专利名称：检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。
背景技术：
小麦是我国的主要储粮作物之一，良好的储粮品质对粮食安全具有重要意义。在一般的储藏条件下，小麦从第二年开始逐渐陈化变质，南方高温高湿地区尤为明显。影响小麦储藏品质的因素较多，包括收获季节的气候条件、晾晒、运输、仓储等外在环境条件和脂肪氧化酶活性等内在因素，且脂肪氧化酶活性高低是直接影响小麦耐储藏性的主要内在原因。因此，开发LOX基因的分子标记，利用分子育种手段，培育耐存储的小麦品种，是解决粮食安全的重要途径之一。
1932年，Andre和Hou首次提出脂肪氧化酶(L0X或Lpx, lipoxygenase)的存在， 在那以后LOX的研究取得快速的发展。研究者们先后在大豆、拟南芥、水稻、向日葵、黄瓜、 亚麻、大麦和小麦等作物植株和籽粒中发现了 L0X。目前，已有的研究表明，LOX活性低，有利于增强小麦等作物的耐储藏性。LOX基因在大麦中的研究较多，大麦LOX基因DNA序列已经发表(GenBank编号HVU83904)。在普通小麦中，对LOX的研究较少，王慧等研究发现，LOX 活性在基因型间和环境间的差异皆达到极显著水平，且基因型对小麦LOX活性的效应大于环境及基因型与环境互作效应，认为基因型是影响小麦LOX活性的主要因素，但环境因素亦不可忽视。Hongwei Geng等在研究普通小麦的TaLox-Bl时发现，TaLox-Bl位点存在两个具有SNP的等位基因TaLox-Bla和TaLox-Blb，LOX活性较高的小麦品种含有TaLox-Bla， LOX活性较低的小麦品种含有TaLox-Blb。发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，为由序列表中序列I所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
其中，序列I由21个核苷酸组成；序列2由23个核苷酸组成。
所述检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对在检测小麦脂肪氧化酶活性中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的方法具体可包括如下步骤
(I)以待测小麦的基因组DNA为模板，以所述引物对进行PCR扩增，获得PCR
(2)检测步骤(I)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性若所述PCR产物中含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中不含有大小为677bp 的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述方法中，所述检测步骤(I)所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示677bp的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上不显示677bp的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
本发明所提供的检测小麦脂肪氧化酶活性的方法具体也可包括如下步骤
(I)以待测小麦的基因组DNA为模板，以所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物；
(2)检测步骤(I)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性若所述PCR产物为大小分别是475bp、677bp和786bp的三个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中为大小分别是475bp和786bp的两个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述方法中，所述检测步骤(I)所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示475bp、677bp和786bp 三个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示475bp和786bp两个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
在上述两个检测小麦脂肪氧化酶活性的方法中，所述PCR扩增的退火温度具体为 55。。。
所述检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，或所述检测小麦脂肪氧化酶活性的方法在如下(a)_ (f)中的应用也属于本发明的保护范围
(a)筛选脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
(b)筛选脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
(C)筛选耐储藏小麦品种；
(d)培育脂肪氧化酶活性高的小麦品种；
(e)培育脂肪氧化酶活性低的小麦品种；
(f)培育耐储藏小麦品种。
本发明的再一个目的是培育耐储藏小麦品种的方法。
本发明所提供的培育耐储藏小麦品种的方法具体可包括采用通过上述两个检测小麦脂肪氧化酶活性的方法中的任一个检测得到的所述脂肪氧化酶活性低的小麦品种作为亲本进行育种的步骤。
在本发明中，所有所述肪氧化酶活性高的小麦均为小麦籽粒脂肪氧化酶活性高于9. Onkat/g的小麦；所有所述肪氧化酶活性低的小麦均为小麦籽粒脂肪氧化酶活性低于 7. lnkat/g的小麦。所述肪氧化酶活性的测定方法是以亚油酸为底物进行分光光度检测。
本发明对148份小麦品种的统计实验结果表明，扩增出475bp、677bp和786bp三条带的小麦品种中，有98. 29%为高脂肪氧化酶活性小麦品种；扩增出475bp和786bp两条带的小麦品种中，有80. 06%为低脂肪氧化酶活性小麦品种。本发明所提供的检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的方法可靠、简便、实用，在小麦种质资源评价和育种的标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育耐存储的小麦品种提供了参考依据。
图I为引物L0Xl-wp02对6个高LOX活性小麦品种和6个低LOX活性小麦品种 PCR扩增的电泳结果。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道01为小麦品种内乡188 ;泳道 02为小麦品种周麦11 ;泳道03为小麦品种蒿优9409 ;泳道04为小麦品种淮麦19 ;泳道05 为小麦品种扬辐麦5242 ;泳道06为小麦品种安农9403 ;泳道07为小麦品种郑麦9405 ;泳道08为小麦品种济麦21 ;泳道09为小麦品种鲁麦22 ;泳道10为小麦品种周麦16 ;泳道11 为小麦品种皖协497 ;泳道12为小麦品种鹤麦026。
图2为条带a、b、c (序列3、4、5)三条核酸序列的比较分析结果。其中，为引物序列，为内含子区域。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小麦品种(系)安农9267、宛抗18、安农95083-6-1、天禾0519、江白、Halberd、内白、Kantol07、Stardy、PH86-16、Gamenya、安农 04144、徐州 8913、华农 139 记载在“崔文礼， 姚大年，张文明等.138个小麦品种(系)戊聚糖含量的研究[J].中国粮油学报，2010，25(2): 11-17”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种(系)安农95081-8、阜861-8记载在“王晓波，马传喜，何克勤等.小麦2D染色体上多酚氧化酶(PPO)基因STS标记的开发与应用[J].中国农业科学，2008，4(6) : 1583-1590”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种(系)石农88，固镇36-6-3-8记载在“郑文寅，王慧，崔文礼等.104个小麦品种(系)脂肪氧化酶活性的研究[J].中国农业科学，2011，44 (9):1798-1805”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种(系)扬06G86，07安徽03记载在“王慧，郑文寅，樊宏等.不同小麦品种籽粒中LOX活性及基因型和环境互作分析[J],中国粮油学报，2011，26 (1):11_14”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
小麦品种(系)漯6112，豫展9804，阜98_46记载在“唐怀君，殷贵鸿，夏先春等.IBL · IRS特异性分子标记的筛选及其对不同来源小麦品种IRS易位染色体[J].作物学报，2009，35 (11):2107-2115”中，公众可从安徽农业大学获得，用以重复本发明实验。
W1022，W1032是江苏白火麦和关东107的杂交后代，公众可从安徽农业大学获得， 用以重复本发明实验。
其余小麦品种为市面常售的商业化品种。
各小麦品种(系)于2010 2011年在安徽农业大学试验农场种植,所有品种(系) 种在同一地块，田间管理按常规进行。
实施例I、小麦籽粒脂肪氧化酶活性相关分子标记的获得及其应用
一、小麦籽粒脂肪氧化酶活性性状的测定
以表I中148份小麦作为实验材料，参照Larisa Catod的分光光度计法，并加以适当改良后测定小麦籽粒中LOX活性。具体操作如下
(I)底物配制0. 5ml吐温20溶解于IOml浓度为O. 05mol/L的pH9. O的硼酸缓冲液(配方-M O. 76g Na2BO4 · IOH2O, O. 124g H3BO3，用双蒸水定容至200ml)中混匀，再逐滴加入O. 5ml亚油酸，混匀成乳浊液后加入I. 3ml浓度为lmol/L的NaOH水溶液至溶液澄清， 然后加入90ml浓度为O. 05mol/L的pH9. O的硼酸缓冲液，用HCl调节pH至7. O后定溶到 200ml ο
(2)酶提取液称取O. 5克待测小麦籽粒粉，加入2. 5ml浓度为O. lmol/L的ρΗ7· 5 的磷酸缓冲液(配方-M 6g Na2HPO4 · 12Η20，0· 52g NaH2P04 · 2H20，用双蒸水定容至200ml) 在4°C条件下混匀30分钟后在8000r/min 4°C下离心10分钟，所得上清即为酶提取液。
(3)反应体系9· 5ml浓度为O. 05mol/L的ρΗ5· 6醋酸钠缓冲液(配方取3. 73g无水醋酸钠，I. 33ml醋酸,用双蒸水定容至1000ml),加入O. 3ml步骤(I)配制的亚油酸底物, 加入60 μ I步骤(2)制备的酶提取液，用UV-1100型分光光度计(上海美谱达公司生产)在 234nm处用Icm光程的石英比色皿测定共轭过氧化物的吸光度，以空白的所述亚油酸底物作对照。每15秒记录一个数据，观察OD值的变化。
LOX 活性计算公式A=
/0. 01
式中A为酶活性单位，
0D(30S)为反应30S的OD值，
0D(15S)为反应15S的OD值，
O. 01为一个常数，即一分钟内3ml的反应体系在234nm吸光度下增加O. 01作为一个酶活力单位。
(4)结果148份小麦籽粒的LOX活性测定结果如表I所示。
表I小麦籽粒LOX活性的测定结果及L0Xl-wp02扩增带型
编号品种名称LOX 活性(nkat/g)L0Xl-wp02扩增带型I鹤麦02619. 43abc2内白17. 98abc3W103217. 76abc4郑麦940517. 65abc5鲁麦2217. 03abc6江白16. 8ac7安农糯I16. 33abc8ZWY-1015. 03abc9周麦1614. 78abc权利要求
1.检测小麦脂肪氧化酶活性的引物对，为由序列表中序列I所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
2.权利要求I所述的引物对在检测小麦脂肪氧化酶活性中的应用。
3.—种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤 (1)以待测小麦的基因组DNA为模板，以权利要求I所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物； (2)检测步骤(I)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性若所述PCR产物中含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中不含有大小为677bp的DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述检测步骤(I)所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示677bp之间的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上不显示677bp之间的一个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
5.一种检测小麦脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤 (1)以待测小麦的基因组DNA为模板，以权利要求I所述引物对进行PCR扩增，获得PCR产物； (2)检测步骤(I)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测小麦的脂肪氧化酶活性若所述PCR产物为大小分别是475bp、677bp和786bp的三个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物中为大小分别是475bp和786bp的两个DNA片段，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述检测步骤(I)所得PCR产物的大小的方法是将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示大小为475bp、677bp和786bp的三个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性高的小麦或候选为脂肪氧化酶活性高的小麦；若所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上同时显示大小为475bp和786bp的两个条带，则所述待测小麦为脂肪氧化酶活性低的小麦或候选为脂肪氧化酶活性低的小麦。
7.权利要求I所述的引物对或权利要求3-6中任一所述的方法在如下(a)-(f)中的应用 Ca)筛选脂肪氧化酶活性高的小麦品种； (b)筛选脂肪氧化酶活性低的小麦品种； (C)筛选耐储藏小麦品种； Cd)培育脂肪氧化酶活性高的小麦品种； Ce)培育脂肪氧化酶活性低的小麦品种； (f)培育耐储藏小麦品种。
8.培育耐储藏小麦品种的方法，包括采用通过权利要求3-6中任一所述方法检测得到的所述脂肪氧化酶活性低的小麦品种作为亲本进行育种的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的引物对及其应用。本发明所提供的引物对为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。实验证明，扩增出475bp、677bp和786bp三条带的小麦品种中，有98.29%为高脂肪氧化酶活性小麦品种；扩增出475bp和786bp两条带的小麦品种中，有80.06%为低脂肪氧化酶活性小麦品种；本发明所提供的检测小麦籽粒脂肪氧化酶活性的方法可靠、简便、实用，在小麦种质资源评价和育种标记的辅助选择中具有重要应用前景，同时为培育耐存储的小麦品种提供了参考依据。
文档编号A01G1/00GK102925576SQ201210447260
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者姚大年, 吴萍, 司红起, 张文明, 郑文寅 申请人:安徽农业大学