专利名称：一种杆线虫的培养方法及其培养器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物培养技术，更具体地说，是涉及一种杆线虫的培养方法及其
培养器。
背景技术：
生活变得丰裕，空闲时间增多，用大片草地构成的高尔夫球场和足球场等建设正逐渐增加着，绿色农产物栽培面积也在增加。为了帮助这样的草地和农作物生长，防治病害，正在使用大部分为有机合成农药的各种肥料和杀虫剂等，降雨过后喷洒的毒性农药随着周边的河流和地下水流出成为环境污染的主犯直接威胁着人类的健康。据此，上诉有机合成农药的喷洒被限制，但反面，病虫害等比级数增加，导致了高尔夫球场和农作物的损失逐年递增的实情。特别是对上面所说的草地产生伤害的害虫中加害草根部的金龟子幼虫蛴螬类的防治很困难所以导致了杀虫剂的过度使用，中国高尔夫球场里发现的有害金龟子有东方丽金龟，中华弧丽金龟，红脚平爪觸金龟，茶色金龟的幼虫，共有8属12种。一般土壤下 IOcm 内外栖息的东方_金龟(Blitopertha orientalis Waterhouse) 和中华弧丽金龟(Papillia guadriguttata Fabricius)等金龟子类为主要害虫,密度高的地方每立方米有120-150只，地上发现不了导致预查困难，更加难以防治的实情。上述金龟子类的幼虫时期摄食活跃对草的根部产生伤害，繁育完全成熟的草地， 即使受到金龟子的伤害也不会在表面变现出来，但是草地休眠期过后下一年春天到来受害区域的草便不会生长，这个时期以受害区域为重点实行防治的话为时已晚，金龟子已经处于向其它区域移动中，预查和防治真的十分困难。现今对于金龟子类的防治是使用有机磷系，合成拟除虫菊酯系等有机农药，害虫对象在土壤底下摄食所以使用上苦难点很多，诱发幼虫对药剂的抗药性，使得草地自我防御变弱等问题很严峻，特别是大的高尔夫球场采用部分灌注处理的方法来防治，这是非常无效率的，也不经济的方法。为了克服这些利用昆虫病原性线虫的生物学方面的防治开始兴起，在国际上存在很多专利，但是大部分昆虫病原性线虫中属线虫(Steinernema)科的虫生线虫 (carpocapsae)和格式线虫(glaseri)，利用它们来达到防治效果，但只限于使用在温室等一些局限的场所，大量培养难度大，农民们也逐渐有避讳使用的趋势。由于寄主特殊性导致杀虫率和生存率过低，作为防治剂的自身作用得不到充分发挥，而且没有可以大量培养的基础知识，生产速率低，导致了需求预测变得不可能，生产工程上要求高费用，大量生产难度变大，因此液体大量培养方法的研究就变得非常急切。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供了一种既环保，又可以大规模培养的杆线虫的培养方法及其培养器。为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，其在培养中不断进行氧气传递。具体的培养步骤为，(I)首先将培养基在温度为115°C 125°C，压强为14 16psi的条件下灭菌15 30min，然后将杀菌后的培养基冷却到25 28°C ；(2)将名称为Photorahabdus. spp的线虫共生菌接种到上述培养基中，接种量为 IXlO9 2X 109cfu/mL培养基，在温度为20 25°C，转速为200 250rpm的条件下培养2 5天；(3)将杆线虫(Heterorhabditis megidis)接种到步骤⑵得到的培养液中继续培养，接种量为4000 5000只/ml培#液，在温度为20 25°C，转速为200 250rpm的条件下培养8 14天，培养体系中不断进行氧气的置换，确保体系的氧气传递速率为O. 6
O.7mmo1 02/L · min。步骤(I)中所述的培养基的组成为，IL蒸馏水中，含细菌用胰蛋白胨17g，细菌用朊间质蛋白胨3g,细菌用乳糖蛋白胨IOg,氯化钠5g,细菌用胆汁盐I. 5g。步骤(3)的培养液中加入了玉米油，加入量为20 60g/ml培养液。培养器包括筒体、叶轮、氧气传递装置、水循环装置和Do探头，叶轮和氧气传递装置设置在筒体内，水循环装置设置在筒体外侧，Do探头设置在筒体的底部并伸入到筒体内； Do探头可向计算机输出信号用以计算氧气传递速率，进而用来监测体系中的氧气传递速率是否符合要求。氧气传递装置由供氧装置和两个串联的曝气装置组成，供氧装置位于筒体的内侧壁上，曝气装置位于筒体的内底部，曝气装置上设置了透气孔。透气孔的外径为Imm,内径为O. 7mm,长度为5cm。所述的叶轮为为两翼的浆型叶轮，下层叶轮和筒体内底面的距离为8 12cm。筒体内还设置了隔板，筒体底部还设置了温度计和PH探头。筒体外径是15cm，内径是13cm，厚度是1cm，高是36cm，浆型叶轮的直径是6cm，高是 IOcnio本发明的有益效果本发明操作简单，可进行大规模的培养，Iml培养基中，4000只杆线虫经培养后， 可达到200-400X 103只。同时，经实验验证，将本发明培养出来的杆线虫用到高尔夫球场后，对高尔夫草坪，树木，农作物的根部产生伤害的蛴螬类害虫的杀虫率可以达到95%。更重要的是，本发明在培养过程中不会产生有害的物质，不会造成环境的污染，是环保型的培养方法。
图I为本发明培养器的结构示意图。图I中，I为pH探头,2为温度计,3为Do探头,4为水循环装置,5为隔板,6为筒体，7为叶轮，8为供氧装置，9为氧气传递装置，10为曝气装置。图2为培养后的杆线虫外观图，b为a的放大图。
具体实施例方式培养器包括筒体、叶轮、氧气传递装置、水循环装置和Do探头，叶轮和氧气传递装置设置在筒体内，水循环装置设置在筒体外侧，Do探头设置在筒体的底部并伸入到筒体内； Do探头可向计算机输出信号用以计算氧气传递速率，进而用来监测体系中的氧气传递速率是否符合要求。氧气传递装置由供氧装置和两个串联的曝气装置组成，供氧装置位于筒体的内侧壁上，曝气装置位于筒体的内底部，曝气装置上设置了透气孔。透气孔的外径为Imm,内径为O. 7mm,长度为5cm。所述的叶轮为为两翼的浆型叶轮，下层叶轮和筒体内底面的距离为8 12cm。筒体内还设置了隔板，筒体底部还设置了温度计和PH探头。筒体外径是15cm，内径是13cm，厚度是1cm，高是36cm，浆型叶轮的直径是6cm，高是 IOcnio实施例I(I)首先在培养器中，将培养基在温度为115°C，压强为14psi的条件下灭菌 30min，然后利用水循环装置将杀菌后的培养基冷却到25°C，培养基的组成为，IL蒸馏水中，含细菌用胰蛋白胨17g，细菌用朊间质蛋白胨3g，细菌用乳糖蛋白胨10g，氯化钠5g，细菌用胆汁盐1.5g；(2)将名称为Photorahabdus. spp的线虫共生菌接种到上述培养基中，接种量为 I X 109cfu/mL±if#*,在温度为25°C，转速为250rpm的条件下培养5天；(3)将杆线虫(Heterorhabditis megidis)接种到步骤⑵得到的培养液中继续培养，接种量为4000只，加入玉米油，在温度为25°C，转速为250rpm 的条件下培养10天，培养体系中，利用供氧装置不断进行氧气的置换，确保体系的氧气传递速率为O. 6m mo I 02/L · min，同时用Do探头对体系中的氧气传递速率进行检测，进行调节，培养后杆线虫达到200X 103/mL。实施例2(I)首先在培养器中，将培养基在温度为125°C，压强为15psi的条件下灭菌 20min，然后利用水循环装置将杀菌后的培养基冷却到28°C，培养基的组成为，IL蒸馏水中，含细菌用胰蛋白胨17g，细菌用朊间质蛋白胨3g，细菌用乳糖蛋白胨10g，氯化钠5g，细菌用胆汁盐1.5g；(2)将名称为Photorahabdus. spp的线虫共生菌接种到上述培养基中，接种量为 2X 109cfu/mL##s，在温度为20°C，转速为200rpm的条件下培养3天；(3)将杆线虫(Heterorhabditis megidis)接种到步骤⑵得到的培养液中继续培养，接种量为5000只，加入玉米油，在温度为20°C，转速为200rpm 的条件下培养14天，培养体系中，利用供氧装置不断进行氧气的置换，确保体系的氧气传递速率为O. 7m mo I 02/L · min,同时用DO探头对体系中的氧气传递速率进行检测，进行调节，培养后杆线虫达到400X 103/mL。实施例3(I)首先在培养器中，将培养基在温度为120°C，压强为16psi的条件下灭菌15min，然后利用水循环装置将杀菌后的培养基冷却到26°C，培养基的组成为，IL蒸馏水中，含细菌用胰蛋白胨17g，细菌用朊间质蛋白胨3g，细菌用乳糖蛋白胨10g，氯化钠5g，细菌用胆汁盐1.5g；(2)将名称为Photorahabdus. spp的线虫共生菌接种到上述培养基中，接种量为
I.5X 109cfu/mL_s，在温度为23°C，转速为230rpm的条件下培养2天；(3)将杆线虫(Heterorhabditis megidis)接种到步骤⑵得到的培养液中继续培养，接种量为4000只，加入玉米油，在温度为23°C，转速为230rpm 的条件下培养8天，培养体系中，利用供氧装置不断进行氧气的置换，确保体系的氧气传递速率为O. 7m mo I 02/L *min,同时用DO探头对体系中的氧气传递速率进行检测，进行调节， 培养后杆线虫达到400X 103/mL。实施例4采集了 100只健康的东方丽金龟放到移栽了 50X 50X 30cm草坪的高尔夫球场的土壤里，每个幼虫用100只实施例I培养的线虫进行处理，10天后检查幼虫存活情况，最后得到结论为杀虫率达到95%。
权利要求
1.一种杆线虫的培养方法，其特征在于，其在培养过程中不断进行氧气传递。
2.根据权利要求I所述的杆线虫的培养方法，其特征在于，具体的培养步骤为，Cl)首先将培养基在温度为115°C 125°C，压强为14 16psi的条件下灭菌15 30min，然后将灭菌后的培养基冷却到25 28°C ；(2)、备名爾、％Photorahabdus. spp的线虫共生菌接种到上述培养基中，接种量为 I X IO9 2 X 109cfu/mL培养基，在温度为20 25°C，转速为200 250rpm的条件下培养2 5天；(3)将杆线虫接种到步骤(2)得到的培养液中继续培养，接种量为4000 5000只/ml 在温度为20 25°C，转速为200 250rpm的条件下培养8 14天，培养体系中不断进行氧气的置换，确保体系的氧气传递速率为O. 6 O. 7 m mo I O2A · min。
3.根据权利要求2所述的杆线虫的培养方法，其特征在于，步骤(I)中所述的培养基的组成为，IL蒸馏水中，含细菌用胰蛋白胨17g，细菌用朊间质蛋白胨3g，细菌用乳糖蛋白胨 10g，氯化钠5g，细菌用胆汁盐I. 5g。
4.根据权利要求2所述的杆线虫的培养方法，其特征在于，步骤(3)的培养液中还加入了玉米油，加入量为20 60g/ml培养液。
5.一种用于培养权利要求I所述的杆线虫的培养器，其特征在于，包括筒体、叶轮、氧气传递装置、水循环装置和Do探头，叶轮和氧气传递装置设置在筒体内，水循环装置设置在筒体外侧，Do探头设置在筒体的底部并伸入到筒体内。
6.根据权利要求5所述的培养器，其特征在于，氧气传递装置由供氧装置和两个串联的曝气装置组成，供氧装置位于筒体的内侧壁上，曝气装置位于筒体的内底部，曝气装置上设置了透气孔。
7.根据权利要求5所述的培养器，其特征在于，透气孔的外径为1mm，内径为O.7mm，长度为5cm。
8.根据权利要求5所述的培养器，其特征在于，所述的叶轮为为两翼的浆型叶轮，下层叶轮和筒体内底面的距离为8 12cm。
9.根据权利要求5所述的培养器，其特征在于，筒体内还设置了隔板，筒体底部还设置了温度计和pH探头。
全文摘要
本发明涉及一种生物培养技术，更具体地说，是涉及一种杆线虫的培养方法及其培养器。本发明提供了一种既环保，又可以大规模培养的杆线虫的培养方法及其培养器。其在培养中不断进行氧气传递。培养器包括筒体、叶轮、氧气传递装置、水循环装置和Do探头，叶轮和氧气传递装置设置在筒体内，水循环装置设置在筒体外侧，Do探头设置在筒体的底部并伸入到筒体内。本发明操作简单，可进行大规模的培养，1ml培养基中，4000只杆线虫经培养后，可达到200-400×103只。同时，经实验验证，将本发明培养出来的杆线虫用到高尔夫球场后，对高尔夫草坪，树木，农作物的根部产生伤害的蛴螬类害虫的杀虫率可以达到95%。
文档编号A01K67/033GK102599114SQ20121006430
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者南旭浩, 金孝炫, 金泰完 申请人:沈阳麦克斯生物工程有限公司