专利名称：一种培育耐旱植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育耐旱植物的方法。
背景技术：
水资源短缺是我国乃至全球面临的严峻事实，也是未来全球经济社会可持续发展面临的重大问题。季节性干旱在降水量丰富的南方也频繁发生，如广东每年受旱面积超过750万亩；四川省2006年作物受旱面积达2100万亩，占播种面积的35%，绝收397万亩，造成直接经济损失达61亿元。农业是我国的第一用水大户，发展高效节水型农业是我国的基 本国策。在农业方面，水资源使用量最高的一项就是水稻灌溉。近年来随着工业用水、城镇供水大幅度增长，农业用水紧缺问题日益严重。我国农业用水量约占总用水量的70%，水稻是中国最主要的粮食作物之一，水稻的灌溉用水量又占到农业用水的70%。然而在很多水稻种植地区，水资源已经变得很紧缺了，且全球气候变化又加剧了水资源的短缺。水稻节水一方面需要推广节水栽培技术，减少灌溉用水量。另一方面则需要提高水稻对少水和短期缺水环境的耐受性，使其在减少灌溉的环境下能够不减产或略有增产。因此，挖掘水稻的生理及基因潜力、充分利用水稻的耐旱基因资源培育节水型的水稻品种就至关重要，对工农业生产的持续发展及人民生活水平的提高有着十分重要的意义。水稻的耐旱性是一个复杂的数量性状，与其他抗逆育种(如抗淹水性)相比，不管是基于表型的传统育种，还是分子标记辅助选择，水稻抗旱性育种的进展都相当缓慢。随着水稻基因组测序计划的完成，以及对水稻基因组注释的日益完善，使得通过基因工程改良水稻的抗旱性成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种OsEn蛋白及其编码基因的新用途。本发明所提供的新用途为编码OsEn蛋白的核酸分子或所述OsEn蛋白在调控植物耐旱性中的应用。在本发明的实施例中，所述调控植物耐旱性具体表现为增强植物的耐旱性。所述OsEH蛋白或编码所述OsEH蛋白的核酸分子在培育耐旱植物中的应用也属于本发明的保护范围。所述OsEH蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。编码所述OsEH蛋白的核酸分子是如下I)或2)或3)的DNA分子 I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6X SSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，O. I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。 本发明还提供了利用OsEn蛋白的编码基因培育耐旱转基因植物的方法。该包括如下步骤向目的植物中导入OsEn蛋白的编码基因，得到与所述目的植物相比耐旱性提高的转基因植物；所述OsEH蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。序列I由577个氨基酸组成。所述OsEH蛋白的编码基因是如下I)或2)或3)的DNA分子I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6X SSC，O. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，O. I % SDS 和 I X SSC, O. I % SDS 各洗膜一次。序列2由1734个核苷酸组成，这1734个核苷酸即为所述OsEW蛋白(序列I)的编码序列。所述OsEn蛋白的编码基因是通过表达所述OsEn蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的；所述重组表达载体中启动所述OsEn蛋白的编码基因的启动子是35S启动子。所述35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列3。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在35S_C1301(参考文献ZhuY, Nomura T, Xu Y, Zhang Y, Peng Y, et al. (2006) ELONGATED UPPERMOST INTERNODEencodes a cytochrome P450 monooxygenase that epoxidizes gibberellins in a noveldeactivation reaction in rice. Plant Cell 18:442-456.)的多克隆位点插入所述OsEn蛋白的编码基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为酶切位点Kpn I和Xba I。所述OsEH蛋白的编码基因是如下I)或2)或3)的DNA分子I)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2X SSC，0. I % SDS 和 I X SSC, 0. I % SDS 各洗膜一次。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物，如水稻等农作物。在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物水稻，具体为水稻品种TP309。本发明获得了转OsEn基因水稻株系。在干旱处理后，野生型水稻和转空载对照水稻的叶片全部萎焉；而转OsEn基因水稻呈现出正常的生长状态，叶片舒展。复水后野生型TP309水稻的成活率为35. 4% ±13. 0%，转空载对照TP309/35S-C1301的成活率与野生型TP309水稻无显著差异，而转OsEH基因水稻TP309/EUI-0X的成活率高达85. 4%±3. 6%。这表明OsEn能明显地提高水稻幼苗对干旱胁迫的耐性，使植物在遇到干旱胁迫时能正常生长，不致胁迫致死。这有助于提高植物对干旱胁迫的耐受性，具有广阔的应用前
旦
ο
图I为野生型水稻白狩 毛和ds027突变体的抗旱性分析。其中，A为未进行干旱处理的野生型水稻白狩毛和ds027突变体；B为干旱处理的野生型水稻白狩毛和ds027突变体；C为干旱处理重新复水后的植株；D为复水后野生型水稻白狩毛和ds027突变体的成活率统计。A-D中，WT均表示野生型水稻白狩毛；ds027均表示ds027突变体水稻。图2为ds027等位突变体水稻M187和eui-Ι的抗旱性分析。其中，M187表示M187突变体水稻；Kitaake表示粳稻品种Kitaake (M187遗传背景)；ZS97表示籼稻品种珍汕97 (eui-Ι遗传背景)。图3为35S-C1301-0SEH载体的结构示意图。图4为转OsEH基因水稻的抗旱性分析。其中，I和2表示未转基因的水稻品种TP309 ；3表示转入35S-C1301空载体的水稻品种TP309 ;4_6表示转OsEH基因水稻品种TP309。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。35S-C1301 :参考文献 Zhu Y, Nomura T, Xu Y, Zhang Y, Peng Y, et al. (2006)ELONGATED UPPERMOST INTERNODE encodes a cytochrome P450 monooxygenasethatepoxidizes gibberellins in a novel deactivation reaction in rice. Plant Cell 18:442-456.水稻品种TP309:参考文献Zhu Y，Nomura T，Xu YiZhang YiPeng Y，et al. (2006)ELONGATED UPPERMOST INTERNODE encodes a cytochrome P450 monooxygenasethatepoxidizes gibberellins in a novel deactivation reaction in rice. Plant Cell 18:442-456.共培养基NB基本培养基中含有如下成分(各浓度为终浓度)2mg/L 2，4_D;500mg/L脯氨酸；500mg/L谷氨酰胺；300mg/L酪蛋白；30g/L鹿糖；4. 5g/L组培凝胶；pH5. 6。选择培养基NB基本培养基中含有如下成分(各浓度为终浓度):2mg/L 2，4_D ；500mg/L脯氨酸；500mg/L谷氨酰胺；300mg/L酪蛋白；30g/L鹿糖；4. 5g/L组培凝胶；50mg/L潮霉素；ρΗ6·0。
预分化培养基NB基本培养基中含有如下成分(各浓度为终浓度):2mg/L 6_BA ；
O.5mg/L NAA ;500mg/L谷氨酰胺；300mg/L酪蛋白；30g/L鹿糖；4. 5g/L组培凝胶；50mg/L潮霉素；pH5. 9ο分化培养基NB基本培养基中含有如下成分(各浓度为终浓度):3mg/L 6-BA ；
O.2mg/L NAA ;500mg/L谷氨酰胺；300mg/L酪蛋白；30g/L鹿糖；4. 5g/L组培凝胶；50mg/L潮霉素；pH6. O。生根培养基1/2MS培养基中含有终浓度为4. 5g/L的组培凝胶；pH5. 8。
实施例I、转OsEn基因植物的获得和耐旱性鉴定-,OsEUI基因突变引起植物抗旱性的改变本发明的发明人在干旱胁迫下大规模筛选粳稻品种白狩毛的突变体库(EMS诱变)，从中筛选出一株对干旱敏感的突变体，命名为ds027。在正常生长情况下ds027株高较野生型略高，但与野生型相比对干旱更为敏感(图I)。运用图位克隆的方法克隆了出一个基因，命名为DS027基因，发现DS027基因编码一个细胞色素P450超级家族的蛋白，通过氨基酸序列比对发现DS027基因与之前报道的控制穗颈长度的OsEn基因(AY987039. I)为同一基因。ds027突变体的编码区第1499位发生了一个G到A的单碱基替换，导致第500位的Gly (甘氨酸，中性氨基酸)突变为Asp (天冬氨酸，酸性氨基酸)，进而导致ds027突变体对干旱敏感。为了验证OsEn基因能够正调控植物的抗旱性，本发明的发明人又进一步从粳稻品种Kitaake的EMS诱变突变体库中筛选到另一个EUI的突变体M187，该突变体的编码区第633位核苷酸发生了一个G到A的单碱基替换(TGG — TGA)，使ΕΠ蛋白在211位发生了提前终止。另外进一步本发明的发明人从克隆ΕΠ基因的原作者获得了 eui-Ι突变体，该突变体的遗传背景是籼稻品种珍汕97，在ΕΠ基因的第767为碱基处发生了一个大片段的插入。本发明的发明人检测了 M187和eui-Ι的对干旱胁迫的反应，发现M187和eui_l均对干旱胁迫敏感(图2)。通过以上研究本发明的发明人初步确认了 OsEn基因能够正调控水稻的抗旱性。二、转OsEH基因水稻对非生物胁迫的耐性为了进一步验证OsEH基因能够正调控水稻的抗旱性，又从克隆ΕΠ基因(OsEH基因)的朱永友等人获得了转OsEn基因的水稻TP309/EUI-0X。所述TP309/EUI-0X按照如下方法构建I、重组表达载体35S-C1301-0SEH转化农杆菌利用限制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切序列表中序列4所示的DNA片段(在序列表中序列2所示的OsEn基因的5’端添加Kpn I的识别序列，3’端添加Xba I的识别序列)同时利用Kpn I和Xba I双酶切双元载体35S-C1301，割胶回收，利用T4连接酶将OsEn基因与35S-C1301的骨架片段连接，转化大肠杆菌DH5a，进一步提取质粒，酶切验证并测序。将经测序证实含有序列表中序列2所示的OsEn基因的重组质粒命名为35S-C1301-0sEUI。在重组表达载体35S-C1301-0SEH中，所述序列2所示的OsEH基因位于35S CaMV启动子(序列3)的下游，Kpn I和Xba I酶切位点之间。35S-C1301_0sEn质粒的结构图见图3。将获得的重组表达载体35S-C1301-0sEUI (或35S-C1301空载体)通过电转化方法(参考文献 Mersereau M, Pazour GJ, Das A(1990)Efficient transformationof Agrobacterium tumefaciens by electroporation. Gene 90:149-151)导入农杆菌EHA105(购自美国英俊公司)，得到重组农杆菌。提取质粒，进行PCR扩增和酶切鉴定。将经鉴定表明转入重组表达载体35S-C1301-0SEH的农杆菌命名为EH-35S-C1301_0sEUI。转入35S-C1301空载体的农杆菌命名为EH-35S-C1301。2、根癌农杆菌介导的OsEH超表达水稻的获得用EH-35S-C1301-0sEn重组农杆菌菌液浸染水稻品种TP309愈伤组织；将浸染的愈伤在无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基上24°C暗培养2-4天；清洗愈伤组织，转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选；经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基培养7-10天后再转到分化培养基进行光照培养；待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周，生长良好的小苗经2-3天的炼苗后移栽到温室中。用35S-C1301代替35S-C1301-0sEUI，采用相同的方法，制备转入35S-C1301空载体的对照水稻。3、转OsEH基因水稻的鉴定由于35S-C1301-0SEH质粒带有⑶S报告基因，因此运用⑶S染色的方法对转基因植株进行鉴定。具体方法⑶S活性的组织化学染色分析按照Jefferson等(Jefferson,R. (1987)Assaying chimeric genes in plants The GUS gene fusion system. PlantMolecular Biology Reporter 5:387-405.)的方法进行,待测样品与 5-溴-4-氯-3-口引哚-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)染色反应液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7. O ；0. I %Triton X-100 ;20%甲醇；0. 5mg/ml X-Gluc)于37°C保温过夜后，镜检观察，染上蓝色的为阳性植株。鉴定结果表明转基因的阳性率约为70%，获得了超过50株的阳性植株。将经过上述鉴定表明含有OsEH基因的阳性转基因植株命名为TP309/EUI-0X ;而转入35S-C1301空载体的转基因植株命名为TP309/35S-C1301。4、转OsEH基因水稻对非生物胁迫的耐性将步骤3中获得的第一批种子(Tl代)继续培养获得T2代转基因水稻TP309/EUI-OX的种子，T2代转基因水稻TP309/EUI-0X的种子使用潮霉素进行选择萌发，萌发3天后将幼苗转至土壤，连续10天不浇水，对水稻植株进行抗旱性功能分析。同时，将生长2周的野生型水稻品种TP309的种子和转入35S-C1301空载体的对照水稻品种TP309/35S-C1301的种子采用相同的干旱处理。然后观察水稻叶片表型，统计植株成活率，每种水稻株系各取30株，试验重复三次，结果取平均值。各水稻株系在干旱处理前后的表型如图4所示，在干旱处理前野生型TP309、转空载对照TP309/35S-C1301以及转OsEUI基因水稻TP309/EUI-0X均生长良好，TP309/EUI-0X水稻的株高低于TP309。而在干旱处理10天后，野生型TP309、转空载对照TP309/35S-C1301的叶片全部萎焉，转OsE n基因水稻TP309/EUI-0X呈现出正常的生长状态，叶片舒展。复水后野生型TP309三次重复试验成活率分别为25. 0%，31. 3 %和50. O %，平均成活率为35. 4% ±13. 0% ；、转空载对照TP309/35S-C1301与野生型TP309无显著差异；而转OsEUI基因水稻TP309/EUI-0X的三次重复试验的成活率分别为87. 5%,87. 5%和81. 3%，计算其平均成活率高达85. 4% ±3. 6%，T测验结果表明OsEn极显著的提高了水稻的耐旱性。
权利要求
1.编码OsEn蛋白的核酸分子在调控植物耐旱性中的应用，所述OsEn蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.OsEUI蛋白在调控植物耐旱性中的应用，所述OsEH蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。
3.编码OsEH蛋白的核酸分子在培育耐旱植物中的应用，所述OsEH蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。
4.OsEUI蛋白在培育耐旱植物中的应用，所述OsEH蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。
5.培育耐旱转基因植物的方法，包括如下步骤向目的植物中导入OsEn蛋白的编码基因，得到与所述目的植物相比耐旱性提高的转基因植物； 所述OsEUI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列I衍生的蛋白质。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于所述编码OsEn蛋白的核酸分子，以及所述OsEUI蛋白的编码基因均是如下I)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐旱性相关蛋白的DNA分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述OsEn蛋白的编码基因是通过表达所述OsEn蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的；所述重组表达载体中启动所述OsEn蛋白的编码基因的启动子是35S启动子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述重组表达载体为在35S-C1301的多克隆位点插入所述OsEn蛋白的编码基因得到的重组质粒。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了一种培育耐旱植物的方法。本发明所提供的方法是向目的植物中导入OsEUI蛋白的编码基因，得到与所述目的植物相比耐旱性提高的转基因植物；所述OsEUI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐旱性相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，利用本发明所提供的方法培育出的转OsEUI基因水稻对干旱的耐受性大大提高，进行干旱处理后复水，野生型TP309水稻成活率为35.4％±13.0％，而转OsEUI基因水稻的成活率高达85.4％±3.6％，这一结果对于研究开发抗旱植物新品种将具有重要意义。
文档编号A01H5/00GK102618572SQ20121007575
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者周时荣, 张执金, 张海文, 权瑞党, 黄荣峰 申请人:中国农业科学院生物技术研究所