专利名称：定向诱导合成金属硫蛋白的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种定向诱导合成金属硫蛋白及分离纯化工艺。
背景技术：
金属硫蛋白是一种含有大量CM和Zn的蛋 白质,广泛存在于生物体内。金属硫蛋白相对分子质量600(Γ10000，富含氨基酸和半胱氨酸，并能大量结合金属离子，具有很强的生物活性。大量研究结果表明，金属硫蛋白有下列功能I、清除自由基，措抗电尚福射；2、参与微量元素的贮存、运输和代谢；3、重金属的解毒作用；4、参与激素和发育过程的调节，增强机体对各种应激反应；5、参与细胞DNA的复制和转录,蛋白质的合成与分解，以及能量代谢的调节过程。201110076199. 2公开了一种虫草金属硫蛋白的生产方法。生产步骤为虫草菌一液体培养一过滤一含金属硫蛋白菌体一研磨一有机物变性一去杂蛋白一加热变性一除变性蛋白一超滤浓缩一层析一冷冻干燥成品。201110063616. X公开了嗜冷红酵母中金属硫蛋白的制备工艺,工艺过程为菌株筛选一培养一细胞破壁一凝胶过滤一离子层析一冷冻干燥成品。200910308720. 3公开了从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法。该方法利用富含金属离子生物诱导剂的培养基加入家蝇幼虫培育出成虫，再经漂洗、灭菌、均浆、膜过滤、分离、浓缩、冷冻干燥成品。01128543. 5公开了液体涂层发酵转基因工程菌生产人或动物金属硫蛋白制品的方法。该方法是将转基因工程菌通过深层发酵、培养工程菌、过滤、洗涤、冷冻干燥成品。200910309136. X公开了一种富锌黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富锌养殖，大龄黄粉虫用硫酸锌水溶液饲喂得富锌黄粉虫。200910309135. 5公开了一种富硒黄粉虫的饲养方法，该方法包括幼虫养殖、富硒养殖，大龄黄粉虫用亚硒酸钠水饲喂，得富硒黄粉虫。01131966. 6公开了金属硫蛋白的制备方法，该方法选择金属硫蛋白工程菌，接种于培养液，收集菌体，超声破碎，层析分离，梯度洗脱，收集目标蛋白。金属硫蛋白是一种用途广泛的金属蛋白物，但是由于来源的局限性，科技人员一直在研究开发产生金属硫蛋白的原料，产率和效率是一个长期关注的问题。
发明内容
针对现有金属硫蛋白来源的局限性，本发明提供一种定向诱导合成金属硫蛋白的工艺。本发明的目的是通过以下技术方案实现的1、选择合适的原材料配制培养基；2、培养基二次发酵复制；3、九龙虫虫卵培殖；4、九龙虫虫卵植入复制培养基中；5、超声波振荡培育；6、九龙虫成虫处理；7、微滤与超滤；8、超声驻波液相制备色谱分离纯化；9、冷冻干燥至成品；具体步骤如下
(O选择合适的原材料配制培养基，所述培养基由IOOOg麦麸或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g 赖氨酸、0 20g 甘氨酸、l(T80g 胱氨酸、l(T20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、0 10gCaS04、OlOgZnSO4 混合而成；
(2)上述培养基喷淋去离子水，保持温度25 45°C，时间48 120h，使培养基充分发酵；
(3)将九龙虫雄虫与雌虫按23比例混合，保持温度25 30°C，湿度60 85%，雄虫与雌虫交配5 7天产卵，虫卵在8 12天孵化出幼虫，收集幼虫；
(4)将5 8g幼虫置于前述的发酵培养基中，保持温度2(T30°C、湿度6(Γ85%培养，待幼虫第一次脱皮后超声波振荡培育；
(5)待幼虫脱皮6次后的第4飞天，收集九龙虫幼虫，用去离子水清洗，甩干九龙虫幼虫表面水分；
(6)甩干的九龙虫幼虫捣碎，加热8(Γ100 ，时间5 10min，离心分离，收集分离液；
(7)分离液进行微滤与超滤处理，收集浓缩液；
(8)100mL浓缩液溶于100(T2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里连续分尚纯化金属硫蛋白；
(9)将分离纯化的金属硫蛋白冷冻干燥至成品。本发明根据金属硫蛋白化学成份与结构特征，选择并配制合适的培养基；以九龙虫虫卵作为生物合成的载体，随着九龙虫生长过程，采用化学成分，超声波定向催化使得九龙虫机体大量合成金属硫蛋白，该金属硫蛋白为白色或微黄色冻干品，相对分子量6800Da,分子直径50A，等电点为4，含量为90-99%。本发明不仅为金属硫蛋白生产提供了一种新的工艺，而且由于分离过程的特殊性，确保了金属硫蛋白的生物活性，具有工业化生产的价值。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步描述。实施例I :
(1)取IOOOg麦麸，100 200g大豆豆粉，10 20g赖氨酸，50 80g胱氨酸，10 15gCuS04，5 IOgNaCl,及l(T20gCdS04，5 IOg CaSO4混合均匀成为培养基；
(2)上述培养基喷淋50(Tl000mL去离子水，保持温度25 45°C，时间48 120h，培养基充分发酵；
(3)选羽化后1(Γ20天的九龙虫，将雄虫与雌虫按2:3比例混合，保持温度25 30°C，湿度6(Γ85%，雄虫与雌虫交配5 7天产卵，虫卵在8 12天孵化出幼虫，收集幼虫；
(4)将5 8g幼虫置前述的发酵培养基中，保持温度2(T30°C、湿度6(Γ85%培养，待幼虫第一次脱皮后，用超声波发生器在频率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超声处理2 lOmin，每间隔8 IOh重复超声处理一次，幼虫培育周期5(T80d ；
(5)待幼虫脱皮6次后的第4飞天，收集九龙虫幼虫，IOOOg九龙虫幼虫用2L 10L去离子水清洗3次，甩干九龙虫幼虫表面水分；
(6)甩干的九龙虫幼虫放入组织捣碎匀浆机中以1000(Tl5000r/min捣碎，加热8(Tl00°C，时间5 lOmin，离心机75(Tl250r/min分离，收集分离液；
(7)分离液用膜孔径O.5^1. O μ m微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径l(Tl20nm超滤机浓缩，收集浓缩液；
(8)IOOmL浓缩液溶于由质量比4. 5%PEG6000-质量比8. 0%葡萄糖T600组成的100(T2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里，以超声频率50(Tl000kHz、功率O. I"!. 5kw、流速2(Tl00ml/min、紫外检测器波长220nm连续分离纯化金属硫蛋白；
(9)将分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度l(T50kpa、温度-3(T50°C、时间15 24h干燥含水份5 6%为成品，金属硫蛋白含量为96. 5%。实施例2(1)取IOOOg 米糠，5(Tl00g 大豆蛋白粉，l(T20g 甘氨酸，l(T20g 胱氨酸，l(T20gCuS04，l(T20gNaCl，l(T20gZnS04充分混合成为培养基；
(2)上述培养基喷淋50(Tl000mL去离子水，保持温度25 45°C，时间48 120h，培养基充分发酵；
(3)选羽化后1(Γ20天的九龙虫，将雄虫与雌虫按2:3比例混合，保持温度25 30°C，湿度6(Γ85%，雄虫与雌虫交配5 7天产卵，虫卵在8 12天孵化出幼虫，收集幼虫；
(4)将5 8g幼虫置前述的发酵培养基中，保持温度2(T30°C、湿度6(Γ85%培养，待幼虫第一次脱皮后，用超声波发生器在频率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超声处理2 lOmin，每间隔8 IOh重复超声处理一次，幼虫培育周期5(T80d ；
(5)待幼虫脱皮6次后的第4飞天，收集九龙虫幼虫，IOOOg九龙虫幼虫用2L 10L去离子水清洗3次，甩干九龙虫幼虫表面水分；
(6)甩干的九龙虫幼虫放入组织捣碎匀浆机中以1000(Tl5000r/min捣碎，加热8(Tl00°C，时间5 lOmin，离心机75(Tl250r/min分离，收集分离液；
(7)分离液用膜孔径O.5^1. O μ m微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径l(Tl20nm超滤机浓缩，收集浓缩液；
(8)IOOmL浓缩液溶于100(T2000mL由亚丁醇-乙醚-水按照10 5 12体积比组成的溶剂体系中，注入超声驻波液相制备色谱中，超声频率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min,紫外检测器波长220nm,连续分离纯化金属硫蛋白；
(9)将分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度l(T50kPa、温度-3(T50°C、时间15 24h干燥含水份5 6%为成品，金属硫蛋白含量为97. 1%。
权利要求
1.定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述工艺如下 (O选择合适的原材料配制培养基； (2)上述培养基喷淋去离子水，保持温度25 45°C，时间48 120h，使培养基充分发酵； (3)将九龙虫雄虫与雌虫按23比例混合，保持温度25 30°C，湿度60 85%，雄虫与雌虫交配5 7天产卵，虫卵在8 12天孵化出幼虫，收集幼虫； (4)将5 8g幼虫置于前述的发酵培养基中，保持温度2(T30°C、湿度6(Γ85%培养，待幼虫第一次脱皮后超声波振荡培育； (5)待幼虫脱皮6次后的第4飞天，收集九龙虫幼虫，用去离子水清洗，甩干九龙虫幼虫表面水分； (6)甩干的九龙虫幼虫捣碎，加热8(Γ100 ，时间5 10min，离心分离，收集分离液； (7)分离液进行微滤与超滤处理，收集浓缩液； (8)100mL浓缩液溶于100(T2000mL溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱里连续分尚纯化金属硫蛋白； (9)将分离纯化的金属硫蛋白冷冻干燥至成品。
2.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(I)中，培养基由IOOOg麦麸或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g赖氨酸、0 20g甘氨酸、l(T80g胱氨酸、10 20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、(Tl0gCaS04、(r20gZnS04 混合而成。
3.根据权利要求2所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述培养基由IOOOg 麦麸、10(T200g 大豆豆粉、l(T20g 赖氨酸、50 80g 胱氨酸、l(Tl5gCuS04、5 lOgNaCl、10 20gCdS04、5 IOg CaSO4 混合而成。
4.根据权利要求2所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述培养基由IOOOg米糠、50 100g大豆蛋白粉、10 20g甘氨酸、10 20g胱氨酸、10 20gCuS04、l(T20gNaCl、l(T20gZnS04 混合而成。
5.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(4)中，每间隔8 10h重复超声处理一次，幼虫培育周期5(T80d，超声波振荡频率为250 500kHz，功率为 O. Γθ. 5kw，时间为 2 lOmin。
6.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(7)中，分离液用膜孔径O. 5^1. O μ m微孔膜过滤机过滤，再用膜孔径l(Tl20nm超滤机浓缩。
7.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(8)中，溶剂体系由质量比4. 5%PEG6000-质量比8. 0%葡萄糖T600组成。
8.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(8)中，溶剂体系由亚丁醇-乙醚-水按照10 5 12体积比组成。
9.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(8)中，超声频率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min，紫外检测器波长220nm。
10.根据权利要求I所述的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，其特征在于所述步骤(9)中，分离纯化的金属硫蛋白用真空冷冻干燥机在真空度l(T50kPa、温度-3(T50°C、时间15 24h干燥含水份5 6%为成品。
全文摘要
定向诱导合成金属硫蛋白的工艺，属于生物工程领域。针对现有金属硫蛋白来源的局限性，本发明的定向诱导合成金属硫蛋白的工艺是通过以下技术方案实现的1、选择合适的原材料配制培养基；2、培养基二次发酵复制；3、九龙虫虫卵培殖；4、九龙虫虫卵植入复制培养基中；5、超声波振荡培育；6、九龙虫成虫处理；7、微滤与超滤；8、超声驻波液相制备色谱分离纯化；9、冷冻干燥至成品。本发明不仅为金属硫蛋白生产提供了一种新的工艺，而且由于分离过程的特殊性，确保了金属硫蛋白的生物活性，具有工业化生产的价值。
文档编号A01K67/033GK102786591SQ201210315550
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者徐华民, 徐萌, 赵艳琨, 赵荣华 申请人:哈尔滨工业大学