意义。诱导型启动子(inducible promoter)在正常生长条件下不驱动下游基因的转录或者转录水平很低，而在某些物理、化学或生物信号的刺激下，可以大幅度地提高基因的转录水平。诱导型启动子的优势在于可根据需要在植物特定的发育阶段或生长环境，让其接受外界信号而激活下游基因表达；也可以去除诱导信号，停止目的基因表达。诱导型启动子在基础研究和生产实践中均具有重要的应用价值。本发明人通过研究甘蓝型油菜缺磷诱导表达基因，获得了一个缺磷诱导表达启动子，该启动子能够用于耐低磷或磷高效作物的培育，也可以用于缺磷诱导表达基因调控机制研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个缺磷诱导表达启动子，该启动子来源于甘蓝型油菜(Brassica napus),其位于基因BnPR2的上游。本发明所涉及的技术方案是:利用甘蓝型油菜缺磷诱导表达基因BnPR2的基因组序列在芸薹属序列数据库中进行BLAST分析，获得与BnPR2序列一致的白菜BAC。根据BAC序列设计引物，扩增BnPR2的上游序列。然后将该序列与报告基因⑶S融合，构建重组表达载体PBnPK2:⑶S，通过农杆菌介导转化拟南芥，经过抗生素筛选，PCR鉴定获得含有BnPR2启动子的转基因植株。在正常和缺磷、缺氮、缺钾、缺硫、缺铁条件下培养转基因植株，检测不同缺素植株的GUS活性，结果只有缺磷植株显蓝色，正常和其它元素缺乏植株没有蓝色显现，说明BnPR2启动子具有缺磷诱导性。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的甘蓝型油菜缺磷诱导表达启动子的核苷酸序列，其中l_1459bp是本发明的启动子序列，第1460-1501是基因BnPR2的部分核苷酸序列。图1是重组表达载体PBnPK2:GUS的T-DNA区示意图。该载体含卡那霉素(Kna)抗性筛选基因。图2是ΡΒηΡΚ2:⑶S表达载体的酶切鉴定图。图3是不同元素缺乏条件下P_2:GUS转基因拟南芥的⑶S染色结果。其中A，为缺氮处理；B为缺磷处理；C为缺钾处理；D为缺硫处理；E为缺铁处理；F为对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不是限制本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，例如参见《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，北京)。引物合成由北京奥科生物技术有限责任公司完成，序列测定由华大基因科技股份有限公司武汉测序部完成。实施例lBnPR2启动子的克隆(I)基因BnPR2是发明人从甘蓝型油菜(Brassica napus,鄂油长荚；刘定富等，甘蓝型油菜特长荚突变体的发现和鉴定.湖北农学院学报，1994，14(2):1-5)中分离到的一个缺磷诱导表达基因。正常条件下在油菜根中检测到该基因微弱表达，在叶片中没有检测到表达；缺磷条件下该基因在根和叶中表达量急剧上升。通过对BnPR2的基因序列进行 BLAST 分析(http: //brassica.bbsrc.ac.uk/BrassicaDB/blast_form.html)，在BrassicaDB数据库中找到与BnPR2序列一致的白菜BAC (登录号为⑶695313)。根据该BAC序列设计下列引物对:PF: 5 ’ -CCTGCAGGAATTTTAGAATGTTGTGTCG-3，，PR: 5 ’ -TCTAGATCTTTTGATTTGTGGTGTTGTGC-3，。其中带下划线的碱基为添加的限制性内切酶位点，引物PF添加了一个Sda I酶切别位点，引物PR添加了一个Xba I酶切位点。以甘蓝型油菜 (鄂油长荚)基因组DNA为模板，利用高保真DNA聚合酶KOD plus扩增基因BnPR2的上游序列。PCR反应体系为:DNA (50ng/ μ L) 4.0 μ L，ddH20 9.0 μ L, IOX PCR 缓冲液 2.0 μ L, MgSO4 (25mM) 1.0 μ L，dNTP(2.0mM)2.0μ L,引物 PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L，KOD-plus (IU/μ L) 0.4 μ L0 PCR缓冲液，MgSO4, dNTP，KOD-plus DNA聚合酶均来自东洋纺(上海)生物科技有限公司。PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，58°C退火30秒，68°C延伸2分钟，35个循环；最后68°C保温5分钟。PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，得到大小为1500bp左右的单一条带。(2)利用道普公司的PCR产物回收试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体方法参见道普公司该试剂盒的说明书。随后对PCR产物末端加“dA”，与pGEM T Easy载体(购自武汉洁洋盛生物科技有限公司)连接。载体试剂盒来自Promega公司，具体方法参见该公司试剂盒说明书。然后转化大肠杆菌DH5ci，挑阳性克隆送华大基因科技股份有限公司武汉测序部测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列长度为1501bp。与已获得的BnPR2基因组DNA序列相比较，显示该序列与基因BnPR2的5’端有42个碱基重叠，所以认为克隆到的长1501bpDNA片段是基因BnPR2的候选启动子。测序结果显示，该启动子的序列如SEQ ID NO:1中第l_1459bp所示，在该启动子的下游是基因BnPR2的部分核苷酸序列(5，端42个碱基)，SEQ IDNO:1中的第1460位碱基“G”为转录起始位点。BnPR2启动子属于典型的TATA盒型启动子，第1428位碱基为TATA框。利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.g0.jp/PLACE/signalscan.html)对BnPR2启动子序列进行顺式作用元件分析，显示其中含有响应不同环境信号或控制组织特异表达的顺式作用元件，其中与磷营养有关的是3个PlBS元件。 实施例2植物表达载体的构建为确定BnPR2启动子的表达特性，构建含有BnPR2启动子和报告基因⑶S的植物表达载体。具体方法是:(I)选择实施例1中启动子序列完全正确的克隆，在含有50μ g/mL氨苄的LB培养基中大量摇菌，利用道普公司的小量质粒提取试剂盒提取质粒，具体方法参见道普公司该试剂盒的说明书。随后用限制性内切酶Sda I和Xba I双酶切含有BnPR2启动子的质粒和PBI121载体(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室代书桃惠赠，在以前华中农业大学的专利申请中已提及该载体)。酶切体系如下:含BnPR2启动子的质粒或pBI121载体32.4 μ L, IOX Sda I 缓冲液 4.0 μ L，内切酶 Sda I 1.2 μ L，内切酶 Xba I 2.4 μ L0 限制性内切酶及缓冲液来自MBI公司。37°C酶切10小时。酶切产物在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，用手术刀片切下目标条带，用道普公司的凝胶回收试剂盒予以回收，具体方法参见道普公司该试剂盒的说明书。(2)连接回收产物，连接体系如下:BnPR2启动子片段(序列如表SEQ ID NO:1所示，长150αρ)8.0μ ，ρΒΙ121片段(具有除CaMV 35S启动子外的其它所有元件和序列，长13923bp) 8.0yL, IOX T4缓冲液2.0 μ L，Τ4连接酶2.0 μ L。连接酶及缓冲液来自MBI公司。混匀连接体系，4°C连接16小时。
(3)将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α中。将转化产物涂布在含50 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养16小时。挑单克隆于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养10小时。用引物对PF和PR(序列见实施例1)来检测菌液。PCR反应体系为:菌液 2.0 μ L，ddH20 13.9 μ L，IOX PCR 缓冲液 2.0 μ L，dNTP (IOmM) 0.4 μ L，引物PF (10 μ Μ) 0.8 μ L，引物 PR(10 μ Μ) 0.8 μ L, rTaq (5U/ μ L) 0.1 μ L。其中 rTaq 聚合酶，PCR 缓冲液购自宝生物工程大连有限公司，dNTP购自Roche公司。PCR扩增条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸2分钟，35个循环；最后72°C保温5分钟。PCR产物在1.0 %的琼脂糖凝胶中电泳，片段大小与BnPR2启动子相同，且呈单一条带的克隆被认为是阳性克隆。挑选该阳性克隆，摇菌，提质粒，进一步用Sda I和XbaI双酶切鉴定插入片段大小是否与BnPR2启动子符合，结果见图2。酶切体系及方法同实施例2中的步骤(I)。将构建好的植物表达载体命名为PBnPK2:GUS。实施例3利用植物表达载体PBnPK2:⑶S转化拟南芥(I)农杆菌感受态的制备:接种农杆菌GV3101 (华中农业大学园艺林学学院张金智惠赠)单菌落于50mLYEB培养液中(牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L,蔗糖5.0g/L,硫酸镁0.5g/L，用NaOH调pH至7.0)。28 V，200转/分钟振荡培养至OD26tl为0.5左右，冰浴30分钟。5000转/分钟离心5分钟收集菌体，倒掉上清液，然后用IOmL 0.5mol/L NaCl悬浮菌体。再次离心，菌体悬浮于ImL 20mmol/L CaCl2溶液中。取100 μ L菌液分装到冰冻的1.5mL离心管中，液氮速冻，并保存于_80°C冰箱中。(2)冻融法转化农杆菌GV3101:取l.0yg实施例2构建的植物表达载体PBnPK2:⑶S，加入100 μ L冰上解冻的感受态农杆菌中，轻轻混合，冰浴30分钟。然后在液氮中迅速冻I分钟，37°C水浴融化5分钟，冰浴2分钟，加入ImL YEB培养液(成分同上)。280C，100转/分钟摇动培养3小时。5000转/分钟离心3分钟，倒去大部分上清液，剩下100 μ L左右重悬菌体。涂在含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB固体培养基(成分同上，只是按常规计量添加琼脂，其他成分同YEB培养液)上，28°C培养2天。挑取单菌落于含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素的YEB培养液中，28°C，200转/分钟摇菌。用实施例1中的引物对PF和P R来确定BnPR2启动子的存在。PCR反应条件参见实施例2中的步骤(3)。(3)转化拟南芥。拟南芥的转化采用花序浸润法(floral dip)，参照Clough 和 Bent (Clough S J, Bent A F.Floral dip:A simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The PlantJournal, 1998，16:735-743)报道的方法并略作修改进行。挑取含有PBnPK2:⑶S重组表达载体的农杆菌单菌落接入3mL YEB液体培养基中(含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素)。28°C，200转每分钟摇菌I天，再将得到的菌液按2% (体积比)接入150mLYEB液体培养基(含有50 μ g/mL利福平和50 μ g/mL卡那霉素)中，28°C，200转每分钟振摇使农杆菌的浓度达到OD6tltl约为1.8。在4°C下5000g离心15分钟，倒掉上清液，菌体重悬于含有
0.02% Silwet-77 (购自LEHEL SEEDS公司)的5%蔗糖溶液中，溶液最终的OD600约为0.8。将生长良好的拟南芥花序浸泡在菌液中5-10秒，直立并用黑色塑料袋包裹，保湿24小时。除去塑料袋，恢复正常培养植株，约一个月后收获Tl代种子。实施例4转基因拟南芥的筛选与鉴定(I)阳性苗的筛选将收获的Tl代拟南芥种子用70% (体积比)乙醇消毒I分钟，50% (体积比)的84消毒液(市售产品)消毒5分钟，再用灭菌去离子水清洗5次，均匀铺在0.6%琼脂的1/2MS培养基(附加50mg/L卡那霉素)上进行筛选。约10天可区分出阳性苗(转化苗)和野生型苗(非转化苗)。可见阳性苗根正常生长，叶片呈绿色；而野生型苗根几乎不能生长，叶片呈黄白色，逐渐死亡。将筛选到的阳性苗移栽到营养土(蛭石和泥炭按体积比1:1混合而成)中生长。(2)阳性苗的PCR鉴定待阳性苗长出数片莲座叶，取其叶片，提取基因组DNA(方法见 Doyle JJ, Doyle J L.1solation ofplant DNA from fresh tissue.Focus，1990，12:13-15)。用实施例1中的引物对PF和PR来确定BnPR2启动子的存在(PCR反应条件参见实施例2)。利用引物对⑶IF (5 ' GCGTTTCGATGCGGTCAC 3 ')和⑶IR(5 ' GCGAGGTACGGTAGGAGTTGG 3 ')来检测报告基因⑶S是否存在。PCR反应体系为:转化苗的 DNA(50ng/ μ L) 2.0 μ L，ddH20 13.9 μ L，IOX PCR 缓冲液 2.0 μ L，dNTP (IOmM) 0.4 μ L,弓 I 物⑶IF (10 μ Μ) 0.8 μ L，弓 I 物⑶IR (10 μ Μ) 0.8 μ L，rTaq (5U/μ Ο.1uL0其中rTaq聚合酶，PCR缓冲液购自宝生物工程大连有限公司，dNTP购自Roche公司。PCR扩增条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分钟，35个循环；最后72°C保温5分钟。只有BnPR2启动子和报告基因GUS都存在的植株才被认为是真正的转基因植株，然后正常培养，至收获T2代种子。T2代种子经过卡那霉素筛选阳性苗和营养土培养(方法同实施例4)，获得T3代种子。T3代种子经过卡那霉素筛选没有分离，全部显绿色的被认为是纯合转基因植株，将用于进一步的GUS组织化学分析。实施例5PBnFK2:⑶S转基因拟南芥的⑶S组织化学分析将获得的纯合Τ3代转基因拟南芥先在1/4营养液中培养15天(营养液配方见后)。营养液配方米用改良的Hoagland和Arnon营养液配方，该营养液(又称标准营养液)的成分及浓度如下:Ca (NO3)2 4.5mM, KNO3 4.0mM, KH2PO4 1.0mM，MgSO4 2.0mM，H3BO346.0 μ M，MnCl2 9.0uMjCuCI2 0.3 μ M, ZnCl2 0.8 μ Μ, Na2MoO4 0.1 μ M和 EDTA-Fe 50.0 μ Μ。然后转移到1/2的上述标准营养液中培养10天。培养期间每5天更换一次新鲜标准营养液(成分同上)。随后将一部分植株转移到缺磷，缺氮，缺钾，缺硫或缺铁营养液中培养，另一部分植株仍旧在标准营养液(成分及浓度同上)中培养，作为对照。在缺氮营养液中用4.5mM CaSO4代替Ca (NO3)2，用2.0mM K2SO4代替KNO3，其它成分及浓度同上；在缺磷营养液中用0.5mM K2SO4代替KH2PO4，其它成分及浓度同标准营养液；在缺钾营养液中用1.0mMNaH2PO4代替KH2PO4,用4. 0mM NaNO3代替KNO3,其它成分及浓度同标准营养液；在缺硫营养液中2.0mMMgCl2代替MgSO4，其它成分及浓度同标准营养液；在缺铁营养液中直接去掉EDTA-Fe，其它成分及浓度同标准营养液。每种缺素处理采用3个独立的转基因株系，每个株系包括2单株。所有植株都生长在温室中，每天14h光照/IOh黑暗，光强约为200μπιΟ1photonsnT2s4，温度为 18-23°C，相对湿度 60-80%。缺素处理3天后对植株进行GUS染色(按照常用方法)。方法是，首先将植株放入含有IOmL常用染色液的离心管中，保证整个植株全部浸入溶液中。染色液的成分及浓度如下:lmg/mL的X-Gluc (5-溴-4-氯-3-卩引哚-β -葡萄糖苷酸)，100mmol/L的磷酸盐缓冲液(0.61 体积的 200moI/LNa2HPO4 与 0.39 体积的 200moI/LNaH2PO4 混合而成，pH 7.0)，10mmol/L 的 Na2EDTA, 0.5mmol/L 的 K3 [Fe (CN) 6]和 K4 [Fe (CN) 6]，20 % 的甲醇，0.1 % 的 TritonX-100。然后37°C避光染色10小时。染色结束后用70% (体积比)乙醇对植株脱色3次，再用无水乙醇脱色数次，至叶片绿色褪去。结果显示只有缺磷处理拟南芥呈现蓝色(见图3，B)，正常培养以及缺氮、缺钾、缺硫和缺铁处理的拟南芥都没有蓝色显现(见图3中除图3，B外其他图像)，结果表明本发明分离克隆的BnPR2启动子受缺磷特异性诱导表达。
权利要求
1.一个甘蓝型油菜缺磷诱导表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.权利要求1所述的启动子在培育耐低磷或磷高效植物中的应用。
3.权利要求2的应用，其中包括 在培育耐低磷或磷高效甘蓝型油菜品种中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。从甘蓝型油菜中克隆得到一个缺磷诱导表达启动子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1中第1-1459碱基所示。将该启动子与报告基因GUS融合转化拟南芥，GUS组织化学分析表明该启动子只在缺磷条件下具有活性，在正常、缺氮、缺钾、缺硫以及缺铁条件下都不具有活性。该启动子除了应用于耐低磷或磷高效作物的培育外，还可以用于缺磷诱导表达基因调控机制研究。
文档编号A01H5/00GK103194447SQ20121000661
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者徐芳森, 杨广哲 申请人:华中农业大学