专利名称：从蟑螂中提取的蟑螂多肽及其提取方法
技术领域：
本发明涉及蟑螂提取物及其提取方法。具体而言，本发明涉及用乙酸作为溶剂从蟑螂中提取的蟑螂多肽及其提取方法。
蟑螂以脱壳方式生存，但每次脱壳后特别容易受到感染，所以不得不发展良好的抗菌能力。以昆虫的标准来看，蟑螂特别长寿，可以生存几年，远远超过用星期来计算寿命的苍蝇、蝴蝶、蛾。科学家们发现，蟑螂有强大的免疫系统使它得以长寿，同时该系统有记忆能力，能避开重复感染。
蟑螂具有多种药用价值。蟑螂有50-60种不同的蛋白质参与了复杂的免疫反应，国外的一些学着者正利用这种复杂的免疫反应和参加免疫的蛋白质研究蟑螂抗肝癌和人体对特殊蛋白排异的二方面工作。
用溶剂可以从蟑螂中提取各种活性组分，目前一般多采用乙醇作为溶剂从蟑螂中提取具有药用价值的活性组分，这些活性组分可用于治疗外创伤面、妇女生殖道疾病、心血管疾病和乙型肝炎等。中国专利CN87100537公开了“一种治疗外创伤面药物的制备方法”，该方法包括将蟑螂虫体干燥后粗粉碎；用乙醇溶液浸泡，提取其中的药用有效成分，然后分离滤渣和滤液，并对滤渣进行反复提取；浓缩所得滤液，回收乙醇，得到粘稠状物；经处理制成一种治疗外创伤面药物。中国专利94118839披露了从蟑螂中提取对心血管病有疗效的活性组分粘氨酸，采用乙醇提取后，除去油脂，制得水溶性浸膏，与复合核苷配伍，制成的药物对治疗心血管疾病有效。中国专利94108943揭示用乙醇提取、脱脂、活性炭吸附、分溶，获得蟑螂中的粘多糖缩氨基酸类化合物的混合物，主要用于乙型肝炎的治疗。
蟑螂多肽是蟑螂蛋白质的降解物，多肽进一步降解为氨基酸。
本发明的目的是提供用乙酸作为溶剂从蟑螂中提取的蟑螂多肽，是采用乙酸作为溶剂于室温密封浸泡蟑螂粉末24-72小时，浸泡后的提取液于80-100℃水浴中加热成混悬液，冻干处理该混悬液后得到的活性组分。这种蟑螂多肽具有显著的抑制和“杀死”肝癌细胞的作用。
本发明的第二个目的是提供从蟑螂中提取蟑螂多肽的方法，该包括下列步骤(1)在一密闭容器中，将蟑螂粉末浸泡在0.05-0.2M乙酸溶液中，密封浸泡24-48小时；(2)过滤除去滤渣，将获得的滤液置于80-100℃水浴中，加热制得一悬混液；
(3)混悬液经冻干处理，制成蟑螂多肽粉末。
首先在80-100℃烘箱中加热烘干蟑螂后，用8000-10000转/分钟的高速捣碎机粉碎烘干后的蟑螂，研碎成80-100目的粉末。
传统的生化提取方法采用有机溶剂进行提取。不同的溶剂可提取不同的活性组分。目前，一般采用乙醇作为溶剂从蟑螂中提取活性组分。乙醇提取的蟑螂中活性组分一般为蟑螂粘氨酸。本发明人对PBS、乙酸、丙酮、乙醇和DMSO五种溶剂提取蟑螂多肽的效果进行考查，方法是将1克蟑螂粉末分别用40毫升上述五种溶剂于4℃浸泡过夜，第二天用离心机，在4000rpm下离心分离15分钟，弃沉渣，然后用分光光度计在260nm和280nm测定上清液的光密度，计算蟑螂粉末溶液的蛋白浓度，结果发现乙酸对蟑螂多肽的溶解度最佳，蟑螂多肽浓度可达到3mg/ml。
在一密闭容器中，按照蟑螂粉末与溶剂比例为1∶5-10，将蟑螂粉末浸泡在0.05-0.2M乙酸溶液中，密封该容器，浸泡24-72小时，较好的浸泡24-48小时；过滤除去滤渣，将获得的滤液置于80-100℃水浴中0.5-1.0小时，制得一悬混液；混悬液经冻干处理，制成蟑螂多肽粉末。
由中国科学院上海细胞生物学研究所对蟑螂多肽进行体外癌细胞增殖抑制试验，用本发明方法提取的蟑螂多肽配于营养液中，培养肝癌细胞7404和7721，蟑螂多肽在100μg/ml或更大剂量条件下，对这两种细胞生长都有明显的抑制和“杀死”效果。
按照LD50试验方法，用本发明提取的蟑螂多肽给小鼠一次灌胃给药，进行急性毒性试验，7天后测得LD50＞9.6g/kg。因此临床上应用几乎无毒副作用。
用狗进行慢性毒性试验，连续服用本发明提取的蟑螂多肽一年(24g/kg，3次/日，饭前)，无一死亡。对其血象、肝、肾功能、心电图等检测，未见影响。一年后解剖，未造成实质性器官的病理损伤。
动物肿瘤模型试验试验结果表明蟑螂多肽对S-180实体型肿瘤有疗效，肿瘤抑制率大于40％。
巨噬细胞试验该试验证明，肿瘤多肽能提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数。
本发明提取的蟑螂多肽对抑制和“杀死”肝癌细胞有显著效果。将300mg蟑螂多肽装入胶囊，制成胶囊剂药物。给患肝癌病人试服(300mg/粒，5粒/次，3次/日)，最少连续服用一年，最长连续服用三年，患者肝癌症状、指标均见好转，尤其是甲胎蛋白指标由400μg/L以上，降低到40μg/L以下。
图1所示是7721细胞在仅含相当于溶解蟑螂多肽同等浓度的HAC常规培养液中培养3天的生长情况。
图2所示是经100μg/ml处理3天的7721细胞生长情况。
图3所示是7404细胞在软琼脂层形成集落。
图4所示是经100μg/ml处理的7404细胞在软琼脂层不再形成集落的情况。
由下面的实施方案能进一步理解本发明。
实施方案制备实施例1将蟑螂置于90℃烘箱中，加热烘干2小时。使用高速捣碎机，在10000转/分钟速度下粉碎烘干的蟑螂，每次5分钟，进行3次。制成粒度为80-100目的粉末。
在1升磨口瓶中，按照1∶8的固液比，放入100克烘干粉碎的蟑螂粉末和800克0.1M乙酸溶液，密封后于室温浸泡30小时。过滤分离，弃滤渣。将滤液置于90℃水浴中，加热1.0小时，得到一混悬液。该混悬液经冻干处理得固体粉末30克。
制备实施例2将蟑螂置于80℃烘箱中，加热烘干10小时。使用高速捣碎机，在10000转/分钟速度下粉碎烘干的蟑螂，每次5分钟，进行3次。制成粒度为80-100目的粉末。
在1升磨口瓶中，按照1∶10的固液比，放入100克烘干粉碎的蟑螂粉末和1000克0.05M乙酸溶液，密封后于室温浸泡48小时。过滤分离，弃滤渣。将滤液置于100℃水浴中，加热0.5小时，得到一混悬液。该混悬液经冻干处理得固体粉末25克。
制备实施例3将蟑螂置于100℃烘箱中，加热烘干2小时。使用高速捣碎机，在8000转/分钟速度下粉碎烘干的蟑螂，每次5分钟，进行3次。制成粒度为80-100目的粉末。
在1升磨口瓶中，按照1∶5的固液比，放入100克烘干粉碎的蟑螂粉末和500克0.15M乙酸溶液，密封后于室温浸泡24小时。过滤分离，弃滤渣。将滤液置于80℃水浴中，搅拌下加热1.0小时，得到一混悬液。该混悬液经冻干处理得固体粉末30克。
制备实施例4在1升磨口瓶中，按照1∶5的固液比，放入100克粒度为80-100目的蟑螂粉末和500克0.10M乙酸溶液，密封后于室温浸泡72小时。过滤分离，弃滤渣。将滤液置于80℃水浴中，搅拌下加热1.0小时，得到一混悬液。该混悬液经冻干处理得固体粉末30克。
用上述制备实施例制取的蟑螂多肽进行下列实验。
1.体外癌细胞增殖抑制试验由中国科学院上海细胞生物学研究所进行。
将上述制备实施例中提取的蟑螂多肽分别以25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的剂量配于营养液中，培养肝癌细胞7404和7721，逐日在相差显微镜下观察两种肝细胞系的细胞生长情况。细胞接种数为1×104/ml。培养一星期，该试验重复三次，发现蟑螂多肽在大剂量条件下对两种细胞生长都有不同的抑制和“杀死”效果。
7721细胞的生长情况见表1。
表1不同剂量的蟑螂多肽对7712细胞的生长影响
由表1可知，25μg/ml和50μg/ml剂量组7天后计数细胞与对照组相比无明显差异。对照组细胞数为33.5万/ml，而100μg/ml和200μg/ml剂量组的细胞数分别为1.7万/ml和0.2万/ml，与对照组相比有明显差异。
7404细胞用上述不同剂量的蟑螂多肽处理的结果略不同于7721细胞，结果列于表2。
表2不同剂量的蟑螂多肽对7404细胞的生长影响
由表2可知，在蟑螂多肽低剂量下(25μg/ml、50μg/ml)培养3天，细胞就有少数死亡现象。而在高剂量组100μg/ml培养3天，就发现细胞全部死亡和裂解(见图1和图2)。表明蟑螂多肽对7404细胞的生长抑制或“杀死”效果比对7721更为敏感。
对100μg/ml蟑螂多肽培养的7721和7404细胞，在软琼脂上这两种细胞都不能形成集落，而对照组仍能形成集落生长(见图3和图4)，表明蟑螂多肽以100μg/ml的剂量能有效杀死肝癌细胞。
2.急性毒性(LD50)试验由上海市药品检验所进行。
将上述制备实施例中提取的蟑螂多肽给小鼠一次灌胃给药，观察7天，测得LD50＞9.6g/kg，因此临床上应用几乎无毒副作用。
3.慢性毒性试验狗连续服用上述制备实施例中提取的蟑螂多肽一年(24g/kg，3次/日，饭前)，无一死亡。对其血象、肝、肾功能、心电图等检测，未见影响。一年后解剖，未造成实质性器官的病理损伤。
4.动物肿瘤模型试验按照下面方法对小白鼠进行肉瘤S 180实验。取体重18-22克的小白鼠40只，10只为一个试验组，共三个试验组，其余10只为对照组。试验组以1g/kg剂量腹腔注射多肽上述制备实施例中提取的蟑螂多肽，对照组注射生理盐水，每日一次，连续14天，第15天进行解剖，按照下面公式计算肿瘤抑制率。
抑制率＝(对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％该试验以肿瘤抑制率大于30％为有效。三个试验组的抑制率分别为45％、48％和42％。大于30％，为有效。
实验结果表明蟑螂多肽对S-180实体型肿瘤有疗效。
5.巨噬细胞试验按照下面方法对小白鼠进行动物腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数实验。
取体重为20-25克的小白鼠20只，10只为试验组，10只为对照组。试验组以40g/kg剂量注射上述制备实施例中提取的蟑螂多肽，对照组注射生理盐水，每日一次，连续5天，按照观察巨噬细胞功能滴片法进行试验。试验组吞噬率为78.02±2.01，吞噬指数为2.02±0.10，对照组吞噬率为47.13±3.20，吞噬指数为1.15±0.05。实验结果表明蟑螂多肽对小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数有增加作用。
权利要求
1.一种从蟑螂中提取的蟑螂多肽，其特征在于所述蟑螂多肽是采用乙酸作为溶剂于室温密封浸泡蟑螂粉末24-72小时，浸泡后的提取液于80-100℃水浴中加热成混悬液，冻干处理该混悬液后得到的活性组分。
2.一种从蟑螂中提取蟑螂多肽的方法，所述方法包括下列步骤(1)在一密闭容器中，将蟑螂粉末于室温浸泡在乙酸溶液中，密封浸泡24-72小时；(2)过滤除去滤渣，将获得的滤液置于80-100℃水浴中，加热制得一悬混液；(3)混悬液经冻干处理，制成蟑螂多肽粉末。
3.如权利要求2所述的提取蟑螂多肽的方法，其特征在于所述乙酸浓度在0.05-0.2M范围。
4.如权利要求2所述的提取蟑螂多肽的方法，其特征在于所述蟑螂粉末粒度为80-100目。
5.如权利要求2所述的提取蟑螂多肽的方法，其特征在于所述蟑螂粉末与乙酸的重量比在1∶5-10范围。
6.如权利要求2所述的提取蟑螂多肽的方法，其特征在于所述蟑螂粉末于室温在0.05-0.2M乙酸溶液中密封浸泡24-48小时。
7.如权利要求2所述的提取蟑螂多肽的方法，其特征在于所述提取液在80-100℃水浴中加热0.5-1.0小时。
全文摘要
本发明提供了一种用乙酸作为溶剂提取的蟑螂多肽。这种蟑螂多肽具有显著的抑制和“杀死”肝癌细胞的作用。
文档编号C07K1/14GK1371914SQ0110550
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者刘耀北 申请人:刘耀北