复合灵芝菌株共培养方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种灵芝的培养方法，特别涉及一种将二种或二种W上的灵芝菌株共 培养的方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganodermaspp.)为灵芝属的生物，是一年生白腐型真菌，主要分布于热 带、亚热带及温带。目前全世界约有150-200种天然灵芝被鉴定发表，台湾有17种，其中 较常见的 7 种分另山为G.australe,G.tropicum,G.weberianum,G.boninense,G.lucidum, G.japoni州m与G.formosana。其中，G.lucidum即一般所称的赤芝，G.japoni州m为一般所 称的紫芝，G.formosana则是台湾特有种。
[0003] 灵芝已经被证实具有降血糖、降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节、护肝等 生理活性，其生理活性物质包括；多糖（polysaccharide)、H聰类（t;rite;rpenoids)、超氧 化歧化酶（superoxidedismutase,SOD)、蛋白质（protein)、错金属（germanium)、腺巧 (adenosine)、类固醇（steroid)等，其中，灵芝多糖体的效果备受关注。
[0004] 为了因应市场的需求，目前已有人工生产灵芝的方式，包括：
[0005] -、生产灵芝子实体：
[0006] 1.通过段木培养灵芝子实体；
[0007] 2.通过木屑或米織组成的太空包培养灵芝子实体
[0008] 二、生产灵芝菌丝体：
[0009] 在水中添加碳源（例如葡萄糖）、氮源（例如酵母抽出物）W及无机盐类（例如碳 酸巧、磯酸二氨钟、磯酸氨二钟、硫酸镇），液态培养灵芝菌丝体。
[0010] 虽然液态培养灵芝菌丝体的方式能在有限的时间、空间下生产大量灵芝菌丝体及 灵芝多糖，但一般须添加组成单纯、可溶解的碳源、氮源。送样组成单纯的碳源、氮源无法提 供生长所需的无机盐类，因此，相较于子实体的培养方式，一般须额外添加许多碳酸巧、磯 酸二氨钟、磯酸氨二钟、硫酸镇等无机盐类，供灵芝菌丝体正常生长。
[0011] 如此一来，发酵液中往往残留未被完全利用的无机盐类，长期饮用将对身体、肾脏 造成极大的负担。因此，亟需开发一种液态培养灵芝的新颖方式，能兼顾发酵产物直接利用 的安全性、又能确保灵芝菌丝体的产量及发酵液中对人体有益的活性成分。
【发明内容】
[0012] 鉴于公知技术的缺陷，本发明提供一种复合灵芝菌株共培养方法，使在未添加无 机盐类的培养基中仍具有高菌丝体产量及富含对人体有益的活性成分。
[0013] 本发明又提供一种复合灵芝菌株共培养方法，能显著增加灵芝菌丝体的抗氧化能 力。
[0014] 本发明再提供一种复合灵芝菌株共培养方法，能显著增加发酵液中的胞外多糖 量。
[0015] 于一较佳实施例中，本发明提供一种灵芝（Ganodermaspp.)的培养方法，其特征 在于，W至少两种灵芝菌株共同培养；所述方法包括W下步骤：
[0016] (a)接种一第一灵芝菌株至一第一培养基上；
[0017] (b)接种一第二灵芝菌株至一第二培养基上；
[0018](C)从该第一培养基取出一第一灵芝菌株菌丝；
[0019] (d)从该第二培养基取出一第二灵芝菌株菌丝；
[0020] (e)将该第一灵芝菌株菌丝W及该第二灵芝菌株菌丝接种至一第一液体培养基 中，震动培养至少7天，W得到一发酵液。
[0021] 于一较佳实施例中，该第一液体培养基由水、酵母抽出物、W及葡萄糖组成。
[0022] 于一较佳实施例中，该第一液体培养基中不添加碳酸巧、磯酸二氨钟、磯酸氨二 钟、硫酸镇、W及其他无机盐类。
[0023] 于一较佳实施例中，该步骤（e)W11化pm震动培养至少7天；抑或是，该步骤（e) 之后还包括一步骤（f);将步骤（e)的该发酵液与一第二液体培养基混合，于11化pm下共 同培养至少7天。
[0024] 于一较佳实施例中，该第一灵芝菌株W及该第二灵芝菌株为赤芝（Ganoderma lucidum)。
[00巧]于另一较佳实施例中，本发明提供一种灵芝（Ganodermaspp.)的培养方法，其特 征在于，W至少二种灵芝菌株共同培养；抑或是，其特征在于，W至少H种或至少四种灵芝 菌株共同培养。
[0026] 本发明还提供一种食品的制备方法，其步骤包括：
[0027] (a)将至少二种灵芝菌株培养于一培养基中，获得一可食用发酵液，其中，该培养 基中未添加无机盐类，且该可食用发酵液中包含一第一多糖量；
[0028] 化）W高温灭菌方式将该可食用发酵液进行灭菌处理，使溶解在该可食用发酵液 中的多糖量提升至至少0. 296g/L。
[0029] 本发明再提供一种食品，W至少二种灵芝菌株共同培养而得的一可食用发酵液。
[0030] 于一较佳实施例中，溶解在该可食用发酵液中的多糖量至少为0.24g/L。
[0031] 于一较佳实施例中，该可食用发酵液中的菌丝体超氧化歧化酵素（Superoxide Dismutase)活性至少为 350U/g。
[0032] 本发明又提供一种食品，W下列步骤制成：
[0033] (a)W至少二种灵芝菌株共同培养；
[0034] (b)W高温灭菌方式进行灭菌处理；
[0035](C)去除大多数菌丝体；
[0036] 其中，该食品中的多糖量至少为0.296g/L。
[0037] 于一较佳实施例中，其中该高温灭菌方式是于12rC灭菌至少15分钟。
[0038] 于一较佳实施例中，用于共同培养该二种灵芝菌株的培养基中未添加无机盐类。
[0039] 于一较佳实施例中，用于共同培养该二种灵芝菌株的培养基中未添加碳酸巧。
[0040] 于一较佳实施例中，用于共同培养该二种灵芝菌株的培养基中未添加磯酸二氨 钟。
[0041] 于一较佳实施例中，用于共同培养该二种灵芝菌株的培养基中未添加磯酸氨二 钟。
[0042] 于一较佳实施例中，用于共同培养该二种灵芝菌株的培养基中未添加硫酸镇。
【附图说明】
[0043] 图1;单株及复合灵芝菌株于3(TC培养7天的菌丝体量。
[0044] 图2;单株及复合灵芝菌株于3(TC培养7天的菌丝体超氧化歧化酵素活性。
[0045] 图3;单株及复合灵芝菌株于3(TC培养7天的胞外多糖量。
[0046] 图4;复合灵芝菌株于3(TC培养7(A)及21度）天所得胞外多糖对小鼠巨瞻细胞存 活率的影响。
[0047] 图5;复合灵芝菌株于3(TC培养7及21天所得胞外多糖对小鼠巨瞻细胞吞瞻活性 的影响。
[0048] 图6;未灭菌（A)与灭菌度）复合菌株发酵液胞外多糖对小鼠巨瞻细胞存活率的 影响。
【具体实施方式】
[0049] 鉴于公知技术的缺陷，发明人依据多年的研究成果及经验，认为应能建立一种通 过灵芝菌株养灵芝菌株的相互共生、竞争关系，在极简约、低无机盐或不含无机盐的液态培 养基条件下，产出大量且富含营养价值的复合灵芝菌丝体，同时兼顾食品安全。
[0050] W下是利用本发明的实施例的详细说明书，W及本发明的技术、特点。然本实施例 并非用W限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内所作的各种 更动、润饰，均应包含在本发明的权利要求内。
[0051] 制备培养基：
[005引1.液态培养基；本发明的液态培养基由水、酵母抽出物（YeastExtract,产品编 号0203/0-PW-L;厂牌Bio-springer,法国）、W及葡萄糖组成。将水、酵母抽出物、W及葡 萄糖混合后，于12rC灭菌15分钟。其中，水可W为去离子水或无菌水，但不W此为限。较 佳者，液态培养基中的酵母抽出物浓度为0. 5%~1%，但不W此为限。较佳者，液态培养基中 的葡萄糖浓度为2%~2. 5%，但不W此为限。
[005引 2.平板培养基；本发明的平板培养基由水、酵母抽出物（产品编号0203/0-PW-L;厂牌Bio-springer,法国）、葡萄糖、W及食品级洋菜醋（Agarose;厂牌BD)组成。将水、酵 母抽出物、葡萄糖、W及食品级洋菜醋混合后，于12rC灭菌15分钟，倒入培养皿中制成平 板培养基。其中，水可W为去离子水或无菌水，但不W此为限。较佳者，平板培养基中的酵 母抽出物浓度为0. 5%~1%，但不W此为限。较佳者，平板培养基中的葡萄糖浓度为2%~ 2. 5%，但不W此为限。
[0054]实验一；复合灵芝菌株共培养
[00巧]五株灵芝属菌株A、B、C、D、H在分类上均为赤芝（Ganodermalucidum)，且均购自 新竹食品工业发展研究所生物资源保存及研究中必，依专利法的相关规定，不需寄存（A菌 株产品编号BCRC36111 ;B菌株产品编号BCRC36123 ;C菌株产品编号BCRC36674巧菌株产 品编号BCRC36821)。小鼠巨瞻细胞RAW264. 7亦购自新竹食品工业发展研究所生物资源保 存及研究中必（新竹，台湾），依专利法的规定，不需寄存。
[0056] 将A、B、C、D、H分别接种至第一培养基、第二培养基、第H培养基、第四培养基、第 五培养基上，于3(TC培养7天。其中，该些培养基可W是本案的平板培养基（Plate)或本 案的液态培养基度roth)，但不W此为限，例如也可W是斜面培养基（Slant)或一般