一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法
【专利摘要】本发明提供了一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法，收集方法包括如下步骤：将沙子放入能封口的多孢分离收集容器中，灭菌、干燥；选用蛹虫草子囊果发育成熟的子实体，放入有沙子的多孢分离收集容器中；振荡多孢分离收集容器，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。将收集到的沙子置于干燥无菌容器中密封，室温避光或冰箱冷藏保存。本发明提供的收集方法操作简单、提高了子囊孢子的收集率，保存的子囊孢子活化后能够保留蛹虫草原始亲本的遗传性状，并用于筛选抗逆新品种。
【专利说明】一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛹虫草栽培【技术领域】，具体地，涉及一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法。
【背景技术】
[0002]蛹虫草Cordyceps militaris (L.ex Fr)Link,又名北冬虫夏草、北虫草，寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上。生长在低海拔的平原地域，主要分布在东北、华北、西北等地。现代研究表明，蛹虫草含有虫草素(3’_脱氧腺苷)、虫草酸(D-甘露醇)、腺苷、虫草多糖、麦角留醇、超氧化物歧化酶(S0D)、硒(Se)等化学成分。具有提高人体免疫功能、抗癌、抗菌、抗疲劳、抗衰老、抗惊厥、耐缺氧、镇静、壮阳固肾等作用。同时还具有减肥、瘦身、美容等功效。
[0003]近年来，很多研究都表明，人工栽培的蛹虫草化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，但价格却远远低于冬虫夏草，因此，蛹虫草的开发应用具有极大的潜在市场。人工培养蛹虫草要得到子实体，关键是该蛹虫草菌株要有形成子实体的能力，不同菌株所具备的遗传背景是不一样的，所以它们具备形成的子实体的能力有差异。然而，在实际生产中，即使是优势蛹虫草菌株，随着菌种传代、转接次数的增加或保藏时间的延长，菌种资源极易退化。
[0004]孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。目前的孢子分离法主要有:(一)单孢分离法:是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发 成菌丝体来获得纯菌种的方法。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。(二)多孢分离法是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种:1.种菇孢子弹射法:选择适应性强的八九分成熟的种菇，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12~20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。还可用孢子采集器收集孢子。按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20°C左右恒温箱培养。2.褶上涂抹法:选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。3.钩悬法:取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳)，用无菌不锈钢丝(或铁丝、棉线等其他悬挂材料)悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。4.贴附法:将成熟的菌褶或耳片取一小块，用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6~12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。孢子分离得到的母种、进一步提纯复壮，当母种定植一周左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大。孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。上述方法存在两个不足:第一，操作复杂。第二，只能收集成熟的被弹射出的孢子，而成熟的却没被弹射出的成熟孢子却不能收集到。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种蛹虫草子囊孢子的收集和保存方法，以克服上述不足。
[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种蛹虫草子囊孢子的收集方法，其包括如下步骤:
[0007]I)将沙子放入能封口的多孢分离收集容器中，灭菌、干燥；
[0008]2)蛹虫草子囊果发育成熟的子实体放入步骤I)中的多孢分离收集容器中；
[0009]3)振荡多孢分离收集容器，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。
[0010]其中，所述步骤I)沙子为中性干燥沙子，其通过如下方法获得:
[0011]a)将河沙过60目筛，弃去大颗粒及杂质；
[0012]b)再用80目过筛，弃去细沙，收集未过筛的沙子；
[0013]c )去除沙子中的铁质；
`[0014]d)用10%_20%的盐酸浸泡沙子24h后，倒去盐酸，用水洗泡至中性，烘干沙子。
[0015]进一步地，步骤c)中可使用吸铁石除去沙子中的铁质。
[0016]本发明使用的多孢分离收集容器，可以为任意形状的可密封的玻璃容器或金属容器。
[0017]其中，步骤I)所述的沙子放入能封口的多孢分离收集容器中的放置方法是将等质量的沙子与蒸馏水混合后，按体积比1:3-10置于多孢分离收集容器中。
[0018]其中，步骤I)所述的灭菌是121°C,湿热灭菌30min。
[0019]其中，步骤I)所述的干燥是80°C干燥24_48h。
[0020]上述灭菌和干燥的步骤中，多孢分离收集容器均严格封口进行灭菌和干燥。
[0021]其中，步骤2)蛹虫草子囊果发育成熟的子实体优选l_2cm子囊果丰富的子实体头部，放入步骤I)中的多孢分离收集容器中，室温放置10-30天，至子实体完全干燥。
[0022]其中，步骤2)所述的子实体放入多孢分离收集容器中，放入的子实体条数与容器中沙子的个数质量比为I条:2.5-5g。
[0023]在本发明提供的蛹虫草子囊孢子收集方法的步骤2)中，室温放置10-30天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
[0024]其中，步骤3)所述的振荡是将多孢分离收集容器以80-200r/min转速振荡24-48h。
[0025]本发明提供的一种蛹虫草子囊孢子的收集方法还包括将干燥的子实体取出。[0026]本发明还提供一种蛹虫草子囊孢子的保存方法，将上述方法获得的含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子置于干燥无菌容器中密封保藏。
[0027]进一步地，本发明保存蛹虫草子囊孢子的保藏条件为室温避光或0_6°C冷藏。
[0028]本发明提供了蛹虫草子囊孢子收集方法在蛹虫草育种中的应用。
[0029]本发明利用细沙的摩擦作用，当干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果受到到细沙的摩擦作用从而破碎并释放其中的子囊孢子，落入沙子载体中。通过收集肉眼可视的沙子，从而收集到肉眼不可见的蛹虫草子囊孢子，因此本方法不仅能够收集到弹出的子囊孢子，还能收集到未弹出的子囊孢子，子囊孢子的收集率达到100%，提高了子囊孢子的收集效率。而现有技术中采用弹射方法收集的子囊孢子只是子囊果成熟后弹射出的部分子囊孢子，子囊孢子数量不到子实体子囊果中所有子囊孢子总量的1%。本发明进一步将干燥的子实体取出，将子囊孢子活化或保存备用，最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集和保藏的目的。本发明提供的蛹虫草子囊孢子收集方法操作简单，节省人力物力，同时提高了子囊孢子的收集率，提供的蛹虫草子囊孢子保存方法能在2-4年内有效保持子囊孢子的生物活性，保持了原始亲本的遗传性状，为选育新菌种提供有效方法，具有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
[0030]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0031]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]实施例1蛹虫草子实体的培养
[0033]1、菌种:采用自主筛选获得的菌株编号为HX-64蛹虫草菌株(购自北京市农林科学院生物中心)。
[0034]2、液体摇瓶用培养基(IL):去皮土豆300g (煮汁)、葡萄糖10g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾 0.5g、硫酸镁 lg、水 1000ml, ρΗ7.2。
[0035]3、子实体生产营养液:黄豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸镁0.05%、维生素BllOmg/lOOOml的比例配成营养液，调整pH在5.6~7.2。
[0036]4、采用PP料制成的培养盒(高10cm，上底直径12cm，下底直径8cm)。每盒大米40g和子实体生产营养液56g分装混合，灭菌接种。
[0037]5、菌丝培养管理
[0038]培养室适宜温度为18~25°C，湿度为70~85%，避光培养8天。菌丝布满表面后开始通风培养。
[0039]6、子实体培养
[0040]在按种后待菌丝布满整个培养容器并深扎到容器底，开始见光，但避免太阳光直射。若培养室光线太暗，可补充日光灯照。菌丝见光后，在培养料表面或四周见有桔黄色色素形成，并出现米粒状的桔黄色菌蕾，菌蕾伸长后即成为子实体。子实体培育阶段，温度应为20~23°C，超过25°C生长缓慢，湿度应提高到80~85%。超过27°C菌丝萎缩不能出菌束。在子实体培养后期，逐渐加大室内空气的流通和交换，培养室培养阶段若发现污染应立即清除。[0041]7、采收:采后后平均鲜重达到28.7克/培养盒。
[0042]实施例2蛹虫草子囊孢子的收集和保存(I)
[0043]( I)多孢载体吸附沙的准备:[0044]将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
[0045](2)多孢收集容器的灭菌及干燥处理:
[0046]取处理好的多孢载体吸附沙约25g与等量蒸馏水混合后放入250mL三角瓶中，然后整体121°C湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中80°C干燥24小时直至完全干燥。
[0047](3)多孢分离亲本子实体的选择:
[0048]选取实施例1中的正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子实体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
[0049](4)多孢的收集:
[0050]选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头部用剪刀切取lcm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶收集5条。
[0051]室温放置10天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
[0052]静止干燥结束后，将多孢分离收集瓶放入摇床，以80r/min的转速进行震荡24小时。
[0053]由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率为100%。
[0054](5)多孢的保存
[0055]小试管用160°C 2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用固体石蜡封口，防止水分进入，室温避光保存2年。
[0056]实施例3蛹虫草子囊孢子的收集和保存(2)
[0057](I)多孢载体吸附沙的准备:
[0058]将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用15%盐酸浸泡，24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
[0059](2)多孢收集容器的灭菌及干燥处理:
[0060]取处理好的多孢载体吸附沙约50g与等量蒸馏水混合后放入250mL三角瓶中，然后整体121°C湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中80°C干燥48小时直至完全干燥。
[0061](3)多孢分离亲本子实体的选择:
[0062]选取实施例1中正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子实体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
[0063] (4)多孢的收集:
[0064]选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头部用剪刀切取2cm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶大约收集10条。
[0065]室温放置30天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
[0066]静止干燥结束后，将多孢分离收集瓶放入摇床，以200r/min的转速进行震荡48小时。
[0067]由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率为100%。
[0068](5)多孢的保存
[0069]小试管用160°C 2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用固体石蜡封口，防止水分进入，保藏条件为0°C冷藏4年。
[0070]实施例4蛹虫草子囊孢子的收集(3)
[0071](I)多孢载体吸附沙的准备:
[0072]将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用20%盐酸浸泡，24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干。
[0073](2)多孢收集容器的灭菌及干燥处理:
[0074]取处理好的多孢载体吸附沙约50g与等量蒸馏水混合后放入500mL三角瓶中，然后整体121°C湿热灭菌30min。灭菌后放入干燥箱中80°C干燥38小时直至完全干燥。
[0075](3)多孢分离亲本子实体的选择:
[0076]选取实施例1中正在栽培瓶中生长后期的没有受到污染的，子实体生长周期短、条形整齐，粗细均匀、颜色橘红、子囊果发育成熟的栽培瓶经过瓶表面消毒后放入超净工作台。
[0077](4)多孢的收集:
[0078]选取子囊果发育成熟的子实体经过无菌操作将子囊果丰富的头部用剪刀切取2cm，放入灭菌干燥过的多孢分离收集瓶中，每瓶大约收集8条。
[0079]室温放置25天，直至子实体完全干燥。在这期间，一部分成熟的子囊果会自然弹射子囊孢子到细沙上，有部分成熟的子囊果尚未弹射子囊孢子就干燥了，还有一部分未完全成熟的子囊果没有进入弹射时期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果内。
[0080]静止干燥结束后，将多孢分离收集瓶放入摇床，以150r/min的转速进行震荡40小时。
[0081 ] 由于细沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到细沙的摩擦作用从而破碎进而释放其中的子囊孢子。然后将干燥的子实体部分取出，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。最终实现了蛹虫草子囊孢子的分离、收集的目的。本实施例可收集到子实体上子囊果内的全部子囊孢子，收集率达到100%。
[0082](5)多孢的保存
[0083]小试管用160°C 2小时干热灭菌，将收集的含有弹射出成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子分装于小试管中，然后用固体石蜡封口，防止水分进入，保藏条件为6°C冷藏3年。
[0084]实施例5收集保存的蛹虫草子囊孢子的活化和培养
[0085]分别取实施例2-4收集和保存的蛹虫草子囊孢子，在无菌条件下打开多孢保藏管，取部分沙粒于PDA斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙粒于适宜的液体培养基(IL液态培养基的配方为去皮土豆300g(煮汁)、葡萄糖10g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁Ig^K 1000ml)中，增殖培养后直接做出菇实验或再转接斜面。
[0086]实施例2-4保存的蛹虫草子囊孢子活化后，按照实施例1记载的方法进行蛹虫草子实体的培养。培养结果发现，实施例2-4保存的蛹虫草子囊孢子均能培养得到子实体，采后后平均鲜重分别达到28.7,28.9,28.8克/培养盒，子实体的产量和生物性状与实施例1培养得到的子实体均无显著差异，说明本发明收集和保存蛹虫草子囊孢子的方法能够保留亲本遗传性状。本实施例结果说明:上述实施例2-4中的收集的蛹虫草子囊孢子在室温或普通冰箱条件下菌种保存2-4年仍具有生物活性，且子实体产量和生物转化率无显著差异，基本保留了原始亲本的遗传性状。
[0087]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种蛹虫草子囊孢子的收集方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)将沙子放入能封口的多孢分离收集容器中，灭菌、干燥； 2)蛹虫草子囊果发育成熟的子实体放入步骤I)中的多孢分离收集容器中； 3)振荡多孢分离收集容器，收集含有弹射出的成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子。
2.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，所述步骤I)沙子为中性干燥沙子，其通过如下方法获得: a)将河沙过60目筛，弃去大颗粒及杂质； b)再用80目过筛，弃去细沙，收集未过筛的沙子； c)去除沙子中的铁质； d)用10%-20%的盐酸浸泡沙子24h后，倒去盐酸，用水洗泡至中性，烘干沙子。
3.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，步骤I)所述的沙子放入能封口的多孢分离收集容器中的放置方法 是将等质量的沙子与蒸馏水混合后，按体积比1:3-10置于多孢分离收集容器中。
4.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，步骤I)所述的灭菌是121°C，湿热灭菌30mino
5.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，步骤I)所述的干燥是80°C干燥24-48h。
6.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，步骤2)所述的子实体放入多孢分离收集容器中，放入的子实体条数与容器中沙子的质量比为I条:2.5-5g。
7.如权利要求1所述的收集方法，其特征在于，步骤3)所述的振荡是将多孢分离收集容器以80-200r/min转速振荡24-48h。
8.如权利要求1-7任一所述的收集方法，其特征在于，步骤3)中还包括将干燥的子实体取出。
9.一种蛹虫草子囊孢子的保存方法，其特征在于，将权利要求1-6任一所述方法收集的含有弹射出成熟的子囊孢子和未弹射出的成熟的子囊孢子的沙子置于干燥无菌容器中密封保藏，保藏条件为室温避光或0-6°C冷藏。
10.权利要求1-7任一所述的子囊孢子收集方法在蛹虫草育种中的应用。
【文档编号】A01G1/04GK103571788SQ201210282858
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月9日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】胡健 申请人:北京中怡远大机电设备有限公司