专利名称：乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体及其组建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属病毒基因工程领域，具体涉及一种乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体及其组建方法和应用。
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，具有独特的基因结构及生物学特性。该病毒的基因组是双链环状DNA，但却有一段单链区。HBV的基因组约为3200硷基对(bp)长，但其正链和负链的长短不同。负链具有固定的长度，即约3200bp。HBV的基因组有4个编码区，包膜基因(S/pre-S)，核心基因(C/pre-C)，多聚酶基因(P)及X基因。P基因最长，覆盖约80％的基因组并与其他的编码区重叠。虽然与其他的编码区有重叠，但P基因有自己的读码框架。乙型肝炎病毒引起疾病的临床表现多种多样，可为无症状携带者、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎，并可发展为肝硬化或肝癌。目前对HBV引起疾病的多样化认为既与机体的免疫应答相关，也可能与病毒的基因组结构与功能相关。病毒的复制是最关键的因素之一，因为如病毒停止复制则疾病的发展可受到控制。
Summers等(Cell 1982；29403-415)首先在鸭乙肝病毒中证明病毒的复制需经过RNA复制中间体环节。以后在人乙肝病毒也证实了这一独特的复制方式。因此学者们认为HBV的复制周期与逆转录RNA病毒很相似，有些区是高度保守区，并与逆转录病毒的依赖RNA的RNA多聚酶、依赖DNA的DNA多聚酶及RNaseH相似(Toh et al，Nature1983；305827)。通过与人类免疫缺陷病毒(HIV)及其他病毒的逆转录酶比较，目前认为乙肝病毒的多聚酶可分为4个区自5’-末端开始，依次为末端蛋白区(TP)-连接臂区(spacer)-逆转录酶/DNA多聚酶区区(RT/DNAP)-RNA酶H区(RNAse H)(Bartenschlager andSchaller，1988；EMBO J74185；Radziwill et al.1990；J Virol64613)。其中3个具有功能，认为连接臂区无重要功能。有关多聚酶功能的变异，最受关注的是与耐抗HBV药物拉米夫定的氨基酸变异，即位于P基因中间部位逆转录酶(RT)的第551-554位YMDD(氨基酸Tyrosine-Methionine-Aspartic acid-Aspartic acid，酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)变为YVDD的变异。最近出现的对另一种药物(famciclovir)耐药的变异位于P区IP及RT区。对于HBV多聚酶的功能区，目前均已报道的与人类免疫缺陷病毒(HIV)的RT相应对比而分为A(421-436)，B(506-528)，C(546-556)，D(576-5890，E区(592-60)。上述的YMDD耐药性变异已确定在多聚酶基因的C区。
-有关HBV聚合酶基因变异与毒株复制功能相关的研究，首先Blum等报道自一例乙型肝炎患者肝组织中获得复制缺陷的HBV株，经克隆不同片段再拼接后获得全分析基因组(HBV5-15株，已在GenBank注册)。进一步用点突变及截短基因技术，发现因该毒株在P基因的TP区第2798位核苷酸由C(胞嘧啶)突变为A(腺嘌呤)导致氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸后，病毒可失去复制能力。据此，他们以这一核苷酸及相应氨基酸的改变为对象，设计了与TP区中第2598-2998核苷酸互补的寡聚核苷酸作为可发展为抑制乙肝病毒复制的一种方法(Blum et al，Virology 1984；13987-96；Blum et al，Hepatology1991；1456-63；USA patent5,610,050,1997)。随后不同学者分别在不同乙肝的患者或发生肝癌的患者中用基因组，基因片段测序或点突变技术研究了乙肝病毒基因组的不同部位发生突变及与复制特性的改变，但均未能发现P基因中其他有意义与复制特性相关的改变。
迄今，对HBV RT功能区的推导或设计针对HBV RT的药物，均以HIV的RT作为标准；各种病毒的类似酶除有共性外，还可具有独特的功能区。因此寻找HBV的多聚酶中新的功能区具有特殊的医药价值。
本发明的目的是用置换病毒多聚酶(P)基因及其片段组建重组嵌合体，另一目的是寻找多聚酶中的新功能区，本发明的进一步目的是设计相应抑制乙肝病毒复制的药物或诊断制品。
本发明采用了自不同患者血或组织标本中一步扩增天然存在的HBV毒株全基因组，以全基因组为对象，对具有不同复制特性的毒株，根据其P基因序列，设计引物，旨在既能获得P基因，又能分别获得P基因的TP，spacer，RT及RNAse片段，用基因置换方法，组建新的带有多聚酶嵌合体的病毒基因组，可将不同片段置换，供作复制功能检测的技术。这一新技术超越了已有的以HIV P功能区为标准的限制，也不同于仅用HBV P区或仅以截短的HBV基因为研究技术的报道。用本发明的技术可寻找P基因编码产物新的功能区，本发明所用的自乙肝患者血清或组织中用一步PCR法扩增与克隆HBV全基因组的技术是Gunther等于1995年已报道的方法(J Virol1995，695437)。其步骤为用位于病毒基因组黏性末端区设计的引物，从乙肝患者的血清或组织中用PCR扩增HBV毒株全基因组后，克隆入质粒载体，组成带有HBV全基因组的重组质粒。用SapI内切酶消化，自重组质粒中获取完整而不带有外源DNA的全基因组HBVDNA，作基因组序列测定。用5-10μg HBV基因组DNA在生长于60mm直径平皿中的肝癌细胞系按照文献报道，用磷酸钙沉淀共转染法转染细胞。用SEAP(secreted alkaline phosphatase)质粒同时转染，作为转染效果的内对照。经一定时间孵育后(一般为5天)，根据Gunther的方法，去除可能存在残余的转染所用的DNA，分别用酚-氯仿方法提取细胞内核心颗粒中的DNA及细胞外存在的病毒颗粒的DNA，分别作凝胶电泳，Southern印迹后，与标记的HBV探针作分子杂交及放射自显影术。通过分析杂交信号的强弱，可确定高复制型病毒株及低复制型病毒株。有关中国乙肝患者中的高低复制株研究已作报道(病毒学报2000，16116)。
在采用上述技术获得一定资料后，分析核苷酸的序列差别，通过对比分析初步判断病毒基因组中复制功能相关区。
根据毒株的核苷酸序列差别，选择可作比较分析病毒株的对象。在HBV患者的全基因组分析中取2例分别为高复制型(#56)及低复制型(#2-18)的毒株。两株毒株作全基因组测序，基因组均为3221bp，为adw2血清型，两株间序列仅有42个核苷酸序列不同，已在GenBank注册(No.AF 100308，AF100309)。由于考虑到以此两株毒株可较容易作复制功能区的分析，对全基因组推导了氨基酸改变。选择多聚酶(P)基因为对象，根据序列分别设计具有酶切位点或可供作融合PCR的不同PCR引物。用酶切、PCR及融合PCR法，获得全P(聚合酶)基因，以及P基因中的TP(末端蛋白)，SP(Spacer，连接臂)，RT(逆转录酶)，和RNase H(RNA酶H)4个片段，供进一步组建多聚酶嵌合体用。
在两株HBV株基因组间进行聚合酶基因或其片段间的互换。将自一株病毒基因组克隆(A)(如#56)用PCR分别扩增出的P基因，TP、SP、RT及RNaseH片段，经限制性内切酶消化及连接酶作用后，分别置换另一株病毒基因组克隆(B)(如#2-18)的相应片段，获得了人工组建多种新的多聚合酶嵌合体基因组克隆。分别命名如A株全P基因被B株的全P基因置换的嵌合体(A-B-P)；A株P基因中的TP段被B株的TP置换的嵌合体(A-B-TP)；A株中SP段被B株SP段置换的嵌合体(A-B-SP)；A株中RT段被B株中RT段置换的嵌合体(A-B-RT)；A株中RNaseH被B株置换(A-B-RNase H)的嵌合体。对获得人工组建的含有不同多聚酶嵌合体的HBV全基因，作核苷酸序列测定证实无误后，自各嵌合体基因组克隆根据上述方法提取HBV DNA转染肝癌细胞。经一定孵育时间后，提取细胞内外的DNA，经电泳及Southern印迹后，与HBV DNA探针作分子杂交，根据杂交信号，判断各多聚酶嵌合体复制活性的高低。通过对比，在构建的多聚酶嵌合体中确定与复制增强相关新功能区的核苷酸及推导的氨基酸序列。这些序列可作为设计抗乙肝病毒作用的靶序列。对#56及#2-18株间作P基因及其各片段置换，组建的嵌合体基因组转染结果显示#56株中P基因转入#2-18，可使#2-18复制性增强。分别对P基因的各片段置换，显示当#56株的RT区转入#2-18后可使#2-18获得高复制活性，而其他P基因的片段无如此强复制性。#56株的RT片段与#2-18株的RT片段核苷酸序列所推导的氨基酸序列只有3个氨基酸差异。位于617(蛋氨酸→亮氨酸M→L)，652(丝氨酸→脯氨酸，S→P)，682(Val→亮氨酸V→L)。这3个氨基酸均位于公认的RT的A，B，C，D，E，功能区以外，在上述区的3’端，显示是一个新的与复制增强相关的新位点，可作为设计抑制HBV复制药物或判断HBV高、低复制型的靶。
本发明的创新点为(1)根据不同HBV毒株的核苷酸序列，设计引物及应用分子生物学技术，将P基因及其各片段从全基因组中切割。(2)根据所得的P基因或其片段，在自然存在的不同毒株全基因组间进行多聚酶及各其片段进行置换。(3)用各种新组成的P基因嵌合体基因组转染肝源细胞，对比复制特性，寻找到新的P基因编码的功能区。
本发明的优点为(1).用我国乙肝患者来源的HBV全基因组为研究对象，更有代表性，由此发展的治疗或诊断制品更有针对我国HBV患者的特性。(2)以患者标本一次直接扩增的HBV基因组作多聚酶基因的结构与功能分析，可避免因分次扩增基因片段、克隆、再拼接所获得的多聚酶基因发生人为造成的可能突变，将更真实地反映P基因的状况。(3).在全基因组水平进行P基因结构与功能分析，可同时检测因P基因序列改变所构成对其重叠的其他基因的影响。(4).应用自然存在的HBV毒株比全人工组建的克隆更有现实意义。(5).用重组P基因嵌合体及P基因各片段组建的嵌合体分析，可同时针对各P基因片段测定复制功能改变，供设计药物及诊断制品应用。
选择两株来自中国乙肝患者血清的HBV高(#56)、低(#2-18)复制型毒株基因组获取P基因的SP片段，用#56的SP置换#2-18的SP。对两株分别来自两名慢性乙肝患者均为B基因型，adw2血清型的的HBV毒株进行全基因组克隆，并进行转染HepG2肝癌细胞株证实分别为高复制型#56和低复制型#2-18。经全基因测核苷酸序列，发现有42个核苷酸序列的差异分布在病毒基因组的多个基因片段。根据序列分析，以多聚酶基因为对象，以两种内切酶酶切其中的SP片段并将#56的SP片段置换并克隆入#2-18，组建嵌合体。
首先，将重组质粒p2-18(含低复制株#2-18的pUC19重组载体)以BstEII及SpeI双酶切，回收4.8Kb大片段(去除2-18的SP)，其次，p56(含高复制株#56的pUC19重组载体)以相同双酶切，回收含#56SP约1.1Kb片段。用已知技术，用连接酶连接上述两回收片段，转化DH5α细菌并进行筛选。含#56的SP片段的#2-18嵌合体通过酶切及序列测定加以证实(简称2-18SP)。设计方案参见
图1。实验实例(二)设计引物扩增多聚酶基因中的TP片段，并将#56的TP片段置换并克隆入#2-18，组建嵌合体。
本实验所设计引物为P1、P2、P5、P6。其中，P1为pUC通用逆引物，P2、P5、P6为HBV特异性引物。引物序列如下P15’AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3’P25’AGACCACCAAATGCCCCTATC3’(2299-2319nt)P55’GATAGGGGCATTTGGTGGTCT3’(2299-2319nt)P65’CTGAGTTGGCTTTGAATGCAGG3’(2948-2971nt)嵌合体构建策略P1、P5以p2-18(含低复制株#2-18的pUC19重组载体)为模板，扩增约580bp片段，P2、P6以p56(含高复制株#56的pUC19重组载体)为模板，扩增约580bp片段。两扩增片段通过互补的P2、P5序列进行缓慢退火，并以P1、P6为引物进行融合PCR。这样获得的1.2Kb融合片段为#2-18来源的TP外侧非聚合酶基因片段和#56来源的TP片段嵌合体。
以EcoRI和BstEII双酶切1.2Kb融合片段，回收1.0Kb大片段。p2-18以相同双酶切并回收4.9Kb大片段。连接上述两回收片段，转化DH5α细菌并进行筛选。从而可获得含#56的TP片段的#2-18嵌合体。通过酶切及序列测定加以证实(简称12-18TP)。方案参见图2。实验实例(三)组建用#56全多聚酶(P)基因置换#2-18全多聚酶(P)基因的嵌合体基因组在上述2-18TP基础上，将#56的聚合酶全基因置换并克隆入#2-18，组建嵌合体。
质粒p2-18TP以BstEII及RsrII双酶切，回收4.0Kb大片段，该片段已去除2-18的Spacer、RT、RNaseH，只含2-18的TP。p56以相同双酶切，回收约2.0Kb的片段，只含#56Spacer、RT、RNaseH而不含56 d1TP。连接上述两回收片段，转化DH5α细菌并进行筛选。对含#56的多聚酶全基因的#2-18嵌合体通过酶切及序列测定加以证实(简称2-18P)实验实例(四)设计扩增多聚酶基因中的RT片段，并将#56的RT片段置换并克隆入#2-18，组建嵌合体。
本实验所设计的引物为P3、P4、P7、P8，引物及序列、位置如下P35’CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTC3’(457-481nt)P45’GAACCTTTACCCCGTTGCTC3’(1139-1158nt)P75’GAGCAACGGGGTAAAGGTTC3’(1139-1158nt)P85’GTTCACGGTGGTCTCCAT3’(1610-1627nt)嵌合体构建策略P3、P7以p56为模板，扩增约700bp片段(含#56RT片段)。P4、P8以p2-18为模板，扩增约490bp片段(含#2-18RNaseH片段)。两扩增片段通过互补的P4、P7序列进行缓慢退火，并以P3、P8为引物进行融合PCR。由此获得的1.2Kb融合片段为#2-18来源的RNaseH及#56来源的RT片段的嵌合体。
以SpeI和RsrII双酶切1.2Kb融合片段，回收0.89Kb大片段，p2-18以相同双酶切，回收约5.0Kb大片段，连接上述两回收片段，转化DH5α细菌并进行筛选。对含#56的RT片段的#2-18嵌合体通过酶切及序列测定加以证实(简称2-18RT)。实验实例(五)设计扩增多聚酶基因中的RNase H片段，并将#56的RNaseH片段置换并克隆入2-18，组建嵌合体。
本实验所用引物同上。
P3、P7以为p2-18模板，用PCR扩增约700bp片段(含#2-18RT片段)。P4、P8以p56为模板，用PCR扩增约490bp片段(含#56RNaseH片段)。两扩增片段通过互补的P4、P7序列进行缓慢退火，并以P3、P8为引物进行融合PCR。这样获得的1.2Kb融合片段为#2-18来源的RT及#56来源的RNaseH片段的嵌合体。
以SpeI和RsrII双酶切1.2Kb融合片段，回收0.89Kb大片段，p2-18以相同双酶切，回收约5.0Kb大片段，连接上述两回收片段，转化DH5α细菌并进行筛选。获得含#56的RNaseH片段的#2-18嵌合体通过酶切及序列测定加以证实(简称2-18RNaseH)。参见图3。实验实例(六)将个重组各嵌合体转染HepG2细胞，分析各嵌合体的复制特性。
1、用Qiagen试剂盒(maxiprep)大量抽提含各嵌合体的重组质粒载体，以SapI酶切释放游离的各嵌合体HBV DNA基因组。具体的量是按1μgDNA/1U，以50U SapI酶切获取约30μg HBV DNA。酶切产物以等体积苯酚/氯仿及氯仿各抽提一次，乙醇沉淀备用。
2、转染HepG2细胞(该细胞可自ATCC获得)采用磷酸钙共沉淀法，将酶切后的各嵌合体HBV DNA与作为内参照的SEAP质粒(ref)共同转染HepG2细胞(15μg嵌合体HBV DNA＋10μg Seap DNA/1×106细胞/平皿)，转染后72小时收取上清及细胞。
3、细胞内HBV核心颗粒DNA的获取转染细胞中加入600μl裂解缓冲液(10mM Tris，pH7.9，1mM EDTA，50mM NaCl，1％NP40，8％蔗糖)，以加样器头反复吹打细胞，12000rpm离心2分钟，取上清。加入6μl 6mM醋酸镁，12μl 5mg/ml DNaseI，3μl 20mg/ml RNase，37℃ 30分钟后12000rpm离心1分钟，保留上清。往上清中加入16μlEDTA，130μl 35％PEG 8000/1.75M NaCl，冰浴1小时。9000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀重悬于100μl悬浮液中(10mM Tris，pH7.9，6MMgOAc，0.1μg/μl DNaseI)，37℃ 10分钟后再加入300μl SDS/蛋白酶K缓冲液(25mM Tris，pH7.4，10mM EDTA，100mM NaCl，0.5％SDS，1mg/ml蛋白酶K)，37℃消化过夜，等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀。
4、Southern-blot首先检测转染上清SEAP的表达量，据此调整各嵌合体HBV DNA转染细胞后胞内HBV核心颗粒DNA的上样量，使它们保持相同比例。以标准的adr HBV为模板，以随即引物法制备探针。对杂交信号进行密度扫描，根据扫描灰度的强弱来判断病毒复制的强弱。结果显示，与#2-18相比，经用#56的P置换组建的嵌合体的复制性增强，对各P基因片段置换重组体分析2-18RT(#2-18P基因的RT区段被#56的相应区段取代所组成的嵌合体)的复制功能显著增强。参见图4。实验实例(七)结合核苷酸序列分析嵌合体中与高复制相关的核苷酸序列及推导的氨基酸序列(采用Vector NTI Suite AlignX分析软件)基因组序列确认2-18RT与#2-18只有三个氨基酸的差别，它们分别位于P基因的617、652、682位氨基酸(都位于RT区)。#2-18与2-18RT比较，所改变的氨基酸为(617M→L，652S→P，682V→L)。RT区氨基酸的三维结构分析显示，617、652、682位氨基酸位于RT区羧基端与双链DNA结合的功能性区域内。图5中的X，Y，Z，分别代表SP片段中的617，652，682位氨基酸。实验实例结果总结用本发明所描述的技术，对两例分别为高复制型及低复制型乙肝患者的血清HBV毒株的全基因组克隆进行了多聚酶基因，及其片段(TP，Spacer，RT，RNaseH)的置换。结果确定在高复制株的RT区的第601-691氨基酸中有高复制性的功能区，并确定了其核苷酸与氨基酸序列。这一功能区不同与已知的其他功能区。以此新功能区为靶，可设计新的抗HBV药物与诊断制品。
图面说明图1为设计酶切及PCR扩增不同基因片段的方案图2为置换P基因及置换TP基因片段的方案图3为置换P基因中RT与Rnase H的方案图4为置换后重组体转染细胞内HBV DNA杂交的结果其中，12-18；256；32-18P；42-18SP；52-18TP 62-18RNaseH；72-18RT。
M分子量标准图5为P基因SP片段的示意图，显示X，Y，Z(617，652，682氨基酸)位置
权利要求
1.一种乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体，其特征在于其核苷酸及氨基酸序列，包括但不限于乙肝病毒P基因中逆转录酶(RT/DNA酶)基因片段的核苷酸及其编码的第600-691位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体，其特征在于其核苷酸及氨基酸序列为包括但不限于P基因中逆转录酶基因片段核苷酸及其编码的第617，652，682位氨基酸。
3.一种乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体的组建方法，其特征在于用乙肝病毒株的全基因组，通过设计引物或内切酶消化，置换其多聚酶基因及该基因中的不同片段，组建重组嵌合体基因组，分析确认置换片段后乙肝病毒的复制功能。
4.根据权利要求3所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体的组建方法，其特征在于所述的乙肝病毒株的全基因组取自自然存在的乙肝毒株。
5.根据权利要求3和4所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体的组建方法，其特征在于置换技术为在毒株间的P基因或其基因片段间的分段置换。
6.根据权利要求3所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体的组建方法，其特征在于采用人工设计的基因片段或寡聚脱氧核苷酸进行置换后的功能分析。
7.根据权利要求1所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体，在制备抑制乙肝病毒复制药物或制品中的应用。
8.根据权利要求1所述的乙肝病毒全基因组多聚酶嵌合体，在制备乙肝病毒诊断试剂、制品中的应用。
全文摘要
本发明属基因工程领域。本发明为在乙肝病毒株的全基因组中用置换病毒多聚酶(P)基因及其片段组建重组嵌合体,并用细胞转染技术分析其复制功能。本发明根据毒株编码多聚酶的核苷酸序列设计不同引物,结合内切酶消化及聚合酶链反应,对不同乙型肝炎病毒毒株基因组间的多聚酶基因及其中的各基因片段进行置换,对新组成的多聚酶嵌合体基因组作复制功能分析。本发明可用于寻找多聚酶中的新功能区及设计相应抑制乙肝病毒复制的药物或诊断制品。
文档编号C07K14/02GK1332239SQ0110568
公开日2002年1月23日 申请日期2001年3月15日 优先权日2001年3月15日
发明者闻玉梅, 林旭, 袁正宏 申请人:复旦大学