专利名称：中慢生根瘤菌kdrm185及其应用的制作方法
中慢生根瘤菌KDRM185及其应用技术领域
本发明属于应用微生物学领域，具体涉及一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO M 2012329，菌株名为中慢生根瘤菌 KDRM185。
背景技术：
自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常温常压下，将空气中的N2还原成 NH3。由固氮微生物固定的氮素约占地表化合态氮的65% - 70%，其中以根瘤菌与豆科植物共生体系固氮能力最强，占生物固氮量的65%以上。
利用根瘤菌与豆科植物共生固氮提高土壤肥力和农作物产量是世界农业的经典经验。如用豆科植物作绿肥，让豆科与非豆科作物轮作、间作和套作。通过接种根瘤菌提高豆科作物的共生固氮效率和产量及土壤肥力已有100多年历史，广泛为各农业大国所用， 是当今发展可持续农业的重要措施之一。20世纪80年代以来，我国粮食作物的种植面积不断扩大，豆科作物和豆科绿肥的种植面积不断减少，化肥尤其是氮肥用量不断增加。由于高水平化合态氮阻遏根瘤菌结瘤固氮，接种根瘤菌的结瘤固氮效应在施用大量氮肥的农田里急剧下降，根瘤菌接种事业的发展随之被遏制。进入21世纪，中国实施西部大开发战略和退耕还林还草工程，为扩大豆科树种、牧草的种植面积和加强与之相匹配的根瘤菌接种技术应用提供了契机。
刺槐(TPoAiflia pseudoacacia L.)又称洋槐,是落叶乔木,高10 - 25米,木质坚硬，有弹性，抗磨损，是良好矿柱、枕木、建筑用材。刺槐原产美国东部，引种入欧洲后，于十九世纪末再从欧洲引入中国。刺槐生长快，分布越来越广，一方面得益于刺槐适应性强， 能在酸性土、中性土和含盐量O. 3%以下的盐碱土中生长，有一定的耐旱能力；另一方面刺槐是豆科植物，可以与根瘤菌共生固氮而获取生长所必需的氮素，从而适于在贫瘠的土地生长。种植刺槐的生态效应，如保持水土、改良土壤等，也非常显著。因此，刺槐成为全世界最重要的速生造林先锋树种之一，也是我国退耕还林工程的先锋树种。
随着全球石油、煤炭和天然气等矿物能源的日益枯竭，开发利用可再生的生物质能源以取代矿物能源越来越为世界各国政府所关注。目前，中国经济快速增长，矿物能源消耗量急剧增长，能源短缺问题十分突出，生物质能源等可再生能源的开发和利用已成为实现可持续发展的关键。生物质能源的开发和利用的基点在于原料生产，原料成本占总成本的60% - 80%，原料成本决定产品的市场竞争力和利润。
林木是生物质能源的重要原料。刺槐凭借其热值高，生长速度快和耐瘠抗逆等特点，成为重要的生物质能源树种。在贫瘠荒地上，用少施肥、低成本的投入产出高的成材生物量是目前我国刺槐能源林生产的瓶颈问题。用高效结瘤固氮的根瘤菌接种刺槐苗，通过共生固氮使树苗在贫瘠的土地上获得氮素成材，可能提高刺槐造林效率和降低原料成本。 目前，一方面，在技术上，现代刺槐造林通过大规模苗圃育苗提高造林效率，为刺槐苗人工接种根瘤菌创造了便利条件。另一方面，限于技术和管理上的制约，我国的大规模造林还没有向林业发达国家那样实施以氮素为主的大规模施肥，但不施肥反而为刺槐与根瘤菌的共生固氮创造了没有氮阻遏的条件，有利于提高共生固氮的效率。
刺槐适应贫瘠土壤能力强的一个因素是它能与多个属种的遗传多样的根瘤菌共生固氮。已发现能与刺槐结瘤的主要是中慢生根瘤菌属的根瘤菌,还有中华根瘤菌属(Sinorhizobia )、根瘤菌属(/Sizobium )和慢生根瘤菌属iBradyrhizobium ) 等属的根瘤菌。根瘤菌与刺槐结瘤固氮的能力高低不一，利用接种根瘤菌促进刺槐生长需要选择高效的根瘤菌菌株。通常筛选优良根瘤菌菌株是通过从多个大且饱满的刺槐根瘤中分离多个根瘤菌菌株，逐一接种刺槐苗，培养2个月或更长时间后，检测刺槐苗根部的结瘤数和苗的生物量；而要从数量较多的菌株中筛选出高效结瘤固氮的根瘤菌菌株要靠碰运气，筛选过程费时费力。
根瘤菌侵染豆科植物的根会引发植物产生植物激素乙烯及合成乙烯的前体 I-氨基环丙烷-I羧酸(ACC)，而乙烯会抑制根瘤菌结瘤和固氮。近年来的研究发现有些根瘤菌有ACC脱氨酶。ACC脱氨酶能催化ACC脱氨基反应，生成α-酮丁酸和NH3。根瘤菌侵染根时，根细胞合成ACC并释放部分ACC到细胞外。有ACC脱氨酶的根瘤菌能吸收并降解植物细胞释放的ACC，使根细胞中的ACC不断释放而减少，根细胞合成乙烯的量就相应减少，从而降低了乙烯对根瘤菌侵染结瘤的抑制作用。如果把根瘤菌的ACC 脱氨酶结构基因CacoSO敲除，根瘤菌的结瘤能力会显著降低(Uchiumi等，Journal of Bacteriology 2004, 186:2439-2448);相反，如果向原本没有acoS1的根瘤菌导入acoU, 那根瘤菌工程菌的结瘤率、占瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株(Ma等，Applied and Environmental Microbiology 2004, 70:5891-5897 ;Conforte 等，Journal of General and Applied Microbiology 2010, 56:331-338; Tittabutr 等，Systematic and Applied Microbiology 2008, 31:141-150; Nascimento Letters in Applied Microbiology 2012，55:15-21)。这表明有ACC脱氨酶的根瘤菌有强的侵染力，能高效结瘤。根瘤菌调控 ACC脱氨酶的机制比较复杂。研究已发现很多有^必的中慢生根瘤菌属的根瘤菌在自由培养状态下不表达aci/S，没有ACC脱氨酶活性，但在根瘤中会高水平地表达aci/S，发挥ACC脱氨酶的作用(Ma 等，Antonie van Leeuwenhoek 2003, 83:285-291 ;Nukui 等，Applied and Environmental Microbiology 2006, 72:4964-4969 ;Nascimento 等，FEMS Microbiology Letters 2012, 336:26-37)。因此，筛选有ACC脱氨酶的根瘤菌时，如果检测自由培养状态下根瘤菌的ACC脱氨酶活性，对很多根瘤菌尤其是中慢生根瘤菌会失效，而用聚合酶链式反应(PCR)检测根瘤菌有无aci/S基因会更有效。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足而提供一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。
本发明实现上述技术目的所采用的技术方案如下先用常规方法从刺槐根瘤中分离和纯化根瘤菌，再从根瘤菌基因组中扩增基因， 对扩增出的目标片段测序确定菌株有无基因和ACC脱氨酶，再用有ACC脱氨酶的根瘤菌菌株接种刺槐幼苗，在接种3个月后检测结瘤数、植株的株高、地径和干重，选出能高效结瘤、显著促进刺槐苗生长和提高植株生物量的根瘤菌菌株用于育苗造林。另一方面，扩增有ACC脱氨酶根瘤菌的16S rRNA基因并测序，通过序列比对和系统发育分析16S rRNA基因序列确定菌株的分类归属；同时对筛选出的有ACC脱氨酶的根瘤菌与同属根瘤菌中已知有ACC脱氨酶菌株的aci/S基因序列进行系统发育分析，结合菌株16S rRNA基因和ac#基因的系统发育地位，最终确定得到新的有ACC脱氨酶的根瘤菌株系。
本发明提供的中慢生根瘤菌KDRM185于2012年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2012329，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，分类命名为中慢生根瘤菌 KDRM185 ifesorAizoAia sp. KDRM185。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185是从在湖北省谷城县冷集镇野生刺槐的根瘤中分离到的。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185的细胞呈杆状，革兰氏染色阴性，在YMA培养基上生长形成典型的根瘤菌菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑且因有丰富的胞外多糖而粘稠、较湿润、稍透明；细胞的生长需氧，在28°C和中性pH条件下生长较快，在 YMA培养基上生长3 - 5天形成菌落的直径可达I - 2 _。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185的16S rRNA基因序列(见SEQ ID NO: I)与中慢生根瘤菌属典型种百脉根中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw loti ATCC 700743的16S rRNA基因序列一致性为98. 8%,与锦鸡儿中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因序列一致性为99. 9%，在系统发育树上与后者的亲缘关系也最近，处在同一节点分出的分支上(图I)。因此，KDRM185菌株属于中慢生根瘤菌属，可能属于锦鸡儿中慢生根瘤菌种。
所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脱氨酶。它的ac必基因部分序列(见SEQ ID N0:2)与从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的紫穗槐中慢生根瘤菌ifesorAizMi amorphae CCNWGS0123的两个拷贝acdS中的一今acdS的相应序列(可在GenBank登录号 AGSNO1000010的序列中检索到)相同，在系统发育树上处在同一分支，与中慢生根瘤菌属中其他已知有ACC脱氨酶菌株的ac#序列差异较大(图2)。这表明在进化中属于不同种的根瘤菌KDRM185和CCNWGS0123两者之间可能发生过ac必基因的水平转移或者通过水平转移的方式从其他根瘤菌获得了相同的ac#基因。
上述中慢生根瘤菌KDRM185的16S rRNA基因和ac必基因的分析结果结合表明 KDRM185的基因型不同于已知的中慢生根瘤菌。
所述中慢生根瘤菌KDRM185能在刺槐根上高效结瘤固氮，促进刺槐苗生长和成材。
本发明的有益效果本发明所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脱氨酶，能将ACC分解成α -酮丁酸和NH3, 降低植物细胞合成乙烯的水平，减轻乙烯对根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌与刺槐的结瘤率和共生固氮的水平，为刺槐在不施肥的贫瘠荒地上生长提供高水平的氮素，促进刺槐苗生长,增加刺槐成材的生物量,从而用低成本的接种投入让刺槐成材高产,在刺槐育苗造林上发挥作用。
图I为中慢生根瘤菌菌株KDRM185 (·)与中慢生根瘤菌属)现有 25个种的典型菌株的16S rRNA基因的系统发育树。图中■指示中慢生根瘤菌属典型种百脉根中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw loti ATCC 700743, ▲指示锦鸡儿中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAiw caraganae CCBAU 11299,菌株名后括号内是16S rRNA基因核苷酸序列在GenBank数据库中的登录号。
图2为中慢生根瘤菌菌株KDRM185 (·)和中慢生根瘤菌属(ifesorAizoAia ) 中有ACC脱氨酶菌株的acoi 基因的系统发育树。图中■指示紫穗槐中慢生根瘤菌 Mesorhi zobi um amorphae CCNWGS0123,菌株名后括号内是acoS1基因核昔酸序列在GenBank 数据库中的登录号。
具体实施方式
I.根瘤菌的分离、纯化和保存从在湖北省谷城县冷集镇野生刺槐中选择健壮刺槐根上大且饱满的根瘤，用剪刀小心将根瘤连部分根剪下，将同一刺槐根部获得的5 - 15个根瘤放入装有干燥变色硅胶并覆有脱脂棉的小管中。然后将采集的根瘤用无菌水充分浸泡吸胀后，用95%的酒精浸泡30 S， 接着用0.1%的升汞表面灭菌5 min，再用无菌水冲洗6次，将每个根瘤编号后分别放入一个无菌的2-ml离心管中，用无菌的研磨棒将根瘤研碎，用移液器加入I ml无菌水并吸排3 次悬浮匀浆液，将悬浮液系列稀释10倍，100倍和1000倍，然后分别吸取100 μ I悬浮液涂布在YMA固体培养基(每升含I g酵母粉，10 g甘露醇，0.5 g K2HPO4, 0.2 g MgSO4,0.1g NaCl, l.Og CaCO3, pH 6.8，15 g琼脂粉)上，将培养平板放在28°C暗培养。培养3 - 5天后挑取有典型根瘤菌菌落形态(圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑且因有丰富的胞外多糖而粘稠、较湿润、稍透明)的菌落，在YMA平板上划线培养，重复3次划线纯化菌落。将纯化的单菌落在无菌水中悬浮，经革兰氏染色后镜检，选出革兰氏染色阴性、细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。所述纯化的根瘤菌菌株可接种在TY培养液(每升含5 g胰蛋白胨，3 g酵母粉，0.33 g CaCl2, pH 6. 8)中培养至对数后期或稳定期，与30% (v/v)的甘油溶液等体积混匀，冷冻于_80°C长期保存。
2.根瘤菌ac必基因的扩增和鉴定将根瘤菌菌株接种到TY培养液中培养至对数后期或稳定期的100 μ I菌液移至1.5-ml离心管中，8000 rpm离心5 min,吸去上清液,用0. 5 ml灭菌双蒸水清洗2次,用100 μ I灭菌双蒸水重新悬浮菌体，取I μ I菌悬液进行PCR扩增；模板是菌体经pcr预变性反应加热裂解后释放的 DNA ;引物是 acdSf3 :5’-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCANAC_3’和 acdSr3 5’-GTGCATCGACTTGCCCTCRTANACNGGRT-3’，使用浓度为0. 4 μ Μ。反应体系用天根生化科技 (北京)有限公司生产的2XTaq PCR MasterMix0 PCR扩增在Bio-Rad S1000型PCR仪上进行。扩增程序为94°C预变性4 min;94°C变性45 s，53°C退火45 s，72°C延伸I min, 35个循环；72°C延伸7 min。扩增产物用1% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送至英潍捷基(上海)生物技术有限公司用引物acdSf3和acdSr3进行测序。
从菌株KDRM185扩增得到的DNA片段在去除引物后的序列见SEQ ID NO: 2。将序列SEQ ID NO: 2在NCBI数据库中进行BLAST检索，结果显示SEQ ID NO: 2与中慢生根瘤菌属根瘤菌的acoi 相似，其中与从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的紫穗槐中慢生根瘤IMesorhizobium amorphae CCNWGS0123 的两个拷贝 acdS 中的一个 acoS1 的相应序列(可在GenBank登录号AGSN01000010的序列中检索到)相同。这表明扩增得到的序列是ac必序列，菌株KDRM185有ACC脱氨酶。
3.用有ACC脱氨酶的根瘤菌接种刺槐苗和检测接种效应选直径约O. 8 - I cm的刺槐根，剪成8 - 10 cm的根段，将根段插入苗床的育苗基质中，在25 - 28° C，相对湿度75 - 85%的温室中培养，每周浇水一次，在约5周后刺槐出苗约5 - 8 cm时进行接种。具体为先将有ACC脱氨酶的根瘤菌在YMA固体培养基上生长的新鲜菌落接种至TY培养液中，在28° C和200 rpm培养48 - 72 h至稳定期；培养时每个500-ml锥形瓶装100 ml培养液，培养后每毫升约含5 X IO9个细菌细胞。然后将菌液用自来水稀释500倍后浇灌苗床。对照幼苗用等量的自来水代替进行浇灌。接种3个月后检测刺槐苗的结瘤数、株高、地径和干重。其中菌株KDRM185的结果如表I所示。
表I根瘤菌KDRM185接种刺槐苗的效应结瘤数株高(cm)地径(mm)地上部干重(g)干重增加(%)不接种的对照刺槐苗3653. 406. 350接种的刺槐苗471115. 5815. 24140%从表I可以看出接种刺槐后，根瘤菌KDRM185与刺槐共生可形成较多的根瘤，通过还原空气中的N2为刺槐生长提供氮素，能显著促进刺槐苗生长，增加生物量。
4.细菌16S rRNA基因的扩增和鉴定将菌株接种到TY培养液中培养至对数后期或稳定期的100 μ I菌液移至I. 5-ml 离心管中，8000 rpm离心5 min,吸去上清液，用O. 5 ml灭菌双蒸水清洗2次，用100 μ I灭菌双蒸水重新悬浮菌体，取I μ I菌悬液进行PCR;模板是菌体经PCR预变性反应加热裂解后释放的DNA ;引物是27F :5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和1492R 5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，使用浓度为O. 25 μ Μ。反应体系用天根生化科技(北京)有限公司生产的2XTaq PCR MasterMix0 PCR扩增在Bio-Rad S1000型PCR仪上进行。扩增程序为94° C预变性3 min; 94° C变性55 S，50° C退火50 S，72° C延伸I min，35个循环; 72°C延伸10 min。扩增产物用1% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后送至英潍捷基 (上海)生物技术有限公司用相应扩增引物进行测序。
从菌株KDRM185扩增得到的DNA片段在去除引物后的序列见SEQ ID NO: I。将序列SEQ ID NO: I在NCBI数据库中进行BLAST检索，结果显示SEQ ID NO: I与中慢生根瘤菌属根瘤菌的16S rRNA基因序列相似，其中与中慢生根瘤菌属典型种百脉根中慢生根瘤菌典型菌株JfesorAizoAiws loti ATCC 700743的16S rRNA基因序列一致性为98. 8%，与锦鸡儿中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因序列一致性为99. 9%。这表明扩增得到的序列是16S rRNA基因序列，菌株KDRM185属于中慢生根瘤菌属。
5.根瘤菌16S rRNA基因的系统发育分析将菌株KDRM185的16S rRNA基因序列SEQ ID NO: I与中慢生根瘤菌属现有25个种的各种典型菌株(见 the List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, http://www. bacterio. cict. fr)的16S rRNA基因序列一起进行系统发育分析。分析时以根瘤菌属典型种豆根瘤菌典型菌株·leguminosarum USDA 2370的16S rRNA基因序列为外群。用MEGA 5.0软件对163 rRNA基因序列进行系统发育分析，用MEGA 5. O软件整合的MUSCLE程序以默认参数运行序列联配，用Neighbor-joining法以Kimura 2-parameter 模型构建系统发育树；树分支节点扩展值用Bootstrap方法重复1000次计算。
所述分析构建的系统发育树见图I。图I显示菌株KDRM185的16S rRNA基因与锦鸡儿中慢生根瘤菌典型菌株ifesorAizoAia caraganae CCBAU 11299的16S rRNA基因处在同一节点分出的分支上，表明菌株KDRM185属于中慢生根瘤菌属，可能属于锦鸡儿中慢生根瘤菌种。
6.根瘤菌acoS1基因的系统发育分析将菌株KDRM185的ac必基因序列SEQ ID NO: 2与中慢生根瘤菌属中已发现有ac必的7个菌株的acoS1基因序列一起进行系统发育分析。分析时以豆根瘤菌 Ieguminosarum bv. viciae 3841 的 acoS1 基因序列为外群。用 MEGA 5. O 软件对 acoS1 基因序列进行系统发育分析，用MEGA 5. O软件整合的MUSCLE程序以默认参数运行序列联配， 用Neighbor-joining法以Kimura 2-parameter模型构建系统发育树；树分支节点扩展值用Bootstrap方法重复1000次计算。
所述分析构建的系统发育树见图2。图2显不菌株KDRM185的acoS1与从生长在甘肃省刺槐的根瘤中分离的ifesorAizoAiw amorphae CCNWGS0123的两个拷贝acoS1中的一 y^acdS处在系统发育树上的同一分支,与中慢生根瘤菌属中其他已知有ACC脱氨酶菌株的 acdS的亲缘关系较远。这表明在进化中属于不同种的根瘤菌KDRM185和CCNWGS0123两者之间可能发生过基因的水平转移或者通过水平转移的方式从其他根瘤菌获得了相同的acdS基因。
权利要求
1.中慢生根瘤菌KDRM185，其特征在于它已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO M 2012329。
2.根据权利要求I所述的中慢生根瘤菌KDRM185在刺槐育苗造林中的应用。
全文摘要
本发明涉及一个从刺槐根瘤中分离的、有ACC脱氨酶能高效结瘤并促进刺槐生长的中慢生根瘤菌KDRM185及其应用。该中慢生根瘤菌KDRM185菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2012329。本发明所述的中慢生根瘤菌KDRM185有ACC脱氨酶，能将ACC分解成α-酮丁酸和NH3，降低植物细胞合成乙烯的水平，减轻乙烯对根瘤菌侵染的抑制作用，提高根瘤菌与刺槐的结瘤率和共生固氮的水平，为刺槐在不施肥的贫瘠荒地上生长提供高水平的氮素，促进刺槐苗生长，增加刺槐成材的生物量，从而用低成本的接种投入让刺槐成材高产，在刺槐育苗造林上发挥作用。
文档编号A01G1/00GK102978138SQ20121047572
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者李江川, 李万里, 张继泰 申请人:中盈长江国际新能源投资有限公司