专利名称：以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法
以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法技术领域
本发明属于农业育种领域，具体而言，涉及一种以单倍体玉米茎尖为受体的转基因玉米育种方法。
背景技术：
转基因育种已经成为现代分子育种的一种重要手段。从80年代后期科学家开始进行玉米转基因研究，至今已经取得一些重要成果。国外已经有部分商业化种植的玉米转基因品种，例如高赖氨酸转基因玉米，抗玉米螟转基因玉米，抗除草剂转基因玉米等。而国内成功的例子还相对较少，转基因育种进程远远落后于美国等发达国家。在玉米转基因领域常用的遗传转化方法是以幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织为受体的农杆菌介导法。此类方法的特点是受体为二倍体的玉米材料，且须经历幼胚脱分化和再分化等复杂的组织培养过程。存在以下缺点(I)不同基因型玉米幼胚的脱分化和再分化能力具有很大差异，很多生产上使用的骨干自交系由于甚至不能诱导出胚性愈伤组织，或者再分化效率极低，而不能作为转化受体，这限制了转基因玉米受体基因型的选择范围；(2)基因转化效率低，如果没有庞大的受体系统难以获得足够的转化事件，筛选出目的基因高效表达的转化体几率非常小；(3)目的基因遗传不稳定，基因沉默和基因丢失现象比较常见，难以获得目标性状稳定的转基因株系；(4)以二倍体玉米作为受体材料获得的当代转基因植株其目的基因在同源染色体上处于杂合状态，必须经过2代以上的自交才能获得纯合稳定的转基因株系，导致获得转基因纯合的株系周期太长。
近年来也开展了以植物单配体为受体系统的转基因研究。在烟草和大麦的上，以雌雄配子体及其培养形成的单倍体愈伤组织为受体已成功获得了阳性转化事件；利用组织培养技术进行花粉和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成单倍体植株，建立单倍体转基因受体系统。该技术在水稻和烟草上也有成功应用的报道。
无论以花粉、卵细胞等雌雄配子体作为受体的转基因技术都必须经历愈伤组织诱导和分化等组培过程，而单倍体的组培系统尚不成熟，培养再生植株非常困难，直接影响了阳性转化事件的获得；同时，在单倍体诱导愈伤组织的整个过程历时长，容易发生自然加倍现象，导致单倍体受体本身产生效率低；另外，此类技术的取材时间只能局限在植物生殖生长期，受到严重的季节限制。发明内容
本发明针对以上存在问题，建立了单倍体玉米茎尖生长点直接分化受体系统，用农杆菌介导法将目的基因导入受体，再将阳性转基因植株进行加倍获得转基因二倍体玉米的方法。
为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下技术方案
本发明一方面涉及一种以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，包括如下步骤
(I)用单倍体诱导系stock6做为父本，以西南地区玉米骨干自交系18-599作为母本，进行杂交组配并收获Fl代杂交种，从获得的种子中挑选胚乳顶部为紫色而胚为白色的种子，该种子大部分为单倍体；弃去胚乳顶部和胚均为紫色的二倍体种子；
(2)对获得的单倍体种子进行消毒，然后在培养箱中进行黑暗条件下培养，待胚芽生长到2 4cm
(3)以含目的基因的表达载体制备含目的基因表达载体的转化农杆菌,筛选转化的农杆菌并制备成侵染液；
(4)切单倍体茎尖在超净工作台上垫上提前灭过菌的滤纸，然后从培养基上用镊子取出步骤(2)中待转化的发芽植株，用手术刀先切去种子胚根，在茎节鼓起处以上I毫米左右的部分横向微切，轻轻剥去胚芽鞘露出茎尖生长点，再从中部纵向切伤茎尖生长点， 伤口深度约Imm;
(5)农杆菌侵染茎尖摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜，然后农杆菌侵染液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液，完全盖上真空干燥器盖子，在30-70kPa压力下侵染6-12min ；
(6)共培养侵染结束后，用吸管快速吸净培养皿上多余的菌液，置于21 25°C继续暗培养4 6天,直至长出新叶,且节根长至I 2cm ；
(7)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到土壤中，先置于人工气候室避光生长2 3d，然后让植株在日温22 28°C、夜温15 21 °C的条件下生长，直至植株3叶I心期；
(8)阳性单倍体植株的加倍处理待步骤(7)中的阳性单倍体植株和对照植株生长至四叶一心期时，用除草剂进行加倍，具体方法为将二甲基亚砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至单倍体植株的心叶处，每株约O. 5-1. 5ml，重复2-4次；
(9)阳性纯合转基因二倍体种子的获得
加倍处理后，待植株长至5叶期将其移栽到温室或大田，花期能正常散粉的均为加倍成功的阳性植株，将它们进行套袋自交，收获的种子即为纯合的转基因二倍体种子。
在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤(2)中的消毒过程包括如下步骤将筛选得到的紫顶白胚的单倍体种子，在超净工作台上用75%乙醇消毒8分钟、O. 1%氯化汞水溶液灭菌6分钟、无菌水洗涤3次；然后加I. 5倍种子体积无菌水在24 26°C浸泡6小时；再用O. I %氯化汞水溶液灭菌10分钟、无菌水洗涤5次。
在本发明的一个优选实施方式中，培养所使用的培养基为改良的MS培养基，改良的MS培养基配方如下表所示
权利要求
1.以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，包括如下步骤(1)用单倍体诱导系stock6做为父本，以西南地区玉米骨干自交系18-599作为母本， 进行杂交组配并收获Fl代杂交种，从获得的种子中挑选胚乳顶部为紫色而胚为白色的种子，该种子大部分为单倍体；弃去胚乳顶部和胚均为紫色的二倍体种子；(2)对获得的单倍体种子进行消毒，然后在培养箱中进行黑暗条件下培养，待胚芽生长到2 4cm (3)以含目的基因的表达载体制备含目的基因表达载体的转化农杆菌，筛选转化的农杆菌并制备成侵染液；(4)切单倍体茎尖在超净工作台上垫上提前灭过菌的滤纸，然后从培养基上用镊子取出步骤(2)中待转化的发芽植株，用手术刀先切去种子胚根，在茎节鼓起处以上I毫米左右的部分横向微切，轻轻剥去胚芽鞘露出茎尖生长点，再从中部纵向切伤茎尖生长点，伤口深度约Imm ；(5)农杆菌侵染茎尖摆放好茎尖的培养皿置于真空干燥器中，并垫上泡沫塑料使其向茎尖一边倾斜，然后农杆菌侵染液滴加在培养皿中茎尖一方，使茎尖能完全接触菌液，完全盖上真空干燥器盖子，在30-70kPa压力下侵染6 12min ；(6)共培养侵染结束后，用吸管快速吸净培养皿上多余的菌液，置于21 25°C继续暗培养4 6天,直至长出新叶,且节根长至I 2cm ；(7)共培养结束后，将长出新叶的转化苗用室温下的自来水洗掉表面的培养基和菌体，然后将其整齐的移栽到土壤中，先置于人工气候室避光生长2 3d，然后让植株在日温 22 28°C、夜温15 21°C的条件下生长，直至植株3叶I心期；任选的，包括根尖镜检筛选阳性单倍体步骤；(8)阳性单倍体植株的加倍处理待步骤(7)中的阳性单倍体植株和对照植株生长至四叶一心期时，用除草剂进行加倍，具体方法为将二甲基亚砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至单倍体植株的心叶处，每株约O. 5-1. 5ml，重复2-4次；(9)阳性纯合转基因二倍体种子的获得加倍处理后，待植株长至5叶期将其移栽到温室或大田，花期能正常散粉的均为加倍成功的阳性植株，将它们进行套袋自交，收获的种子即为纯合的转基因二倍体种子。
2.根据权利要求I所述的育种方法，其特征在于所述步骤(2)中的消毒过程包括如下步骤将筛选得到的紫顶白胚的单倍体种子，在超净工作台上用75%乙醇消毒8分钟、 O. I %氯化汞水溶液灭菌6分钟、无菌水洗涤3次；然后加I. 5倍种子体积无菌水在24 26°C浸泡6小时；再用O. I %氯化汞水溶液灭菌10分 钟、无菌水洗涤5次。
3.根据权利要求I所述的育种方法，其特征在于培养所使用的培养基为改良的MS培养基，改良的MS培养基配方如下表所示
4.根据权利要求I所述的转基因育种方法，其特征在于所述的载体为以含目的基因 Incw2 的表达载体 3300-27KD-Incw2-ba。
5.根据权利要求I所述的转基因育种方法，其特征在于所属的侵染液的制备包括如下步骤挑取农杆菌阳性单克隆置于含Kan和Rif的YEP液体培养基中于25_30°C避光振荡培养10-15h，使细菌处于对数生长期，离心收集菌体，将菌体用等体积的添加100 μ mo/LAS 的浸染培养基重悬。
全文摘要
本发明公开了以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法，其包括1.单倍体材料的获得及前处理；2.单倍体材料的培养；3.目的基因转化单倍体茎尖；4.转化苗的移栽和加倍处理。本发明的方法避免了玉米组织培养及再生过程，适用于大多数基因型玉米的遗传转化；以单倍体玉米茎尖为转基因受体的遗传转化技术是简易高效、省时省力、广泛适用的一种快速获得转基因玉米纯合体的新方法。
文档编号A01H4/00GK102934607SQ20121044814
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者沈亚欧, 潘光堂, 江舟, 杨珊, 林海建, 彭焕伟, 张志明, 罗旭, 马浪浪, 李婉蓉, 张兵 申请人:四川农业大学