专利名称：一种简便的腐霉菌快速分离培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种简便、快速分离腐霉菌的选择性培养基。属于微生物技术领域。
背景技术：
腐霉菌是世界性分布的土壤真菌，腐生能力很强，可以侵染150多种蔬菜瓜果作物的根部和幼苗，引起烂种、猝倒、立枯、烂根和烂果。其中，由瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)引起的粹倒病是瓜菜、花丼、药用植物、烟草和豆类、棉花、玉米、高粱等植物幼苗期一种世界范围内的毁灭性病害。由通常在出苗后，茎基部近地面处产生水溃状暗色斑，继而绕茎扩展，逐渐缢缩呈细线状，使幼苗地上部因失去支撑能力而折倒，俗称卡脖子病。湿度大时病部或土表会产生白色棉絮状物，即病菌菌丝、孢囊梗和孢子囊。在气候适宜的条件下，短期内就可爆发，蔓延速度极快，严重情况下可导致植物幼苗大面积死亡，造成缺苗甚至毁种，给农业生产带来严重的经济损失。瓜果腐霉(P. aphanidermatum)属于卵菌门霜霉目腐霉科腐霉属。病菌以卵孢子在12-18cm表土层越冬，并在土中长期存活。猝倒病的初侵染源主要以瓜果腐霉的卵孢子和厚垣孢子在土壤、病残体中越冬，其中土壤中的病残体带菌率最高。在适宜条件下可萌发产生孢子囊，以游动孢子或直接长出芽管侵染幼苗引起猝倒。田间的再侵染主要靠病苗上产出孢子囊及游动孢子，借灌溉水或雨水溅附到贴近地面的根茎上引致更严重的损失。该病主要在幼苗出土后、长出1-2片叶之前发生。尤其是育苗期出现低温、高湿条件，利于发病。为了对瓜果腐霉进行相关研究，以及调查病原菌的田间发病情况，筛选高效的药齐U，最终达到有效防治该病害的目的，分离获得纯化的瓜果腐霉是必要的前提条件。常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75%乙醇和0. I %升汞液表面消毒处理。实际工作中，从田间采集到的样本除被瓜果腐霉侵染外，不可避免的常常带有镰刀菌，立枯丝核菌和疫霉等其他非目标真菌和细菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些非目标真菌或细菌的污染，造成目标菌分离率低或难于分离到目标菌。因此，利用普通培养基从病组织上或土壤中分离瓜果腐霉时，达不到分离纯化的目的。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种杀菌剂组合。本发明所提供的杀菌剂组合，其活性成分如下述I)、2)所示I)、由多菌灵、五氯硝基苯、氟吗啉、利福平组成；2)、由咪鲜胺、五氯硝基苯、氟吗啉、利福平组成；上述杀菌剂中，所述I)中，所述多菌灵、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平的质量份数比为(10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具体为 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70或 50 : 50 : 10 100 ；
所述2)中，所述咪鲜胺、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平的质量份数比为(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具体为 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70或 20 : 50 : 10 100 ；本发明的另一个目的是提供一种用于分离瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培养基。本发明所提供的 用于分离瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的培养基,为如下I或II所示I、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述I)所示杀菌剂得到的；II、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述2)所示杀菌剂得到的；上述培养基中，所述I所示培养基中，所述多菌灵在所述PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL-50 V- g/mL,具体为 10 V- g/mL、20 u g/mL 或 50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL-50 V- g/mL,具体为10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟吗啉在所述PDA培养基中的浓度为g/mL-10 u g/mL,具体为5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 ii g/mL-IOOu g/mL，具体为50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培养基中，所述II所示培养基中，所述咪鲜胺在所述PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL 20 V- g/mL,具体为 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL-50 V- g/mL,具体为10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟吗啉在所述PDA培养基中的浓度为5 V- g/mL-10 u g/mL,具体为5 u g/mL、7 u g/mL或10 ii g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 u g/mL-100 u g/mL,具体为50 u g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL ；上述培养基在分离瓜果腐霉(P. aphanidermatum)中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的分离瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的方法,包括如下步骤用上述任一所述培养基进行分离，用于分离的样本为感染瓜果腐霉(P. aphanidermatum)的植物的根茎或土壤。实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离瓜果腐霉，可解决瓜果腐霉等植物病原腐霉分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。本发明为成功分离其他腐霉属菌株提供了参考，为进行田间一次性分离以及室内纯化瓜果腐霉提供技术支持。本发明选择培养基可用于简便、快捷地从病株组织上或病田土壤中一次性分离瓜果腐霉以及室内纯化瓜果腐霉。
图I为三种抗生素对植株根茎表面细菌的抑制作用。图2为三种抗生素对土壤中细菌的抑制作用。图3为瓜果腐霉病的发病情况和分离情况。A为健康的黄瓜幼苗；B为瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；C为田间瓜果腐霉引起的猝倒病的病苗；D为瓜果腐霉引起的草坪腐霉枯萎病；E为育苗阶段瓜果腐霉引起的猝倒病；F为发病植株中分离到的瓜果腐霉。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。多菌灵原药购自安徽广信农化股份有限公司(安徽广信农化集团有限公司)，其主要活性成分物质的化学名称是N-(2_苯骈咪唑基)_氨基甲酸甲酯，通用名称为多菌灵，分子式C9H9N302。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为98. 9%。五氯硝基苯原药购自山西三立化工有限公司(原山西省临汾有机化工厂)，其主要活性成分物质的化学名称是五氯硝基苯，通用名称为五氯硝基苯，分子式C6C15N02。该药中五氯硝基苯的质量百分含量为95%。咪鲜胺(又叫“咪酰胺”)原药购自海南力智生物工程有限公司，其主要活性成分物质的化学名称是N-丙基-N-[2-(2，4，6-三氯苯氧基)乙基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。该药中咪鲜胺的质量百分含量为97%。氟吗啉原药购自沈阳化工研究院，其主要活性成分物质的化学名称是4-[3_(3，
4-二甲氧基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸]吗啉，通用名称为氟吗啉，分子式C21H22FN04。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为96%。 青霉素、利福平、氯霉素均购自北京拓英坊科技有限公司。实施例I、三种真菌抑制剂、一种疫霉抑制剂和三种抗生素对瓜果腐霉抑制作用一、三种真菌抑制剂和一种疫霉抑制剂对瓜果腐霉的抑制作用以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂，以丙酮或甲醇为咪鲜胺、五氯硝基苯和氟吗啉的溶剂，分别配制5000ii g/mL的四种药剂母液IOml ;其中，将多菌灵、五氯硝基苯和咪鲜胺这三种真菌抑制剂的母液分别配制系列浓度为50 u g/mL、20 u g/mL和10 u g/mL的含药PDA平板；将氟吗啉这种疫霉抑制剂的母液分别配制系列浓度为20 u g/mL、10 u g/mL和5 y g/mL的含药PDA平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定瓜果腐霉对菌灵、五氯硝基苯、咪鲜胺和氟吗啉的敏感性。将供试的瓜果腐霉菌株在PDA平板上于25°C预培养2d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有四种药剂系列浓度的PDA含药平板中央(各浓度含等量有机溶剂)，于25°C下黑暗培养，2-3d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％ )，抑制率(%) = [(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/ (对照菌落增长直径)]X 100。测定了供试的四种真菌抑制剂对瓜果腐霉的抑制作用，结果如表I所示，不同浓度的多菌灵、五氯硝基苯对瓜果腐霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50ii g/mL的多菌灵、五氯硝基苯作为选择性药剂；50ii g/mL咪鲜胺对瓜果腐霉的抑制率为27%，10-20 ii g/mL浓度的咪鲜胺对瓜果腐霉抑制率较低，所以可以采用10-20ii g/mL的咪鲜胺为分离腐霉中使用的选择性药剂。浓度为20 g/mL氟吗啉对瓜果腐霉的抑制率大于
11.2%,IOu g/mL氟吗啉对瓜果腐霉抑制率为4. 5%，2 ii g/mL的浓度对辣椒疫霉没有抑制作用，因此，可以采用2-10 ii g/mL浓度的氟吗啉作为选择性药剂；表I四种真囷抑制剂对瓜果腐霉的抑制作用
权利要求
1.一种杀菌剂，其活性成分如下述I)或2)所示 1)、由多菌灵、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平组成； 2)、由咪鲜胺、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平组成。
2.根据权利要求I所述的杀菌剂，其特征在于 所述I)中，所述多菌灵、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平的质量份数比为(10-20) (10-50) (10-50) (5-10) (50-100)，具体为 10 : 10 : 5 : 50 或 20 : 20 : 7 : 70 或50 50 10 100 ； 所述2)中，所述咪鲜胺、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平的质量份数比为(10-20) (10-50) (5-10) (50-100)，具体为 10 : 10 : 5 : 50 或 15 : 20 : 7 : 70 :或 20 : 50 : 10 : 100。
3.一种用于分离瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的培养基,为如下I或II所示 I、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述I)所示杀菌剂得到的； II、是向PDA培养基中添加权利要求I或2中所述2)所示杀菌剂得到的。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于 上述培养基中，所述I所示培养基中，所述多菌灵在所述PDA培养基中的浓度为IOii g/mL-50 V- g/mL,具体为10 u g/mL、20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培养基中的浓度为IOii g/mL-50 V- g/mL,具体为IOy g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟吗啉在所述PDA培养基中的浓度为g/mL -10 u g/mL,具体为5 ii g/mL、7 u g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 u g/mL-100 u g/mL,具体为50 u g/mL、70 u g/mL或100u g/mL ； 上述培养基中，所述II所示培养基中，所述咪鲜胺在所述PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL-20 V- g/mL,具体为 10 u g/mL、15 ii g/mL 或 20 ii g/mL ;所述五氯硝基苯在所述 PDA培养基中的浓度为10 V- g/mL-50 V- g/mL,具体为10 V- g/mL>20 u g/mL或50 ii g/mL ;所述氟吗啉在所述PDA培养基中的浓度为g/mL-10 u g/mL,具体为5 ii g/mL、7 ii g/mL或IOy g/mL ;所述利福平在所述PDA培养基中的浓度为50 ii g/mL-IOOu g/mL，具体为50 y g/mL、70 u g/mL 或 100 u g/mL。
5.权利要求3或4所述培养基在分离瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)中的应用。
6.一种分离瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的方法，包括如下步骤用权利要求3或4中所述培养基进行分离，用于分离的样本为感染瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)的植物的根莖部组织或土壤。
全文摘要
本发明公开了一种简便、快速的分离腐霉菌的选择性培养基，尤其适用于瓜果腐霉的分离。属于微生物技术领域。该培养基是向PDA培养基中添加如下1)或2)所述杀菌剂得到的1)、由多菌灵、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平组成；2)、由咪鲜胺、五氯硝基苯、氟吗啉和利福平组成；实验证明，本发明的PDA选择性培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。用本发明的PDA选择性培养基分离瓜果腐霉等腐霉属卵菌，可解决瓜果腐霉等植物病原腐霉分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。
文档编号A01N47/38GK102754655SQ20121025062
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者刘鹏飞, 贾睿哲 申请人:中国农业大学