专利名称：蟑螂提取物有效部位用于制备抑制真菌生长药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及蟑螂粗提物经大孔吸附树脂材料柱层析法精制得到的有效部位在制备抗真菌感染药物方面的用途。
背景技术：
随着医学科学的发展，各种新药物和新技术如广谱抗生素、激素、各种导管插管技术、化疗、移植等医疗手段的广泛使用，以及HIV感染和肿瘤，造成人类免疫系统被逐渐破坏的病例逐年增多，从而导致深部真菌病的发病率愈来愈高；而另一方面，随着人类滥用抗生素和临床抗真菌药物的广泛使用，导致传统抗生素不能有效对抗某些严重真菌感染和细 菌感染、真菌的耐药现象日益严重。传统抗生素的作用已经遭遇显著瓶颈，大多数细菌、真菌对常见的抗生素产生了显著的抗药性；艾滋病患者、重症患者、烧伤患者等并发真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，寻找广谱、高效、低毒的抗真菌新药已成为药物研究的热点；对耐药菌/顽固性真菌的研究迫在眉睫。真菌感染引起的疾病大体上可以分为以下四类侵袭性真菌病与全身性真菌病(如曲霉病和念珠菌病等)、粘膜型真菌病(如“鹅口疮”等)、浅表型皮肤真菌病(如“香港脚”或“头皮癣”、“灰指甲”等)和过敏型真菌病(如哮喘与慢性炎症等)。在以上四类真菌病中，以第一类对人类危害最大，而后三类真菌病相应较轻一些。据来自国外的临床统计资料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌类真菌感染，大约2%的人死于全身性念珠菌感染。临床统计资料表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率高达85%，如患血液性念珠菌病则其死亡率可达40%。利用现有抗真菌药物治疗全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍无法令人满意。因此，药学界正在寻找可以抑制全身性感染的新型药物。目前，国内外已开发上市的抗真菌药物主要有四大类，即多烯类(如两性霉素B)、三唑类(如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等)、烷基胺类(如特比萘芬)和新开发上市的棘白菌素(echinocandins)类(如卡帕芬净和米卡民等)。前三大类抗真菌药均为20世纪开发上市的老药，而棘白霉素类则是21世纪初开发上市的新药。但在上述药物中，只有少数几种能用于治疗全身性真菌感染症。三唑类抗真菌药物无论第一代还是第二代均对有丝真菌引起的全身性感染疗效不佳，而棘白霉素类抗真菌新药则对这类疾病有效。目前棘白霉素面临的最大问题是尚无口服剂型，只限于注射(且仅限于医院使用)，故病人使用颇为不便。其次，虽然棘白霉素对常见念珠菌病等真菌性感染疗效不错，但其价格昂贵，故而限制了它们在发达国家以外市场的销售量。如据报道，在我国市场上，每支卡帕芬净注射剂(剂量为50毫克)的零售价为3148元，而日本产的米卡民价格稍低一些，但每支(剂量50毫克)也要650元。我国医院临床目前最常用的全身性抗真菌药物仍为大扶康和特比萘芬。老品种的康唑类如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通过抑制真菌麦角甾醇生物合成中的羊毛留醇14去甲基化酶而起效，此类老牌唑类抗真菌药物抗菌谱较窄而耐压性与日俱增。新品虽抗菌谱扩大但是代谢性质和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差；患者需要高脂饮食以利药物吸收，或服用高价的特种制剂形式方可起效；为增加水溶性而添加的环糊精等也给肾功能不全者带来较大威胁。综上所述，尽快寻找异于以往药物的新型抗真菌药用物质是今后数十年药物工作者们需要抓紧研制的当务之急。本发明人从植物中发现许多对革兰氏阳性菌和/或阴性菌有效的植物提取部位和有效成分(赵昱等，具抗病毒、抗炎和/或抗菌作用的六棱菊属提取物及其用途，ZL 200510077457. 3 ;生姜中单萜苷类化合物及其抗菌用途和药物组合物，CN 101012255 ;蒲公英中的两个黄酮苷及其抗格兰氏阳性菌的医药用途，ZL200710067180. 5 ;蒲公英中的木质素及其抗菌活性和医药用途，ZL 200710067458. 9 ;黑紫橐吾中的含氯原子艾里莫芬烷及其抗菌和细胞毒活性，ZL 200710067460.6 ;蒲公英中的倍半萜内酯及其抗格兰氏阳性菌的用途，ZL 200710067776. 5 ;黑紫橐吾素A及其抑制格兰氏阳性菌的医药用途，ZL 200710068539.0 ;蒲公英木质素抑制格兰氏阳性菌的制药用途，ZL200810165728. 4)，更加增添了我们研发新的“绿色抗生素”、发现新的抗真菌天然药物的信心。本发明人团队另一研究重点是昆虫类抗菌肽资源的开发。抗菌肽是自上世纪80年代以来兴起的新的抗菌药物开发领域。其是指从生物体内发现的宿主产生的一类能够抵御外界病原体感染的小分子多肽，由动物体内的分泌物、血液、淋巴组织等分离得到的大量抗菌肽与传统抗生素的作用机制不同，且其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌都有不同的选择性。该研究方向引起了我们的兴趣，故而着力于从抗感染能力强的种群中发现绿色抗生素，诸如抗菌肽类物质和其他有成药可能的小分子物质基础。蟑螂，为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科(Blattidae)大蠊属昆虫，最常见为美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)。蟑螂入药始载于《神农本草经》,其中把它列为中品，谓“味咸、寒；治血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”(孙星衍等，《神农本草经》，商务印书馆，1955: 90)。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称其为石姜、滑虫；各地方有其不同的称法，如偷油婆、茶婆子、灶蚂子等。蜚蠊科是一个庞大的昆虫家族，在地球上已生存了 3. 2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。无疑它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。1960年Princis曾报道蜚蠊在世界范围内约有3500 种，我国已有记录的共253种(冯平章、郭予元、吴福祯，中国蟑螂种类及防治，北京中国科学技术出版社，1997年4月)，主要分布于热带、亚热带地区的室内或野外。美洲大蠊是其中少数几种家居蜚蠊品种之一，其作为室内害虫主要栖息于厨房、食堂、仓库等处损害食物、衣服、书籍等，取食并污染人的食物，传播痢疾、伤寒、蛔虫、蛲虫等多种疾病。从厨房和仓库等收集到的226只蟑螂体表及肠道内检出致病菌25种，感染率高达99. 9% (Pai H H等，Isolation of bacteria with antibiotic resistance from household cockroaches(Periplaneta americana and Blattella germanica), Acta Tropica,2005,93 (3): 259)。蟑螂作为害虫是城市卫生防疫部门和海关检疫部门重点防治对象之一。然而，在科技日新月异的今天，面对上千种针对它的各种杀灭剂，这一昆虫群体依然十分活跃，这表明其体内必应具有某些特殊的物质和其特有的作用机制，引起了国内外一些学者的关注。近几年来随着我国对传统中医药资源研究开发的重视，有些学者对这一几千年来无法根绝的害虫进行了应用开发方面的研究，并取得了可喜的成就，发掘出了这一传统意义上的害虫的正面价值。发明人所在研究团队对蟑螂进行了十余年的研究；所研发的“康复新”、“心脉隆注射液”、“肝龙注射液”取得了 3只国家新药证书，产品已经上市销售。“康复新”在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效。从美洲大蠊醇提物中纯化精制而成的“心脉龙注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量。“心脉龙注射液”主治右心衰,也可治急慢性心衰,失血性休克,低血压,室性早博,病窦性综合症,心脑缺血性疾病。用美洲大蠊中提取分离得到抗菌肽成分通过大肠杆菌测试其抑菌作用，结果显示大肠杆菌的数量在一定的测试时间内逐渐减少(蓝江林，周先治、卓侃等，美洲大蠊抗菌肽杀菌作用初步观察，福建农林大学学报(自然科学版)，2004，33(2): 166)。通过电镜观察表明，美洲大蠊抗菌肽首先使细菌的外层及细胞质膜损伤，形成开口，导致内容物外泄而死亡，最后菌体崩解成碎片。因此认为美洲大蠊抗菌肽对大肠杆菌不是一般的抑菌作用，而是直接杀灭作用。对蜚蠊科昆虫澳洲大蠊(Periplaneta australasie Fabricus)全虫(去翅及足)的油状醇提取物进行的体内筛选，证明澳洲大蠊提取物对S-180及人食管癌小鼠异种移植均有显著的抗癌作用(黄厚聘、程才芬、李淑芳，蟑螂油的抗癌作用，中草药， 1981，12(1) : 35)。陈利铭发现蟑螂提取物AT2能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，并能使脾脏重量增加，在体外可增加T淋巴细胞对Con A的转化反应，AT2治疗原发性肝癌49例，临床观察表明，其具有缓解症状、使甲胎蛋白下降、延长患者生存期的功效(陈利铭，蟑螂提取物AT2抗癌作用的临床及实验研究，中西医结合杂志，1986，(11) : 648)。在临床应用方面，蟑螂活虫提取物治疗原发性肺癌有良好效果。廖剑英以“康复新”治疗恶性纤维组织细胞瘤，取得良好效果(廖剑英，康复新治疗恶性纤维组织细胞瘤I例，大理学院学报，2003，2(3): 92)。有相关报道表明蟑螂提取物在抗肿瘤的同时具有一定的增强免疫功能的作用(罗志宏、占汉章、李艳红等，中药康复新在头颈部恶性肿瘤治疗中的作用观察，中国中西医结合耳鼻咽喉科杂，1998，6 (3) : 132 ;严奉祥等，中药康复新的在体免疫药理学特征，大理医学院学报，1991，3 (I) : 21)。中科院昆明动物研究所所完成的人体外试验证实从蜚蠊中提取的氨基酸以及粘多糖的化合物具有显著的抗艾滋病病毒的作用，该所研究人员进行的合胞体试验结果表明此类化合物对艾滋病病毒的治疗指数高达4264，是目前国际上抗艾滋病病毒一线用药AZT治疗指数的十分之一左右。由于从蜚蠊中提取的抗艾滋病药物至今还未发现毒副作用，所以，研究人员目前还对其治疗乙型肝炎进行了临床试验。在我们对美洲大蠊的后续研究中还发现用醇水混合溶剂提取美洲大蠊虫体具有体外抗单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)的功效(王晓雨、刘光明、宋丽艳、杨雷香、何正春、巫秀美、彭芳、董光平、朱孝慈、赵昱，美洲大蠊有效部位的用途，ZL 200810060885. 9)。依前所述，本发明人根据大量的文献调查，结合近期的初步检测发现该蟑螂提取的有效部位蛋白多肽含量在60%以上，我们推测其应该具有抗真菌活性，由此我们采用专利ZL 200810060885. 9中所述美洲大蠊有效部位的制备方法制备出该有效部位，并测试了其对多种真菌菌株的生长抑制作用。结果发现，该有效部位确实具有极其显著的抗真菌活性，由此完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种将美洲大蠊提取物有效部位用于制备抗真菌药物的用途；
本发明的另一目的是提供了一种应用美洲大蠊提取物有效部位制备而成的抗真菌药物组合物，所制备的药物还可以含有其它抗真菌药物。该抗真菌药物组合物含有治疗有效量的美洲大蠊提取物有效部位及其与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物，在制备预防和治 疗真菌感染引起的疾病的药物、外伤敷料中的应用；本发明的又一目的是提供了一种含有美洲大蠊提取物有效部位制备而成防治真菌感染的作为药物制剂、医疗器械、日化用品的多种制剂形式，包括水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。具体而言，本发明中美洲大蠊提取物防治真菌感染有效部位的制备方法如下用溶剂提取经粉碎或未粉碎的美洲大蠊虫体、浓缩提取回收溶剂、大孔吸附树脂柱层析、水洗、醇水溶液梯度洗脱方法纯化，得到的抑制真菌活性有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，粉碎得产品。本发明中的动物药材可以是美洲大蠊(Periplaneta americana)任一部位，即可以是美洲大蠊的头、身、翅，也可以是它们的混合物，优选全虫。可以是干燥全虫，也可以是未经干燥的全虫或活体全虫。本发明得到的美洲大蠊提取物经大孔吸附树脂柱层析后中大极性的有效部位具有重要的生物活性，其对白色念珠菌有着强效的抑制作用，从而可以开发成为防治真菌感染类疾病的药物制剂、医疗器械、日化用品。美洲大蠊醇提物经大孔吸附树脂柱层析后中大极性的有效部位可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有真菌生长抑制活性从而可以用于防治真菌感染类疾病的药物组合物，以及相应的药物制剂、医疗器械、日化用品的多种制剂形式，包括水凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂。还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。经本发明人详细的文献查阅、查新发现，到目前为止，尚无由美洲大蠊醇提物经大孔树脂制备出的有效部位用于制备抗真菌药物的报道。该有效部位多肽类物质对于真菌生长的强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性，据此完成本发明。本发明的有益之处在于本发明制备出的美洲大蠊醇提物中经大孔吸附树脂材料柱层析法精制得到的多肽类有效部位，其原料来源方便易得，制备步骤简便、无污染、利于产业化。该多肽有效部位具有显著的抑制白色念珠菌等真菌生长的药效活性，对于开发市场广大的抗真菌感染药物、日化用品和医疗器械提供了新的物质基础；通过规范化养殖蟑螂又能给连片特困地区的农民增加收入、脱贫，具有潜在的社会效益和经济效益。
具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了美洲大蠊醇提物中经大孔吸附树脂材料柱层析法精制得到的多肽类有效部位的制备方法和对于四株白色念珠菌真菌菌株的生长抑制数据。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例I :用D-101大孔吸附树脂富集蟑螂有效部位冻干粉原料I. I 美洲大蠊醇提物的制备美洲大蠊药材3公斤，加55%乙醇10000毫升，室温浸泡提取，提取3次，每次24小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得美洲大蠊醇提物。I. 2 D-101大孔吸附树脂柱层析分段不同提取物的制备美洲大蠊醇提物20克，用30克D-101大孔吸附树脂吸附拌样，上200克D-101大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至无色，续用30 %乙醇-水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得有效部位1-30 [美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析30%醇洗液有效部位];续用60 %乙 醇-水溶液洗脱至无色，取洗脱液10毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得有效部位1-60 [美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60%醇洗液有效部位]。1.3经福林酚法检查，有效部位1-60中蛋白多肽含量为62.5%。实施例2 :美洲大蠊醇提物D-101大孔吸附树脂柱层析60%醇洗液有效部位抑制真菌活性检测参照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)提出的标准化抗真菌敏感性试验方法，测试实施例I制备得到的有效部位1-60的体外抗真菌活性。2. I真菌标准株白色念珠菌ATCC10231 :重庆疾病控制中心提供；白色念珠菌ATCC90029 (5_FC耐药菌株)北京医院卫生部临床检验中心提供；白色念珠菌ATCC76615 (CS3):第二军医大学附属长征医院提供。白色念珠菌98001 :武汉菌种保藏中心提供；白色念珠菌ATCC76615:19 (Y0119):南京皮肤病研究所提供。2. 2 试剂2.2.1沙氏琼脂培养基(sabouraud dextrose agar):广东凯微生物科技有限公
司产品。2.2.2酵母抽提物(yeast extract):海生工生物工程技术服务有限公司分装。2. 2. 3 三氮吗啡啉丙横酸(3-N-morpholinopropanesulfonicacid, MOPS)2. 2. 4标准抗真菌注射液氟康唑(Fluconazole,FCZ),扬子江药业集团公司。配置成不同浓度梯度的倍比稀释液。2.2.5 二甲基亚讽(dimethylsulfoxide, DMSO)及二甲基甲酸胺(dimethylformamide, DMF):上海生工生物工程技术服务有限公司分装产品。2. 3 仪器2.3.1电子天平JA1203N (AB204-5，MEITLER TOLEDO):上海精密科学仪器公司产品。2. 3. 2 SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司产品。2. 3. 3隔水式恒温培养箱(GSP-9160MBE):上海一恒科学仪器有限公司产品。2.3.4电热恒温培养箱(HZQ-F160A):上海一恒科学仪器有限公司产品。2. 3. 5美菱电冰箱(B⑶-221CHC):合肥美菱股份有限公司产品。2.3.6 微量移液器(Proline Pipette, DragonMed Pipette):芬兰雷勃公司产品。2.3.7细胞计数板(96 well cell culture cluster):上海求精仪器公司产品。2.3.8普通光学显微镜(Olympus):日本奥林巴斯光学仪器株式会社产品。2. 3. 9干烤箱(101A-2):上海崇明实验仪器公司产品。2. 3. 10立式高压蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S II):上海博讯实业有限公司产品。
2. 3. 11磁力加热搅拌器(ARE):意大利VELP公司产品。2. 3. 12滤膜、滤器(0. 22 u m, SART0RIUS):德国赛多利斯公司产品。2. 3. 13酸度计(PHSJ-4A):上海精科雷磁公司产品。2. 3. 14试管振荡器(MS2):广州仪科实验室技术公司产品。2.3.15恒温振荡培养箱(THZ-18AB):上海一恒科学仪器公司产品。2.3.16低温冰箱(-20 C，科龙B⑶-219WAK):广东科龙电器有限责任公司产品。2. 3. 17 96孔平底微量培养板美国Corning Incorporated产品。
2. 4实验方法2. 4. I实验步骤2. 4. I. I RPMI-1640液的配制取10. 4克RPMI-1640粉(含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBC0)溶于900毫升无菌水中，加入34. 53克三氮吗啡啉丙磺酸(MOPS)至其终点浓度为0. 165摩尔/升,室温下用磁力搅拌器混匀2 3小时,使其充分溶解,用氢氧化钠(I摩尔/升)调节PH值至7.0 (25 C)，用灭菌水定容至I升，滤过除菌，分装后-20 C保存备用。2. 4. I. 2储备液的制备储备液浓度应为应用液的10倍，FCZ (氟康唑)为1280微克/毫升，用电子天平称取FCZlO毫克，用I毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶解，之后用RPMI-1640稀释至储存液浓度，分装后-70 C保存备用。2. 4. I. 3应用液的制备用RPMI-1640液将储备液作1:10稀释后再作倍比稀，FCZ为128微克/毫升 0. 25微克/毫升作10个系列的浓度，均为2倍终浓度。2. 4. I. 4微量药敏培养板的制备使用一次性的96孔板，第I 10列分别加入10个浓度梯度的测试药物(有效部位1-60 ;阳性药物酮康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、两性霉素B)的应用液，从高浓度到低浓度。第11列加入RPMI-1640，每孔100微升，第12列作为空白对照，放入-20 C冰箱备用，使用时经-4 C、4 C和室温各I小时。2. 4. I. 5念珠菌的激活与稀释将待测的菌株在YPD琼脂培养基(1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)上激活两次后，取直径大于I毫米的菌落少许于3毫升无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，取少许，用血细胞技术板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为XX IO4 CFU/毫升，用RPMI-1640液调整浓度为3X IO4 CFU/毫升(两倍终浓度)。2. 4. I. 6加样在上述制备好的含有测试药物的培养板上加入念珠菌悬液,每孔100微升空白对照不加，震荡混匀后放入湿盒(防止微量板中的液体挥发而影响药物的浓度)35 C孵育24 48小时后观察结果。2. 4. I. 7肉眼判断结果以生长对照空白为依据，以80%抑制做为终点。即MIC8tl为观察终点菌种生长明显减少，液体轻微混浊；同时阳性生长中生长良好；空白对照清亮，无细菌生长。质控菌株之MIC值在美国临床微生物实验室标准CLSI M27-A2方案规定的范围内，显示实验结果是有效的。2.5实验结果见表I。表I有效部位1-60及阳性药物对白色念珠菌抑制作用(单位微克/毫升)
权利要求
1.一种蟑螂提取物有效部位用于制备抗真菌感染药物的用途，其特征为所述蟑螂有效部位提取物是指用溶剂提取经粉碎或未粉碎的美洲大蠊虫体、浓缩提取回收溶剂、大孔吸附树脂柱层析、水洗、醇水溶液梯度洗脱方法纯化，得到的抑制真菌活性有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，粉碎得产品。
2.一种具有预防和治疗真菌感染的药物组合物，其特征是该药物组合物含有治疗有效量的权利要求I所述的蟑螂有效部位提取物、具有消毒杀菌功效的中药材及制剂允许的药物赋形剂或载体。
3.根据权利要求2的药物组合物，其特征是所述药物组合物中含有的蟑螂有效部位提取物、具有消毒杀菌功效的中药材的重量比为1:(Γ1:1。
4.根据权利要求2的药物组合物，其特征是所述具有消毒杀菌功效的中药材是指大黄、板蓝根、石榴皮、石榴花、野菊花、臭灵丹、硫磺中的一种或多种。
5.根据权利要求2的药物组合物，其用于制备预防或治疗真菌感染的药物制剂、医疗器械、日化用品的用途；其特征是所述药物制剂、医疗器械、日化用品的形式是水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、软膏剂、外用搽剂、冻干粉。
全文摘要
本发明涉及蟑螂提取物有效部位用于制备抑制真菌生长药物的用途，具体而言本发明涉及一种蟑螂粗提物经大孔吸附树脂精制得到的有效部位在制备抗真菌感染方面的医药用途。本发明所述的有效部位由蜚蠊科美洲大蠊(Periplaneta americana L.)虫体鲜品或干品经醇水提取、大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，具有显著抑制白色念珠菌生长的活性，其抑制真菌生长的能力比氟康唑和5-氟胞嘧啶强80倍，比两性霉素强800倍。该蟑螂提取物有效部位可以制备成水凝胶、泡沫凝胶、巴布剂、冻干粉、水剂、气雾剂、栓剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂等形式，用于制备防治真菌感染的药物制剂、医疗器械、日化用品。
文档编号A01P3/00GK102973608SQ20121047836
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者白丽, 高鹏, 陈俊雅, 周萍, 高鹏飞, 赵昱, 钱金栿 申请人:大理学院