专利名称：东方百合种球脱毒方法
技术领域：
本发明属于在播种或种植前测试或处理种子的方法，具体涉及一种百合种球脱毒的方法。
背景技术：
东方百合是百合杂种类中花朵最大而又最美丽的一大类，能散发出怡人的香味， 故又称之为香水百合，深受人们的喜爱，是世界上广泛栽培的一大类百合杂种系。百合主要靠扦插繁殖和分球繁殖等方式繁殖，但长期的无性繁殖使病毒在体内积累，引发各种病毒病，严重影响种球和切花的产品品质，近年来，随着我国百合引种数量和种植面积的迅速增加，以及不规范的种球自繁，病毒病开始在我国各百合种植区发生流行，病毒病一般发病率在40 50%，二代种球带毒率有的达到90%以上，严重地制约了我国百合产业的提质增效。目前，国内外有关百合的脱毒处理主要是单独采用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒及相互间的组合脱毒，这些方法单独使用时效率低，脱毒效果差，其普遍采用较好的是茎尖培养脱毒法，其常规的步骤是；通过植物顶端分生组织切取O. 2 O. 3mm茎尖，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织分化产生鳞茎芽，长成小植株得到脱毒苗。例如，专利号为200410079513. 2的中国专利公开了一种“东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法”，是采用茎尖作为外植体，经灭菌，诱导培养后获得东方百合脱毒鳞茎；该脱毒组织培养法存在的问题是切取很小的茎尖分生组织，在添加6-BA I. O 2. O mg / L和NAA O. 2 O. 5mg / L的MS基本培养基上培养20 25d，茎尖会同时形成愈伤组织和不定芽，但从愈伤组织分化的不定芽易发生遗传变异；且未对病毒进行进一步的检测和监控，难于了解脱毒情况。也有如专利号为200910091972. 5的中国专利公开了 “一种百合种球病毒的脱除方法”，是采用暗培养，对无性繁殖系的组培苗两次剥取茎尖进行消毒并脱毒，茎尖的脱毒方式为茎尖热处理结合化学药剂脱毒，变温处理种球球芯3 5周，温度范围为25 38°C， 同时用病毒唑脱毒，浓度为5 7mg/ml，茎尖大小为O. 4 I. 2mm。该方法是对组培苗进行脱毒，组培苗需在无菌条件下获取，获取环境要求严格。
发明内容
本发明目的是提供一种综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的东方百合种球脱毒方法，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。本发明通过以下技术方案实现东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤
A、外植体生长点的剥取选优质种球，用浓度为20 40%的多菌灵600倍溶液浸泡30 分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45 55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20 25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭45 55%的水分；在温度为21 23°C，湿度为70 80%，光照强度1500 2000Lx，光照时间8 12h/d的条件下，经过5 7天后，芽
4长到5 6cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒将温度控制在35 38°C之间，湿度为70 85%，光照强度1500Lx， 光照时间8 12h/d的环境条件下，经过7 15天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为O. 1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8 15秒；@吐温80无菌水浸泡2 3分钟； 再用无菌水洗5 7遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养采集长度为O. 3 O. 5 _的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21 23°C，光照强度1500 3000Lx，光照时间8 12h/d，培养40 60天后，生长点膨大成直径2 3cm的叶丛。其中，诱导培养基为1/ 2MS+BA2. 5 5mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+ 糖 40g/l+ 琼脂
5.5g/L。E、脱毒培养将诱导出的叶丛切成O. 5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为 21 23°C，光照时间为8 12h/d，光照强度为2000 3000Lx的环境条件下，经过40 60天培养，形成带球的瓶苗。脱毒培养基为MS+ ΝΑΑ0. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+病毒唑5 mg/L+琼脂
6.O g/Lo其中，病毒唑的添加方法如下
a.用无菌蒸懼水配制好浓度为O. 2mg/ml的病毒唑母液。b.将无菌注射器的针头换成直径小于O. 2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。c.将高温灭菌后的培养基MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+琼脂6. O g/L，冷至35 40°C时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。F、病毒检测将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。优选的，步骤A是用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。步骤D是采集长度为O. 3 O. 4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。有益效果
①本发明采用综合脱毒技术，即将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合的方法，有效解决了单独使用一种方法存在的不足，缩短了培养周期，减少病毒交叉感染，植株成活率高，脱毒率明显提高，百合脱毒率达到80%以上，脱毒率较只采用高温处理提高了 25 70%。②本发明的脱毒方法，采用了 35 38°C的高温，在该高温下病毒出现钝化，其复制明显减弱或不再繁殖，该期间生产的嫩梢带病毒较少，且该温度能保证植株的成活率。
③本发明脱毒培养基内添加病毒唑的方法能使脱毒更彻底。④热处理后剥取O. 3 O. 5 _的茎尖生长点进行培养，此操作简单，易于操作，脱毒效果好。
具体实施例实施例I:东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤A、外植体生长点的剥取选优质种球，用浓度为20%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟； 将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种20个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭45%的水分；在温度为21°C，湿度为70%，光照强度1500Lx，光照时间8h/d的条件下，经过5 7天后，芽长到5cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒将温度控制在35°C之间，湿度为70%，光照强度1500Lx，光照时间 8h/d的环境条件下，经过7 15天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为O. 1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8秒吐温80无菌水浸泡2分钟； 再用无菌水洗5遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养采集长度为O. 3 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21 °C，光照强度1500Lx，光照时间8h/d，培养40 60天后，生长点膨大成直径2cm的叶丛。E、脱毒培养将诱导出的叶丛切成O. 5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为 21°C，光照时间为8h/d，光照强度为2000LX的环境条件下，经过40 60天培养，形成带球的瓶苗。F、病毒检测将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。实施例2 :东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤
A、外植体生长点的剥取选优质种球，用浓度为30%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟； 将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为50%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种22个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭50%的水分；在温度为22°C，湿度为75%，光照强度1800Lx，光照时间10h/d的条件下，经过5 7天后，芽长到5. 5cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒将温度控制在36°C之间，湿度为80%，光照强度1500Lx，光照时间 10h/d的环境条件下，经过7 15天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为O. 1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡11秒吐温80无菌水浸泡3分钟； 再用无菌水洗6遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养采集长度为O. 4 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度22°C，光照强度2000Lx，光照时间10h/d，培养40 60天后，生长点膨大成直径3cm的叶丛。其中，诱导培养基为I/ 2MS+BA 4mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+糖 40g/l+琼脂 5. 5g/ L。E、脱毒培养将诱导出的叶丛切成O. 5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为 220C，光照时间为10h/d，光照强度为2500LX的环境条件下，经过40 60天培养，形成带球的瓶苗。F、病毒检测将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。
实施例3:东方百合种球脱毒方法，包括以下步骤
A、外植体生长点的剥取选优质种球，用浓度为40%的多菌灵600倍溶液浸泡30分钟； 将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的泥炭中，每箱下种25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持泥炭55%的水分；在温度为23°C，湿度为80%，光照强度2000Lx，光照时间12h/d的条件下，经过5 7天后，芽长到6cm时进行热处理脱毒。B、热处理脱毒将温度控制在38°C之间，湿度为85%，光照强度1500Lx，光照时间 12h/d的环境条件下，经过7 15天培养，芽长高并绽开成莲座状。C、外植体清洗消毒①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为O. 1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡14秒吐温80无菌水浸泡2分钟； 再用无菌水洗7遍至无泡沫。D、生长点采集诱导培养采集长度为O. 5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度23°C，光照强度3000Lx，光照时间12h/d，培养40 60天后，生长点膨大成直径2cm的叶丛。其中，诱导培养基为I/ 2MS+BA 4mg/L+ ΝΑΑ0. 25 mg/L+糖 40g/l+琼脂 5. 5g/ L。E、脱毒培养将诱导出的叶丛切成O. 5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为 230C，光照时间为12h/d，光照强度为3000LX的环境条件下，经过40 60天培养，形成带球的瓶苗。脱毒培养基为MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+病毒唑5 mg/L+琼脂
6.O g/L。其中，病毒唑的添加方法如下
a.用无菌蒸懼水配制好浓度为O. 2mg/ml的病毒唑母液。b.将无菌注射器的针头换成直径小于O. 2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液。c.将高温灭菌后的培养基MS+ NAAO. 2mg/L+ O. 4%糖+活性炭O. 5%+琼脂6. O g/L，冷至40°C时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。F、病毒检测将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。
权利要求
1.东方百合种球脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤A、外植体生长点的剥取选优质种球，用浓度为20 40%的多菌灵600倍溶液浸泡30 分钟；将消过毒的泥炭用水拌湿，使其含水量为45 55%，备用；再将多菌灵浸泡后的种球种在拌湿的基质中，每箱下种20 25个种球，浇定根水，然后将泡过种球的多菌灵溶液洒在表面；按切花种植方法正常管理，保持基质45 55%的水分；在温度为21 23°C，湿度为70 80%，光照强度1500 2000Lx，光照时间8 12h/d的条件下，经过5 7天后，芽长到5 6cm时进行热处理脱毒；B、热处理脱毒将温度控制在35 38°C之间，湿度为70 85%，光照强度1500Lx，光照时间8 12h/d的环境条件下，经过7 15天培养，芽长高并绽开成莲座状；C、外植体清洗消毒①用清水冲洗后，剥去部分叶片，用中性肥皂水洗5分钟，用纱布包好，清水冲洗12小时；②用浓度为0. 1%的升汞浸泡8分钟；③再用浓度为75%的酒精浸泡8 15秒；④吐温80无菌水浸泡2 3分钟； 再用无菌水洗5 7遍至无泡沫；D、生长点采集诱导培养采集长度为0.3 0. 5 mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养，温度21 23°C，光照强度1500 3000Lx，光照时间8 12h/d，培养40 60天后，生长点膨大成直径2 3cm的叶丛；E、脱毒培养将诱导出的叶丛切成0.5cm小块，接种于脱毒培养基中，在温度为21 230C，光照时间为8 12h/d，光照强度为2000 3000Lx的环境条件下，经过40 60天培养，形成带球的瓶苗；F、病毒检测将瓶苗采用RT-PCR检测法检测，经检测确认无任何病虫害现象，并不带百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒等病毒，即为百合脱毒种苗。
2.根据权利要求I所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤A是用浓度为40% 的多菌灵600倍溶液浸泡种球30分钟。
3.根据权利要求I所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3 0. 4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
4.根据权利要求2所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D是采集长度为0.3 0. 4mm的百合茎尖生长点接种到诱导培养基中培养。
5.根据权利要求I 4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤D中的诱导培养基为I / 2MS+BA2. 5 5mg/L+ NAA0. 25 mg/L+ 糖 40g/l+ 琼脂 5. 5g/L。
6.根据权利要求I 4中任一项所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为MS+ NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+病毒唑5 mg/L+琼脂6.0 g/ L0
7.根据权利要求5所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中的脱毒培养基为MS+ NAAO. 2mg/L+ 0. 4% 糖 + 活性炭 0. 5%+ 病毒唑 5 mg/L+ 琼脂 6. 0 g/L。
8.根据权利要求6所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中病毒唑的添加方法如下a.用无菌蒸懼水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；c.将高温灭菌后的培养基MS+NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+琼脂6.0 g/L,冷至35 40°C时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
9.根据权利要求7所述的东方百合种球脱毒方法，其特征在于，步骤E中病毒唑的添加方法如下a.用无菌蒸懼水配制好浓度为0.2mg/ml的病毒唑母液；b.将无菌注射器的针头换成直径小于0.2纳米的滤筛，用带滤筛的无菌注射器吸取病毒唑母液；c.将高温灭菌后的培养基MS+NAAO. 2mg/L+ 0. 4%糖+活性炭0.5%+琼脂6.0 g/L, 冷至35 40°C时，吸取病毒唑母液，按5mg/L用量添加后摇匀，分装入无菌瓶中，待冷却凝固后用于药物脱毒接种。
全文摘要
本发明提供了一种东方百合种球脱毒方法，具体通过以下步骤完成A、外植体生长点的剥取，B、热处理脱毒，C、外植体清洗消毒，D、生长点采集诱导培养，E、脱毒培养，F、病毒检测。该发明克服了现有技术存在的不足，综合运用热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法，解决了单独使用一种方法存在的不足，该方法能有效减少病毒交叉感染的机会，脱毒率高，成活率高，能有效缩短种球培养周期。
文档编号A01H4/00GK102577965SQ20121005097
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者吴梅, 梁晓红, 陈朋从 申请人:玉溪明珠花卉股份有限公司