专利名称：一种冰缘植物蛋白及其编码序列与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种冰缘植物冷诱导蛋白及其编码序列在提高拟南芥抗冻性中的应用。
背景技术：
低温是影响植物地理分布和生长季节的最主要的环境因素之一，低温冻害严重地影响着农作物的生长状况和产量(Thomashow 1999)。大量的研究表明，冷响应基因的表达对植物的抗冻有着至关重要的作用(Gong et al. 2002; Hsieh et al. 2002 ；Knight etal. 1999; Thomashow 1999; Tahtiharju and Palva 2001)。冷响应基因编码种类繁多的蛋白，如植物呼吸、碳循环、脂类、苯丙素和抗氧化代谢过程相关的酶，还有调控基因表达的转录因子，抗冻蛋白等(Guy 1990;Thomashow 1999; Mohapatra et al. 1989)。 研究表明，低温胁迫可以诱导CBFs(C_repeat binding factors,尚无规范的中文术语)的表达，在CBF的过表达转基因植物如拟南芥，番茄，水稻等，CK/ (Cold responsive,尚无规范的中文术语)基因被大量诱导，抗冻性大大增加(Stockinger et al. 1997; Liuet al. 1998;Hsieh et al. 2002 ；0h et al. 2005)。在拟南芥中，ICEl (Inducer of cbfexpression 1，尚无规范的中文术语)的过表达诱使CBF3、CBF2和COR基因的表达量升高，该转基因植株的耐冻性也得到了极大的增强(Chinnusamy, V. et al. 2003)。在豌豆中，DNA helicase 45 (简称H)H，尚无规范的中文术语)和TOH47的过表达可以增加转基因豌豆的抗冻性(Vashisht，A. A. et al. 2005)，同样，PDH45过表达的转基因烟草也可以耐受更低的温度(Sanan-Mishra, N. et al. 2005)。CbCINPl {Chorispora bungeana cold induced novel protein ム尚无规范的中文术语)基因编码冰缘植物离子芥bungeana，又名Chorispora exscapa ) 一个新的受低温诱导而产生的蛋白CbCINPl。目前，对于此类蛋白国内外还没有相关的研究报道，与其同源性较高的是拟南芥的ー个功能未知的蛋白DUF677(尚无规范的中文术语)，目前仍未有人掲示其功能。高山离子芥/Wflgeafla)是十字花科离子芥属多年生植物,分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。高山离子芥在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，该地区海抜3600 3900m。年平均气温在_5 _7°C之间，6 8月平均气温为3. 6°C，气温日差较大，是ー种伴随反复冻融的冰冻环境。并且处于迎风坡，流石碓中砾石保水性差，时常造成干旱胁迫。高山离子芥在外部形态结构和生态策略上没有显著的抗性特征，为了耐受长期低温、强紫外、大风和生理干旱，适应这些不利的环境条件，势必通过表达抗性基因来維持自身的生理代谢和生长发育，以避免或减轻严酷的环境胁迫的危害。高山离子芥与拟南芥同属于十字花科，两者的基因组具有较高的保守性。由于高山离子芥处于冰缘环境，积累了适应低温的有益突变，所以克隆高山离子芥的冷诱导基因CbCINPl并应用到转基因作物中提高其抗冻性具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的高山离子芥冷诱导基因CbCINPl。本发明的另ー个目的在于提供ー种培育耐低温的转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到耐低温的转基因植物。本发明的又ー个目的在于提供ー种由所述冷诱导基因ぬ用于转化植物以产生转基因植物的用途。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
本发明克隆了高山离子芥的冷诱导基因ひCVMV，所述冷诱导基因CbCINPl具有SEQID NO: I所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO 1由1176个碱基组成。该冷诱导基因的编码基因能够编码CbCINPl蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO 2由391个氨基酸组成。本发明中的CbCINPl基因和同源性关系最近的基因AT1G18740 (拟南芥的未知功能的基因)只有87%的同源性(如图1)，其编码的蛋白质与同源性关系最近的蛋白质(拟南芥未知功能蛋白DUF677)只有90%的同源性(如图2)。拟南芥AT1G18740基因及其编码的蛋白质DUF677功能未知。本发明对冷诱导ひ基因进行了鉴定。将高山离子芥的愈伤组织在零下4度处理不同时间，收集材料，并提取RNA。之后将RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR，根据得到的Ct值，利用Pfaffl method (Pfaff 1，2001)来计算在零下4度不同的处理时间CbCINPl基因表达量的变化，结果见图3，由图可知，在低温下ぬ基因被大量诱导，在6小时达到高峰，为对照的7倍之多，在48小时后恢复到接近正常水平。证明了该基因能快速响应低温胁迫，是ー种冷诱导的基因。含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、PCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携帯有本发明与植物耐缺铁相关蛋白编码基因
的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥等双子叶植物。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加エ，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除芳剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本发明所提供的耐低温的转基因植物的方法，是将上述与植物冷诱导相关蛋白的编码基因CbCINPl导入植物中，得到耐低温的转基因植物。本发明将CbCINPl基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图4所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用花序浸染的方法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如拟南芥。
本发明验证了转基因植株的耐低温，结果显示(图5)，CbCINPl过表达的转基因拟南芥(撕-ひ67}^7)在零下4度的离子渗透率远低于野生型，说明由于CbCINPl蛋白的过表达降低了植物细胞受到低温的损伤，即CbCINPl蛋白的过表达可以增强植物的抗冻性。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻的作物品种具有重要的理论及实践意义。本发明还通过基因改造技术研究了转基因植株中冷诱导蛋白CbCINPl的亚细胞定位。'塔CbCINPl基因的cDNA构建在CaMV35s启动子和绿色荧光蛋白GFP的下游，得融合GFP的表达载体(其图谱如图6所示)，通过PEG转化拟南芥原生质体，在激光共聚焦显微 镜下观察CbCINPl蛋白的亚细胞定位。结果显示(图7)，发现该基因所编码的蛋白主要定位于细胞核和细胞质膜上。
图I高山离子芥基因核苷酸序列在NCBI同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。图2高山离子芥CbCINPl蛋白的氨基酸序列在NCBI同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。图3高山离子芥在零下4度不同低温处理时间的表达量变化。图4构建的过表达载体图谱，图5对照和转基因植株抗冻性的比较。图6构建的融合GFP的表达载体， WCA3-CbCINPl。图7 CbCINPl蛋白的亚细胞定位。
具体实施例方式在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chrispora bungeana)(西部地区特色植物种质资源数据平台)和拟南芥(Arabidopsis thaliana, Col-O)(Arabidopsis Biological Resource Center, Stock No. CS28166)。实施例I
高山离子芥冷诱导蛋白编码基因CbCINPl序列的克隆
利用RNA提取分离试剂(Trizol, Invitrogen)分离高山离子芥愈伤组织总RNA,其具体方法是收集高山离子芥愈伤组织lOOmg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入ImlTrizol试剂,充分混勻，吸入到ー个I. 5ml的离心管中；室温放置5min ;加入0. 2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min ;4°C，12000g离心15min ;上清水相转移到一个新的I. 5ml离心管中，加入0. 5ml异丙醇混匀，40C，12000g离心IOmin沉淀RNA ；RNA沉淀用Iml 75%こ醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，_70°C保存备用。根据抑制性消减杂交技术、基因芯片技木、Race技术获取该基因全长序列，然后利用生物信息学技术，设计以下引物
5’端引物GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCCAGCAACGGATTTTCAG,(其中划线序列为Invitrogen Gateway 系统 attBl 序列)；
3’端引物
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAAAGAGAATCAAGACTCTCTG,(其中划线序列Invitrogen Gateway 系统 attB2 序列)。通过RT-PCR扩增得到CbCINPl的cDNA序列，具体方法是依据市售试剂盒PlantRT-PCR Kit 2. 01 ( TaKaRa, Japan)的用户手册进行。1-2 u g 总 RNA(大约 1-2 U I)和Kit 的各种反转录试剂混合(MgCl2 4u I ；10XRNA PCR Buffer 2u I ；RNase Inhibitor 0. 5 u I ；RNase free Water 8. 5 U I ； dNTP Mixture 2 U I ； Reverse Transcriptase Iul ；01igodT-Adaptor I u I)。混勻后，42 °C 30 min ；99°C 5min ；5°C 5min,完成反转录反应。吸取2 ill反转录产物，作为模板进行PCR反应94°C 2min后进入扩增程序94°C lmin、57°C30min、72°C I. 5min, 30个循环后，72°C 7min。扩增得到的cDNA序列自起始密 码子到终止密码子总长1176个碱基，编码391个氨基酸，根据the 1997 IUPAC standardatomic weights, assuming pH = 7. 0 计算分子量为 44. 567kD,根据 ExPASy's ComputePI/Mw program计算等电点为7. 73。本发明中的CbCINPl基因和同源性关系最近的基因AT1G18740 (拟南芥的未知功能的基因)具有87%的同源性(如图1)，其编码的蛋白质与同源性关系最近的蛋白质(拟南芥未知功能蛋白DUF677)具有90%的同源性(如图2)。实施例2
高山离子芥冷诱导基因ぬ的鉴定。通过生物信息学的方法进行序列分析，设计Real-time PCR的引物序列。基因。上游弓I 物AACCACAATAATCAGAATCAC。下游引物CTAAGTTGCTCGCTAAGG。内參基因CbACTIN。上游引物GGATGCTTACGITGGTGACGA。下游引物TCTCCATGTCATCCCAGTTGC。在零下4度处理离子芥的愈伤组织，分别在0，1，3，6，12，24，48，72小时，收集材料，提取RNA进行反转录成cDNA (方法同实施例1)，按照市售iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)试剂盒的说明预混反应试剂(I ii I cDNA模版，10 y I Supermix,浓度为10 y M的上、下游引物各Iu 1，7 Ul去离子水)。PCR反应程序94°C预变性2min后进入扩增程序94 0C 30s, 57 0C 10s、72°C 20s 40个循环，后进入溶解程序由60°C升到95 °C，每个温度保温10s。根据得到的Ct值,利用Pfaffl method (Pfaffl, 2001)来计算在-4°C不同的处理时间CbCINPl基因表达量的变化，结果见图5，由图可知，在低温下CbCINPl基因被大量诱导，在6小时达到高峰，为对照的7倍之多，在48小时后恢复到接近正常水平。证明了该基因能快速响应低温胁迫，是ー种冷诱导的基因。实施例3
转CbCINPl基因植株的培育及抗冻性的測定。离子芥CbCINPl基因植物过表达载体的构建将测序验证过的实施例I得到的片段通过BP反应重组到pDONR/Zeocin载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞中，经20 mg /L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过LR反应将CbCINPl基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，经50 mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体(如图 3)。农杆菌介导的转化将构建好的过表达质粒通过电击的方式(电压2400V，电容25 u F，阻抗200 Q，电击杯Imm)转化农杆菌GV3101，用10mg/l利福平+50mg/l卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，将拟南芥的花序浸染PMDC32-fi^7M^成功转化的农杆菌，获得转基因CbCINPl的拟南芥备选植株。转基因株系的筛选自转基因拟南芥备选株系收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/l潮霉素的MS平板上进ー步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CbCINPl过表达的拟南芥T2代株系iOE-CbCINPl \细胞膜的选择透性是维持细胞生理功能的最重要的条件之一，低温冻害会造成细胞膜的机械损伤和膜脂过氧化作用，从而增大细胞膜的通透性。细胞质膜透性的测定常作为植物抗逆研究中的ー个重要生理指标。当质膜的选择透性因逆境伤害而明显改变或丧失时，细胞内的物质(尤其是电解质)大量外渗，从而引起组织浸泡液的电导率发生变化，通过测定外渗液电导率的变化，就可反映出质膜的伤害程度和所测材料抗逆性的大小。Dexter (1930)首先用电导法測定了植物的抗冻性，经过不断地改进和完善，目前已得到广泛应用。研究显示，将基因转入植株中，如果该植株细胞在低温下的滲透性降低，说明该植株细胞受到的低温损害小，其抗冻性得到增强，可以证明该基因与植物的抗冻性有关，是ー种冷诱导的抗冻基因。转基因CbCINPl的拟南芥抗冻性测定将萌发之后14天的CbCINPl过表达转基因拟南芥(OE-CbCINPl)和野生型拟南芥(WT )同时放入-4 V培养箱，分别在3，6，12，24，48小时取出转基因和野生型拟南芥各5株(5个平行重复试验)，4°C恢复6小时，之后各剪取6片叶子，去离子水冲洗干净，用洁净滤纸将叶表面的水分轻轻吸干，放入装有25ml去离子水的试管中，室温振荡过夜(16小时)，測定电导率Cl，之后将含有叶片的试管高压灭菌，冷却到室温之后再次测定溶液的电导率得C2。离子渗透率=C1/C2X 100%。由图5可知，CbCINPl过表达的转基因拟南芥(见-ひ67^2)在零下4度的离子渗透率远低于野生型，说明由于CbCINPl蛋白的过表达降低了植物细胞受到低温的损伤，即CbCINPl蛋白的过表达可以增强植物的抗冻性。这对于培养优良的作物品种特别是抗冻的作物品种具有重要的理论及实践意义。实施例4
CbCINPl基因的亚细胞定位
离子芥CINPl基因融合绿色荧光蛋白GFP表达载体的构建将测序验证过的实施例I得到的片段通过BP反应重组到pDONR/Zeocin载体，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，经20 mg/1的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过LR反应将CbCINPl基因重组到PMDC43载体上，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，经50 mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体(如图6 )。 拟南芥原生质体的制备严格按照Yoo等2007年在Nature Protocal上报道的方法，简要的说，即剪取萌发之后4周大的拟南芥叶片10-15片，切成宽度约为0. 5-lmm的条状，至于 IOml 酶液[20 mM MES (pH 5.7) I. 5% (wt/vol)纤维素酶 RIO, 0. 4% (wt/vol)离析酶R10，0. 4M甘露醇，20mM氯化钾，IOmM氯化钙，0. 1% (wt/vol) BSA]里消化5_12小时，加入等体积的 W5[2mM MES (pH 5. 7), 154mMNaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl.]，用 75 y m 的滤网过滤除去未被消化的叶片，室温IOOg离心I分钟，弃上清，加入W5使细胞浓度为2X105cell/ml，冰上沉降 30 分钟，小心吸取上清，用 MMG[ 4 mM MES (pH 5.7),0.4 M mannitol,15mM MgCl2]溶液重悬使细胞浓度为2X IO5 cel 1/ml，备用。
原生质体的转化取10 ill构建好的质粒(10_20 ii g )，加入到2ml离心管中，加入100 ill制备好的原生质体，轻柔混匀，然后加入110 ill 40%的PEG溶液[(40% (wt/vol) PEG4000,0. 2 M mannitol 和 100 mM CaCl2]，混匀，静置 15 分钟。加入440 u I溶液W5,混匀，IOOg离心2分钟，弃上清，用Iml溶液WI [4 mM MES (pH 5. 7),0. 5 Mmannitol, 20 mM KCl.]重悬，20°C孵育16小时后用激光共聚焦显微镜观察。由图7可知，CbCINPl蛋白定位在细胞核和细胞质膜上。推测其可能有助于增加质膜的稳定性，降低低温对细胞的伤害。
权利要求
1.一种提高植物抗冻性的基因ぬCVM7ム其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn o
2.根据权利要求I所述的基因在用于转基因植物育种中的用途。
3.含有权利要求I所述基因的表达载体、细胞系及宿主菌。
4.ー种培育耐低温的转基因植物的方法，是将权利要求I所述的编码基因转入植物中，得到耐低温的转基因植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于权利要求I所述的编码基因是通过权利要求3所述的重组表达载体导入植物中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述植物为双子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物为拟南芥。
8.一种由权利要求I所述的基因编码的蛋白质CbCINPl，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
9.根据权利要求8所述的基因CbCINPl编码的蛋白质，其特征在于'CbCINPl基因转入植物中，编码出的CbCINPl蛋白定位在植物的细胞核和细胞质膜上。
10.根据权利要求9所述的基因ぬ编码的蛋白质，其特征在于所述植物为拟南芥。
全文摘要
本发明提供了一种冰缘植物冷诱导蛋白CbCINP1，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种编码该冰缘植物冷诱导蛋白的基因CbCINP1，它具有SEQIDNO:1所示的碱基序列。本发明的冰缘植物冷诱导蛋白的编码基因可用于转化植物以产生具有抗寒特性的转基因植物。
文档编号A01H5/00GK102643828SQ201210030208
公开日2012年8月22日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者安黎哲, 岳修乐 申请人:兰州大学