一种核桃青皮的提取物及其抑菌用途
【专利摘要】本发明公开了一种核桃青皮提取物，该提取物的制备方法为：称取核桃青皮，磨碎成浆状，按1g∶2-5ml的比例加甲醇，超声提取20-40min，过滤，残渣用同法再提取2次，合并3次滤液，浓缩、干燥，即得。该提取物对人参根腐病菌具有明显的抑制作用。
【专利说明】一种核桃青皮的提取物及其抑菌用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物植物的提取物，尤其是一种核桃青皮的提取物及其抑菌用途，属于中药或药物用植物领域。
【背景技术】
[0002]核桃青皮又名青龙衣，是核桃未成熟时外部的一层厚厚的绿色果皮，随着核桃逐渐成熟青果皮会渐渐变黑，最后自然脱落。它是一种有毒物质，正常人服用过量会导致死亡。据相关资料记载，核桃叶、枝、青皮、树皮都有药用价值，具有杀菌、消毒、利尿、滋补、解毒等功效。但关于核桃青皮在农业病虫害防治方面却报道得较少。
[0003]根腐菌是一个广泛分布的土壤病真菌，会传染木本植物引起根部腐烂与溃疡。它需要潮湿的土壤与温暖的温度，特别容易侵害敏感植物(例如夏季干旱受损的植物)。根腐菌威胁林业、园艺业与水果业，超过900个木本多年生的树种会被传染，进而造成族群消减。目前防治根腐菌主要依靠农药，但使用农药不可避免地会有毒性残留，并且施药过程也会对土壤、人员造成一定的伤害。因而，研发一种安全无残留的根腐菌防治药物具有极高的农业应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种药用植物提取物，特别是一种核桃青皮提取，用于防治根腐菌等菌类。本发明目的是通过以下技术方案实现的。
[0005]一种核桃青皮提取物，其特征在于该提取物是按如下方法制得的:称取核桃青皮，磨碎成浆状，按Ig: 2-5ml的比例加甲醇，超声提取20-40min，过滤，残渣用同法再提取2次，合并3次滤液，浓缩、干燥，即得。
[0006]优选的，上述提取物是按如下方法制得的:称取核桃青皮100g，磨碎成浆状，加入甲醇250ml，超声提取30min，减压抽滤，残渣用同法再提取2次，合并3次抽滤液，浓缩、干燥，即得。
[0007]进一步地，上述方法所得的甲醇提取物还可以用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇进一步萃取纯化，得到相应的提取物。比如，称取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加A 100ml蒸馏水，装入分液漏斗中，混合均匀；采用液-液分配萃取法依次用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次(100ml/次)；分别合并各极性萃取液，旋转蒸发仪浓缩得浓缩液，适量无菌水溶解得提取物。
[0008]以上述方法获得的各提取物，对菌类，尤其是真菌具有明显的抑制作用，以下实验例用于说明其效果。
[0009]有益效果
[0010]I材料与方法
[0011]1.1试验仪器、材料及试剂
[0012]九阳粉碎机、布式漏斗、RE-6000多功能旋转蒸发器；ZHJH-C型智能型垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；LS系列立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
[0013]核桃青皮采自北京市密云县。选取外表新鲜干净的青皮核桃，剥下核桃果实的外青皮，用于后续不同极性提取物的制备。
[0014]人参根腐病菌C.destructans由中国医学科学院药用植物研究所提供。
[0015]其余试剂为分析纯。
[0016]1.2试验方法
[0017]1.2.1提取物制备
[0018]准确称取核桃青皮100g，用植物粉碎机磨碎成浆状。放入1000ml锥形瓶，用250ml甲醇浸泡，超声提取30min。提取物经抽滤，残渣再用250ml甲醇提取，重复2次。合并3次抽滤液，用旋转蒸发器浓缩得浓缩液。
[0019]称取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸馏水，装入分液漏斗中，混合均匀。采用液-液分配萃取法依次用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次(100ml/次)。分别合并各极性萃取液，旋转蒸发仪浓缩得浓缩液，适量无菌水溶解得提取物水溶液(表 I)。
[0020]表1供试提取物样品
编号样品名~
I 乙醚提取物4乙酸`乙酯提取物
[0021]2 石油醚提取物5甲醇提取液
3 氯仿提取物6正丁醇提取物
[0022]1.2.2 PDA培养基制备:取200g去皮马铃薯，切成小块后加I L水，沸水煮30min，双层纱布过滤，滤液加20g葡萄糖、20g琼脂粉，用蒸馏水定容至1L。取锥形瓶以IOOmL分装，于121 °C高温湿热灭菌20min，作为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。
[0023]1.2.3抑菌试验
[0024]分别向15ml事先灭菌的PDA培养基中加入7.5ml,0.25ml,25 μ I和2.5 μ I不同极性的核桃青皮提取物水溶液，充分混匀后倒平板。然后在垂直流超净工作台的无菌环境下接种人参根腐病菌，培养10天后，用十字交叉法统计人参致病菌的菌落直径。每种处理设置3次重复。
[0025]1.2.4统计分析
[0026]试验结果用Excel软件(2003版)进行数据处理，利用SPSS 11.0中的单因素方差分析(One-way AN0VA)结合LSD法对统计结果进行显著性方差分析。不同处理间不含相同英文字母表示差异显著(P < 0.05)，含有相同英文字母表示差异不显著(P > 0.05)。
[0027]2试验结果
[0028]2.1低浓度提取物水溶液的抑菌效果
[0029]先吸取0.25ml提取物原液，再与15ml的PDA培养基混匀，相当于60倍的稀释液培养基；另通过10倍稀释法获得600倍和6000倍的稀释液培养基。在研究发现，处理2(石油醚水溶液)和处理6 (正丁醇水溶液)中的高浓度(60倍稀释)样本与中(600倍稀释)、低浓度(6000倍稀释)样本间存在显著性差异；另外，处理2中的高浓度(60倍稀释)和中浓度(600倍稀释)样本以及处理6中的高浓度(60倍稀释)样本与对照存在显著性差异。除处理2和处理6外，其他处理与对照均无显著性差异。
[0030]2.2高浓度提取物水溶液的抑菌效果
[0031]先向PDA培养基中加入等体积的提取物水溶液，充分混匀后倒平板，制成I倍稀释液培养基。研究发现，处理2与处理5之间，以及二者与对照之间均存在显著性差异。特别值得关注的是，处理5中的人参根腐菌均未生长，说明该浓度的提取物对致病菌存在显著的抑制活性。处理1、处理3与处理4之间无显著性差异，三者与处理2、处理5及对照间存在显著性差异。
[0032]3 结论
[0033]石油醚和正丁醇萃取物在较高浓度(60倍稀释液)下，对人参根腐菌有显著的抑制作用，其余4种萃取液无显著抑菌活性；但在高浓度(I倍稀释)下，乙醚、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和甲醇萃取物均有显著的抑菌活性，且甲醇提取物对人参根腐病菌的抑制效果最佳，抑制率达100%。
【具体实施方式】
[0034]实施例1:核桃青皮甲醇提取物的制备
[0035]准确称取核桃青皮100g，用植物粉碎机磨碎成浆状。放入1000ml锥形瓶，用250ml甲醇浸泡，超声提取30min。提取物经抽滤，残渣再用250ml甲醇提取，重复2次。合并3次抽滤液，用旋转蒸发器浓缩，即得。
[0036]实施例2:核桃青皮石油醚提取物的制备
[0037]准确称取核桃青皮100g，用植物粉碎机磨碎成浆状。放入1000ml锥形瓶，用250ml甲醇浸泡，超声提取30min。提取物经抽滤，残渣再用250ml甲醇提取，重复2次。合并3次抽滤液，用旋转蒸发器浓缩得浸膏。
[0038]称取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸馏水，装入分液漏斗中，混合均匀。采用液-液分配萃取法依次用石油醚萃取3次(100ml/次)，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩后即得。
[0039]实施例3:核桃青皮乙醚提取物的制备
[0040]准确称取核桃青皮100g，用植物粉碎机磨碎成浆状。放入1000ml锥形瓶，用250ml甲醇浸泡，超声提取30min。提取物经抽滤，残渣再用250ml甲醇提取，重复2次。合并3次抽滤液，用旋转蒸发器浓缩得浸膏。
[0041]称取核桃青皮甲醇提取物浸膏10ml，加入100ml蒸馏水，装入分液漏斗中，混合均匀。采用液-液分配萃取法依次用乙醚萃取3次(100ml/次)，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩后即得。
【权利要求】
1.一种核桃青皮提取物，其特征在于该提取物是按如下方法制得的:称取核桃青皮，磨碎成浆状，按Ig: 2-5ml的比例加甲醇，超声提取20-40min，过滤，残渣用同法再提取2次，合并3次滤液，浓缩、干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于该提取物是按如下方法制得的:称取核桃青皮100g,磨碎成衆状,加入甲醇250ml,超声提取30min,减压抽滤,残洛用同法再提取2次，合并3次抽滤液，浓缩、干燥，即得。
3.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于获得的甲醇提取物还可以用石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇进一步萃取纯化。
4.权利要求1至3中任一项所制得的核桃青皮提取物在抑菌上的用途。
5.权利要求1至3中任一项所制得的核桃青皮提取物在抑制真菌上的用途。
6.权利 要求1至3中任一项所制得的核桃青皮提取物在抑制人参根腐病菌上的用途。
【文档编号】A01N65/08GK103766409SQ201210395987
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】王涵, 张益铭, 李翘楚 申请人:王涵, 张益铭, 李翘楚