专利名称：一种调控水稻茎秆高度的组蛋白去甲基化酶基因jmj703及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703，同时还涉及一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703的制备方法，还涉及一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703的用途，所述的基因参与组蛋白甲基化和植物的茎杆高度调控。
背景技术：
粮食安全已经是一个世界性的难题。水稻作为全球的主要粮食作物之一，对缓解粮食短缺，尤其是保障我国的粮食安全有着重要的意义，如何提高水稻产量已经成为一项具有重要意义的科学问题。同时，作为禾本科植物研究的模式生物，相关方面的研究也具有相当的理论意义。20世纪60年代初，第一次绿色革命的兴起极大的提高了粮食产量，其主要特征就是将水稻的高杆变矮杆并辅助以农药、化肥和农业机械的广泛应用。矮杆基因的发现使水稻可以抗倒伏，同时突破了肥料的使用限制，是第一次绿色革命的关键。在后来的育种实验中，矮杆已经成为一个必不可少的性状。表观遗传调控是指在不改变DNA序列的前提下，以染色质为物质基础，调控基因的时空表达，从而调控细胞活动及个体发育和环境响应。组蛋白修饰是表观调控的主要组成部分之一。组蛋白修饰是指构成核小体骨架的组蛋白的末端(尾巴)可以发生如甲基化、乙酰化等共价修饰，这些修饰通过改变核小体的结构和染色质的蛋白识别调控相应区域的基因表达(Kouzarides.Chromatin modifications and their function.Cell.2008,128:693-705)。组蛋白甲基化是目前为止研究的最多的修饰之一，主要发生在组蛋白的氨基末端的赖氨酸残基和精氨酸残基，其中赖氨酸的甲基化有三种形式:单甲基化、二甲基化和三甲基化；精氨酸有两种形式:单甲基化和二 甲基化。不同位点、不同形式的甲基化会对基因的表达产生不同的影响，例如，组蛋白H3第三位赖氨酸的三甲基化修饰(H3K4me3)多分布在活跃表达的基因的转录起始区。甲基化水平由甲基转移酶和去甲基化酶共同调节。Jumonji类蛋白是迄今发现的仅有的两类组蛋白去甲基化酶家族中主要的一个家族，广泛参与了基因表达调控、染色质结构形成等过程和生物体的发育过程，然而它们在植物中的研究还很少。拟南芥和水稻中各有20个基因，拟南芥中JMJ11，JMJ12，JMJ14，JMJ15, JMJ25 和 JMJ30 的功能有了初步的研究(Chen etal.Epigenetic gene regulationby plant Jumonji group of histone demethylase.BBA Gene Regul Mech.2011,8 =421-426)，而水稻中目前仅有一个JMJ706的相关报道(Sun andZhou.RicejmjCdomain-containing geneJMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment.PNAS.2008，105:13679-13684)。综上所述，本发明的相关研究将在水稻的育种应用和理论研究上具有一定的价值
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703,该基因去除组蛋白H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3甲基化修饰，而水稻中目前仅有一个组蛋白去甲基化酶基因的相关报道，该基因的研究为其做了补充。本发明的另一个目的是在于提供了一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703在调控水稻株高方面中的应用，该基因抑制表达后水稻的茎杆边矮，更抗倒伏，但是叶片等器官发育正常，从而为育种提供了一个选择的株型。本发明通过以下技术方案实现:申请人:通过检索染色质蛋白数据库(chromdb, http://www.chromdb.0rg/),选取了其中一个组蛋白去甲基化酶及基因JMJ703，其全长cDNA登录号为AK121381，基因ID号为4338043，预测编码区由3717个碱基组成，编码1238个氨基酸，此基因的功能研究在水稻中尚没有相关文章发表。通过RNA干扰(RNAinterference，RNAi)的方法，将该基因的RNA干扰载体转化到水稻中，发现转基因植株的茎杆高度比野生型矮，但是叶片的长度却没有明显的变化从而改进了水稻的柱形。通过烟草异源体内试验发现，JMJ703蛋白是一种组蛋白H3K4mel/H3K4me2/H3K4me3的去甲基化酶。以上表明本发明的JMJ703是有功能的组蛋白去甲基化酶基因并且调控水稻的茎杆伸长过程。一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703的制备方法，其步骤如下:从染色质蛋白数据库(chromdb,http://www.chromdb.0rg/)得到 JMJ703 基因的核苷酸序列，根据该序列设计引物对，以水稻的cDNA为模板，扩增了 JMJ703的一段(距翻译起始位点第2282至第2834个碱基)，一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述引物对的DNA序列如下: RiJMJ703-F (正向引物)5 ’ -GGGACTAGTGGTACCGGAATGAGTTGTCATGTACAACAAA-3 ’RiJMJ703-R (反向引物)5 ’ -GGGGAGCTCGGATCCGCAGGGGGATCTAAAGAAGG-3 ’I)将步骤(I)中扩增片段连接到抑制表达载体pdsl301上(已经在图中说明，请见图1B，载体骨架为pCAMBIA1301，购自澳大利亚CAMBIA公司)，获得转化载体pdsl301-JMJ703o2)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei Y et.al.，Efficient transformationofrice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis oftheboundaries of the T-DNA.PlantJ.1994，6:271-282)将所述的载体导入水稻受体中花11 (遗传资源来源披露表-1)，获得转化植株；3)借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株，再利用realtime-PCR分析转基因植株中相关基因的表达；4)鉴定转基因植株的表型，并进行统计分析；设计序列特异的引物，扩增JMJ703的一段(距翻译起始位点第340至第2100个碱基)，一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，同时得到一种分离的蛋白质片段，其序列为SEQID NO:3所示的氨基酸序列。扩增的引物序列如下:FA-NCZ-F (正向引物)5 ’ -GCTCTAGAATGACGAGACGCAGACAACAGCT-3 ’FA-NCZ-R (反向引物)5 ’ -GCTCTAGATGGACCATCAGTTAATCTGCG-3，。 将SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列用XbaI单酶切克隆到克隆到烟草表达载体PFA121上(见图1)后，利用农杆菌在烟草叶片中瞬时表达，再分离出叶片的细胞核，用特异的组蛋白修饰的抗体杂交，观察修饰的水平是否下降。结果显示，与没有表达SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的细胞核相比，表达了这段序列的细胞核的组蛋白H3K4的甲基化修饰水平明显下降，说明SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列表达后可以去除H3K4mel，H3K4me2，H3K4me3的甲基化，见图6 (详细见实施例3A)。将表达有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的烟草叶片提取蛋白纯化后，得到SEQIDNO:3所示氨基酸序列的蛋白，该蛋白与小牛组蛋白体外孵育后，H3K4甲基化修饰水平下降，说明SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有去除H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3的甲基化修饰的功能，见图7 (详细见实施例3B)。一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703在调控水稻株高方面得到应用，其步骤是:将得到的SEQ ID NO I所示的核苷酸序列克隆到pdsl301(见图1B)上，转化水稻(详细见实施例2)。经过统计分析和组织切片分析后发现转基因水稻的茎杆高度变矮，但是叶片等器官的发育没有明显变化，从而影响了水稻株型，更加抗倒伏，为水稻育种提供了一个株型的选择(详细见实施例4)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:组蛋白甲基化是目前研究的最热的表观修饰之一，染色质甲基化水平的动态平衡对基因表达调控期重要作用，而JMJ类蛋白是目前仅有的两类组蛋白去甲基化酶中主要的一类。植物中的研究更是知之甚少。水稻中的JMJ类组蛋白去甲基化酶仅有一例报道，作用于H3K9位点，本发明的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703的功能尚未阐明，其在水稻的发育中的作用也没有未见报道。本发明通过测定其生化酶活性，发现JMJ703蛋白可以去除H3K4位点的甲基化，丰富了水稻中组蛋白去甲基化酶作用位点的类型。抑制该基因的表达使水稻植株出现了茎杆变短的·表型，而叶片等其他器官的发育正常，较矮的茎杆可以提高水稻的抗倒伏能力，优化水稻的株型，为水稻的育种提供了更多的选择。
图1A为一种和烟草表达载体pFA121(通过改造pBI 121而来，Genbank ID:AF485783.1)示意图。pFA121由如下方法获得:用XbaI和EcoRI (均购自宝生物工程大连有限公司)将pBI 121 (Genbank ID:AF485783.1)上的GUS基因切除后，回收载体片段，再以FLAG:HA标签连入。图1B为一种抑制表达载体pdsl301不意图。将pMCG161 (GenBank ID:AY572837.1)用 EcoRI 和 HindIII (均购自宝生物工程大连有限公司)酶切后回收外源片段，再连入到pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)中得到pdsl301ο图2为一种抑制表达Tl代转基因植株中JMJ703基因的表达量检测示意图。(ZHlI 为野生型，ds3-l-2, ds3-l_7，ds3-5_2，ds3-5_6，ds3-6_2 为转基因阴性对照)。图3为一种抑制表达JMJ703基因后水稻植株的表型及统计结果示意图。JMJ703被抑制后，植株呈现半矮化的表型，每一个节间都变短，但叶片大小没有明
显变化。
图4为一种抑制表达JMJ703基因后水稻植株的细胞学表型及统计结果示意图。JMJ703被抑制后，虽然植株节间变短，但是节的细胞长度并没有明显变化。图5为一种细胞周期相关基因在抑制表达植株中的表达情况不意图。其中一个抑制细胞周期进程的基因RBRl在JMJ703抑制植株中上升表达。图6为一种JMJ703蛋白的组蛋白去甲基化活性实验示意图。DAPI指示细胞核的位置，ant1-HA指示表达有JMJ703蛋白的细胞核，ant1-methylated histories 指不细胞核的组蛋白修饰状况，H3K4meI, H3K4me2, H3K4me3,H3K27me3指不同位点的组蛋白修饰情况。若箭头指示的含有JMJ703蛋白的细胞核有组蛋白修饰的信号则表达JMJ703不去除该种修饰，反之则JMJ703去除了组蛋白修饰，结果显示JMJ703 去除了 H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3 修饰。
图 为一种JMJ703蛋白的组蛋白去甲基化体外活性实验示意图。
FAJ3NCZ代表加入JMJ703蛋白的量，H3K4mel, H3K4me2, H3K4me3和H3分别指示western杂交所用的抗体:其中H3指示底物的量(表示各个样品之间的差异不是由于底物的多少引起的)，H3K4mel, H3K4me2, H3K4me3分别指示底物上着三种修饰的含量。结果显示加入的JMJ703蛋白越多，底物的三种甲基化水平越低，说明JMJ703的去甲基化活性。
具体实施例方式实施例1:相关序列的获得对本发明所需要的基因(登录号AK121381, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide/37991004)，主 要通过RT-PCR方法(参见:J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)进行扩增得到JMJ703基因特异的一段序列，A、先抽提来自水稻幼苗叶片的RNA, RNA抽提用试剂是Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)；B、RT-PCR中反转录合成cDNA第一链的步骤如下:①配混合液1:总RNA 2 μ g，DNaseI 2U, IOxDNAseI buffer I μ L，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01% DEPC)到10 μ L，混匀后将混合液I在37°C放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液I置于65°C水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液I中加入I μ I 500 μ g/ml的oligo (dT)，④将在冰上冷却的混合液I立即置于65°C水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配混合液2:混合液I 10 μ 1，5x first strand buffer 4 μ 1,0.1M DTT (疏基乙醇)2 μ I, IOmM dNTP mixture 1.5 μ I,DEPC处理水0.5 μ 1，反转录酶2 μ 1，混匀后将混合液2置于42°C水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90°C干浴3分钟，⑦_20°C保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司；C、然后根据 NCBI 数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)公布的 JMJ703 基因的全长cDNA序列，设计特异引物PCR扩增特异片段。PCR用到的体系为20 μ 1，具体配法为:cDNA 第一链模板 I μ 1，IOxPCR buf f er2 μ I, IOmM dNTP 1.6μ 1,2.5mM Mg2+L 5 μ 1，RiJMJ703-F和RiJMJ703-R引物各0.4 μ I (用于抑制表达载体的引物为RiJMJ703_F和RiJMJ703-R ;用于烟草表达的载体的引物为FA-NCZ-F和FA-NCZ-R)，LATaq酶0.2 μ 1，加水到20 μ I (所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下:①94°C 4分钟，②94°C 30秒，③56°C 30秒，④72°C 30秒，⑤从②-④循环30次，⑥72°C 7分钟，⑦4°C保存。D、最后将扩增产物连接到T/A克隆载体pGEMT-vector (购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)上用T7和SP6引物测序验证。用来克隆JMJ703抑制载体片段的引物为:RiJMJ703-F (正向引物)5 ’ -GGGACTAGTGGTACCGGAATGAGTTGTCATGTACAACAAA-3 ’RiJMJ703-R (反向引物)5 ’ -GGGGAGCTCGGATCCGCAGGGGGATCTAAAGAAGG-3 ’最终得到的JMJ703基因的抑制载体片段的cDNA序列，一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。用来克隆烟草异源表达的引物为:FA-NCZ-F (正向引物)5，-GCTCTAGAATGACGAGACGCAGACAACAGCT-3 ’FA-NCZ-R (反向引物)5，-GCTCTAGATGGACCATCAGTTAATCTGCG-3 ‘最终得到的JMJ703基因的烟草异源表达片段的cDNA序列，一种分离的DNA片段，其序列为SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列和一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID N0:3所
示的氨基酸序列。实施例2 =RNAi双链抑制表达载体的构建:I)将得到的SEQ ID NO:1的序列用BamHI和KpnI双酶切(购自宝生物工程大连有限公司，具体参见内切酶说明书)，回收目标片段后连到双链抑制载体上。连接酶购自NEB公司，反应体系参见说明书。2)连接产物通过电转化的方法(电转化仪为印pendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见仪器说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA (LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)LA抗性培养基上涂皿培养；3)将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的IOml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37°C摇床上培养16-18小时。按照(《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，科学出版社，2002)所述的方法抽提质粒，用KpnI和BamHI (购自宝生物工程大连有限公司)酶切检测，得到的阳性质粒用pMCG-lF(上海生工合成)和pMCG-lR(上海生工合成)测序验证，得到抑制表达第一链载体；所用引物序列如下:pMCG-lF:CTGCTCCACACATGTCCATTpMCG-lR: CCCACCATCTTGTGGAGCTA4)用步骤I)中的方法，将SEQ ID NO:1的序列用SacI和SpeI (购自宝生物工程大连有限公司)双酶切后连接到经过测序验证的抑制表达第一链载体上，用PMCG-2F (上海生工合成)和pMCG-2R(上海生工合成)测序验证，得到完成的双链抑制表达载体；所用引物序列如下:pMCG-2F: GGCTCACCAAACCTTAAACAApMCG-2R: CTGAGCTACACATGCTCAGGTT
5)把步骤4)的抑制表达载体通过电转化的方法(参考文献和使用的电压参数按照本实施例步骤2)的方法进行)导入农杆菌(A.tumefaciens)EHA105 (购自澳大利亚CAMBIA实验室)菌株中。将转化后的菌株命名为RiJMJ3-EHA105。实施例3: —种水稻组蛋白去甲基化酶在组蛋白H3K4去甲基化方面的功能A、JMJ703蛋白体内去甲基化酶活性的分析:由于组蛋白甲基化修饰可以以不同的形式发生于不同的位点，JMJ类蛋白的去甲基化活性也有特异性，故用烟草异源表达的方式确定JMJ703蛋白的去甲基化活性。将序列表中的序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列克隆到烟草表达载体pFA121(见图1)上，通过农杆菌转化烟草后用免疫染色(Immunostaining)的方法检测表达JMJ蛋白的细胞核内的组蛋白修饰情况。具体方法如下:I)用XbaI单酶切列表中的其序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列后，回收目标片段，克隆到pFA121(见图1)上，35S引物测序验证方向正确后，用电转(1800伏)的方法转化到农杆菌EHA105中，得到JMJ703的烟草转化菌株J3NCZ-EHA105。在5ml含有250ppm卡那霉素、IOmM MES和40 μ M乙酰丁香酮的LB中接种10 μ I的J3NCZ-EHA105，28°C摇床培养16小时左右。第二天收集菌体，用含IOmM氯化镁的水重悬并调节菌体OD值到1.0，加入乙酰丁香酮至终浓度为200 μ M，静置3小时以上。将菌液转移到注射器内，去掉针头，以食指抵住烟草叶片，将菌液用注射器从烟草的背页面挤压渗透到烟草叶片中，完成转化。2) 2天后，将转化的烟草叶片剪成I厘米见方左右大小，浸入含4% (体积/体积)甲醛的缓冲液I中QOmM TisHCl，ρΗ7.5，IOOmM NaCl, IOmM EDTA)，抽真空20分钟，再用缓冲液I洗两次，每次10分钟，吸干残留水分后在缓冲液2中(15mM TisHCl, pH7.5,20mMNaCl,2mM EDTA，0.5mM精胺，80mM KC1，0.1 % Triton X-100)将叶片尽量剪碎是细胞核释放出。用200目的筛子过滤去掉残渣后再以1: 4的比例将上清稀释到缓冲液3中(IOOmMTisHCl，ρΗ7.5，2mM MgCl2, 50mM KCl，0.1 % Triton X-100，5%蔗糖，0.05% (体积 / 体积)吐温-20)，再取稀释过的液体70 μ I滴在涂过多聚赖氨酸的玻片上，自然风干后置于_20°C待用。3)取制作好的片子在含4 % (体积/体积)甲醛的KPBS (NaCl 128mM, KCl2mM, Na2HP048mM, KH2P042mM, pH 7.2)-0.1 % Triton X-100 缓冲液中交联 20 分钟后，用KPBS-0.1% Triton X-100洗三次，每次5分钟。将玻片置于封闭液(含1% (质量/体积)小牛血清蛋白(BSA)的KPBS-0.1 % TritonX-100)中，37°C封闭30分钟。这期间配制一抗，即同时将HA的抗体和组蛋白修饰的抗体以1: 300稀释到封闭液中。用KPBS-0.1%Triton X-100洗三次，每次5分钟洗去封闭液后，将配好的一抗滴加在玻片有样品的地方，盖上封口膜，4°C杂交过夜。第二天，轻轻揭去封口膜，将玻片在KPBS中洗3次，再次封闭后滴加以1: 200稀释在封闭液中的二抗，37°C杂交2小时，再轻轻揭去封口膜，KPBS洗3次后往玻片上有样品的地方滴加20 μ I 4!，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，在滴加一滴保护剂(H-1000, VECTASHIELD )，保湿和减缓荧光淬灭。再在激光共聚焦显微镜下观察(Leica)。用到的抗体:HA 抗体(Μ20003Μ, ab-mart)，H3K4mel (ab8895, abeam)，H3K4me2 (04-790，millipore), H3K4me3 (07-473, millipore), H3K27me3 (ABE44, millipore), Alexa Fluor 488 标记羊抗鼠二抗(A-l 1029, invitrogen), Alexa Fluor 568 标记羊抗兔二抗(A-11036,invitrogen).结果如图6所示,能够检测到JMJ703蛋白的细胞核都失去了 H3K4甲基化的信号，而H3K27的甲基化信号没有丢失，说明JMJ703是一种组蛋白H3K4的去甲基化酶，可以去除该位点所有三种形式的甲基化。B、JMJ703蛋白体体外甲基化酶活性的分析:I)按照实施例3中所描述的方法完成含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列载体的烟草转化后，去转化过的烟草叶片，在液氮中研磨成粉，按照1: 2(质量/体积)加入到总蛋白抽提缓冲液中(50mM TisHCl，ρΗ7.5，150mM NaCl，0.5% Triton X-100)，混合均匀后，4度条件下1200rpm离心15分钟，取上清液与100 μ I的ANT1-FLAG M2 MagneticBeads(SIGMA-ALDRICH公司，货号:M8823)混合，在4度冰箱里颠倒孵育过夜。第二天，将混合液放在磁力架上，弃去上清，用TBS(50mM TisHCl, pH7.4,150mM NaCl)洗涤磁珠3次，每次十分钟。最后用100 μ I含有150ng/y I的3XFLAG多肽与磁珠在室温下孵育30分钟，得到洗脱的蛋白，命名为FA-NCZ，序列如SEQ IDNO:3所示。2)分别取 O μ I，20 μ I 和 60 μ I 的 FA-NCZ 与 30 μ g 的小牛组蛋白(SIGMA-ALDRICH公司，货号 H9250)在反应缓冲液(50mM HEPES, pH 8.0, IOOmM [NH4]2Fe [S04]2, ImMa-ketoglutarate, 2mM抗坏血酸,5%甘油,0.2mM PMSF)中37度条件孵育8小时,反应总体积100 μ I。反应结束后分别加入35 μ I上样缓冲液(62.5mMTris-HCl,pH 6.8,2% SDS,25%甘油，0.01%溴酹蓝，10% β -巯基乙醇)再分别取10 μ I进行western分析。3)将反应完成的蛋白进行western检测，western blot转膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell转印槽系统,按照其说明书，将组蛋白转至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2% (质量/体积)小牛血清蛋白(BSA)的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L, pH 7.5)对膜封闭两小时以上,然后以体积比1: 10000加入不同的抗体(如后所示)室温孵育两小时左右。用到的抗体:HA 抗体(M20003M，ab-mart)，H3K4mel (ab8895, abeam)，H3K4me2 (04-790，millipore), H3K4me3 (07-473，millipore), H3K27me3 (ABE44, millipore), H3(abl791,abeam)。倒掉一抗后，用PBS 缓冲液洗膜三次，每次15分钟，再加入按体积比为1: 10000稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(购自SouthernBiotech公司，得博生物科技有限公司(北京)代理)，室温孵育1-2小时，然后用PBS缓冲液洗膜三次，每次15分钟，使用SuperSingnalPico (购自Pierce公司)试剂盒按说明书操作方法进行X光片显影，经扫描仪扫描X光片后分析结果。结果显示，随着外源蛋白FA-NCZ加入量的增加，H3K4的甲基化修饰逐渐减少(H3作为上样对照)，见图7，说明JMJ703去除H3K4的三种甲基化修饰。实施例4:一种调控水稻茎杆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703在调控水稻株高方面中的应用，其步骤是:A、双元Ti质粒载体的转化及转基因植株阳性和表达量检测:I)将实施例2中获得的Ri JMJ3-EHA105 (来自实施例2)向水稻受体品种“中花11”(见遗传资源来源披露表-1)转化，转化方法参照Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J, 1994,6:271-282)进行。所获得的TO代转基因植株命名为RiJMJ3-n，其中η = 1,2,3...代表转基因的不同家系。2)取TO代转化植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis, 1992, Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用 PCR 方法对 TO 代转化植株用潮霉素引物进行阳性检测。潮霉素引物的序列如下:Hn-F5, -AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3;，Hn-R 5' -GTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3'(上海生工生物工程技术有限公司合成)。PCR反应总体积为 20 μ 1，具体配法是:模板 lOOng，IOxPCR buffer 2 μ 1，IOmM dNTP 1.6 μ 1,2.5mMMg2+L 5 μ 1，左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0.4 μ 1，TAQ酶0.2 μ I加去离子水到20 μ I (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下:①940C 4分钟，②94°C 30秒，③56°C 30秒，④72°C 2.5分钟，⑤从②_④循环32次，⑥72°C 7分钟，⑦4°C保存。PCR产物在I % (质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。因为潮霉素基因为转化载体所特有，这样能扩增出潮霉素基因特异条带的转基因植株即为阳性植株。对TO代阳性植株收种子(Tl代)，为Tl代的大田种植和性状调查做准备。3)为了检测抑制表达植株中的目标基因表达量，抽提了 Tl代转基因植株的总RNA，按照实施例1的方法进行反转录，得到产物后用实时荧光定量PCR的方法检测JMJ703的表达量。试剂购自宝生物工程大连有限公司，反应体系参见说明书。PCR仪为美国ABI公司的7500，PCR参数为95°C预变性10秒，进入循环后95°C变性5秒，60°C退火延伸40秒，40个循环。结果见图2.
用到的JMJ703特异的引物为:ReTJmj 703-F 5’ -ATCAAGGCCCCATGTTCTCA-3’ReTJmj 703-R 5’ -CCGCAGGACTTGCAATTCA-3’B、Tl代性状调查和表达分析:1)将Tl代植株种植大田后进行表型观察，发现转基因阳性植株的高度要矮于转基因阴性植株，并且 高度的变化是由于茎杆的变短引起的，而叶片的大小却没有明显的变化(图3);2)为了进一步研究引起株高变异的原因，选取株高变矮的植株和野生型植株的茎杆为材料进行组织切片的观察。具体操作方法为，选取相同位置的茎杆的成熟区，切成5mm左右的段，在含50% (体积/体积)乙醇的FAA(甲醛5ml，冰醋酸5ml，50%酒精90ml)中固定过夜，在分别用50%，60%，70%，80%，90%脱水各I小时后，加入曙红染色过夜，出去染液后，用无水乙醇洗两次，每次I小时彻底出去水分，再依次用乙醇:二甲苯=1:1和I: 3，以及纯二甲苯透明各I小时，再向其中加入碎的石蜡，待石蜡慢慢溶于二甲苯后再继续添加石蜡并置于37°C溶解，饱和后再置于60°C，直至饱和后再依次用溶于二甲苯的50%(体积/体积)，75% (体积/体积)和纯的石蜡替换，最后将材料包埋在纯的石蜡中，冷却后用于石蜡切片。实验结果显示:突变体和野生型的细胞长度没有明显变化(图4)，即植株的高矮并不是由于细胞的长短变化引起的，故推测是细胞分裂的速率影响了茎杆的高度。3)为了检测是否是由于细胞分裂的速率影响了茎杆的高度，选取了细胞分裂比较旺盛的幼嫩的顶端分省组织区材料，抽提RNA，按照实施例1的方法进行反转录，用得到的产物进行实时荧光定量PCR反应，检测细胞周期相关的一些基因的表达，结果显示，一个抑制细胞分裂的基因RBRl发生了明显的上升(图5)，暗示由于JMJ703基因的下降，直接或间接引起了 RBRl的上升表达，使细胞分裂速率减慢，导致茎杆变矮。
权利要求
1.一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
2.一种分离的DNA片段，其序列为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种分离的蛋白质片段，其序列为SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
4.权利要求I所述的一种分离的DNA片段在调控水稻株高方面中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种调控水稻茎秆高度的组蛋白去甲基化酶基因JMJ703及应用，通过检索染色质蛋白数据库，选取了其中一个组蛋白去甲基化酶及基因JMJ703，其全长cDNA登录号为AK121381，基因ID号为4338043，预测编码区由3717个碱基组成，编码1238个氨基酸。通过RNA干扰的方法，将该基因的RNA干扰载体转化到水稻中，发现转基因植株的茎秆高度比野生型矮，但是叶片的长度却没有明显的变化从而改进了水稻的柱形。通过烟草异源体内试验发现，JMJ703蛋白是一种组蛋白H3K4me1/H3K4me2/H3K4me3的去甲基化酶。本发明的JMJ703是有功能的组蛋白去甲基化酶基因并且调控水稻的茎秆伸长过程。该基因抑制表达后水稻的茎秆边矮，更抗倒伏，但是叶片等器官发育正常，从而为育种提供了一个选择的株型。
文档编号A01H5/00GK103255152SQ201210037018
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者周道绣, 陈香嵩 申请人:华中农业大学