具有有用性状的植物和相关方法

具有有用性状的植物和相关方法
【专利摘要】本发明提供了通过瞬时抑制植物的MSH1基因获得呈现出有用性状的植物的方法。还提供了用于鉴定植物中提供有用性状的遗传基因座的方法以及用那些基因座产生的植物。此外，提供了呈现出有用性状的植物、包括种子的植物部分和植物产品，以及使用所述植物的方法。
【专利说明】具有有用性状的植物和相关方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]依据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求2011年9月28日提交的U.S.临时申请N0.61/540236的权益(按引用将其全部并入本文中)和2011年5月2日提交的U.S.临时申请N0.61/481519的权益(按引用将其全部并入本文中)。
[0003]序列表的并入
[0004]与本说明书一起通过电子提交(使用美国专利局EFS-Web提交系统)提交了75，938字节大小(如在操作系统MS-Windows中测量的)的并且在2012年5月I日形成的文件名为“46589_103289_SEQ_LST.txt”中包含的序列表按引用全文并入本文中。
[0005]关于联邦政府资助研究或开发的声明
[0006]依据能源部(DE-FG02-07ER15564和 DE-FG02-10ER16189)和国家科学基金(10S0820668和10S1126935)的授权，通过政府支持完成了本发明。政府对本发明具有特定的权利。
[0007]发明背景
[0008]MSHl基因表示陆生植物内的基因结构中经历了至少两个重要变化的MutS同源物(Abdelnoor等，2003)。MutS是参与错配修复和抑制同源重组的原核基因。与直接的蛋白-DNA相互作用模型一致，MSHl不仅编码DNA结合结构域(结构域I)和ATP酶结构域(结构域V)，而且在其进化早期经历了`基因融合以获取羧基端GIY-YIG型核酸内切酶结构域(结构域VI) (Abdelnoor等，2006)。该蛋白质也已经获得了结构域I1、III和IV，显示为在所有陆生植物中是非常保守的。这种基因结构的复杂性表明MSHl已经在植物中获得了新的功能。尽管在真核生物世系中鉴定了众多MutS同源物，但没有发现陆生植物以外的基因展示出MSHl的不寻常特征。
[0009]已经使用MSHl无效(EMS和T-DNA插入)突变体(即，mshl突变体)通过MSHlRNAi抑制在拟南芥属(Arabidopsis)中和在其他植物物种中研究了 MSHl功能(Sandhu等,2007 ；Xu等，2011)。从这些研究显露的是RNAi抑制的表型结果在物种之间是非常相似的，包括叶杂色性、细胞质雄性不育(CMS)、降低的生长速率表型、延迟开花或不开花表型和增强的对病原体的易感性。暴露于热(Shedge等，2010)、高光应激(Xu等，2011)和其他环境应激条件(Hruz等，2008)导致显著降低的MSHl转录产物水平。
[0010]最初的MSHl研究表明了其对植物线粒体基因组稳定性的直接影响。拟南芥属中的无效mshl突变体在47个线粒体重复片段处呈现出增强的重组活性，其经过多代形成了显著的基因组重排。MSHl破坏的基因组结果是亚化学计量转移(substoichiometricshifting) (SSS)过程(Arrieta-Montiel等,2009)。SSS活性产生了线粒体基因组的部分的相对拷贝数的剧烈变化，引起存在于受影响的亚基因组上的基因的选择性扩增或抑制。对于这些基因组变化存在表型后果；SSS过程参与细胞质雄性不育的表达(Sandhu等,2007)以及其在自然群体中自发回复成可育的(Janska等，1998 ;Bel Iaoui等，1998 ；Davila等，2011 ;Mackenzie，2011)。实际上，作为植物中的繁殖策略，MSHl可以在雌全异体(gynodioecy)的演化中起作用(McCauley 和 Olson, 2008)。[0011]在克隆和鉴定为MutS同源物之前，MSHl基因首先被G.Redei命名为叶绿体突变基因(CHM )，因为其突变导致似乎由叶绿体功能障碍引起的杂色性和改变的生长(Redeil973)。实际上，MSHl编码双重靶向的蛋白质。MSHl-GFP转基因融合蛋白定位在线粒体和质体类核中(Xu等，2011)。类核是小的、致密的蛋白质-RNA-DNA复合物，其包封细胞器(organellar)基因组。然而，与线粒体不同，在重组普遍的情况中，在mshl突变体中没有观察到增强的叶绿体重复片段介导的重组的证据。可能MSHl破坏影响了质体基因组的复制特征。
[0012]总之，上述参考文献中已经公开的MSHl抑制的效应限于对植物线粒体和质体的作用。
[0013]在植物和动物中，存在支持环境感知和表观遗传改变之间的关联的证据(Bonasio等，Science330,612, 2010)。这些改变的跨世代(trans-generational)遗传性仍然是活跃研究的主题(Youngson 等，Annu.Rev.Genom.Human Genet.9, 233, 2008)。之前的研究已经显示出改变的甲基化模式在多个世代中是高度可遗传的，并且可以结合到变异的定量分析中(Vaughn等,2007 ;Zhang等,2008 ;Johannes等,2009)。较早在拟南芥属中的甲基化变化的研究表明了表观基因组(epigenome)对轮回选择的顺应性，并且还表明了建立新的和稳定的表观遗传状态是可行的(F.Johannes 等，PLoS Genet.5，e 1000530 (2009) ；F.Roux 等，Geneticsl88,1015(2011))。拟南芥metl和ddmt突变体的操纵已经允许形成ep1-RIL群，其显示出新的甲基化模式化的遗传性和表观等位基因分离(epiallelic segregation),强调了植物适应中表观基因组变异的可能影响(F.Roux等，Geneticsl88，1015 (2011))。在自然群体中，发现在拟南芥中检测到的大部分的表观等位基因变异是基因组的基因富集区内的 CpG 甲基化(C.Becker 等，Nature480, 245 (2011), R.J.Schmitz 等，Science334, 369(2011))。
[0014]发明概述
[0015]本文中提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法、用于鉴定植物中可以赋予有用性状的一个或多个改变的染色体位点的方法、用于获得包含可以赋予有用性状的改变的染色体位点的植物的方法、呈现出有用性状的植物、那些植物的部分(包括细胞、叶、茎、花和种子)、使用所述植物和植物部分的方法以及那些植物和植物部分的产品，包括加工的产品如饲料或膳食。
[0016]在特定的实施方案中，提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤:a)抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSHl基因的表达；b)将步骤(a)的亲本植物、步骤(a)的亲本植物的后代、获自步骤(a)的植物细胞的植物或获自步骤(a)的植物细胞的植物的后代与其中MSHl未受抑制的第二植物异型杂交；c)针对至少一种有用的性状筛选获自步骤(b)的异型杂交的后代植物群体，其中所述后代植物群体的一部分表达MSHl ;和d)选择表达MSHl的包含所述性状的后代植物，其中该性状是可遗传的和可逆的。在这些方法的特定实施方案中，所述性状与一个或多个改变的染色体位点相关。在特定的实施方案中，这样的改变的染色体位点可以包含甲基化的位点。在特定的实施方案中，提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法，其包括步骤:a)抑制第一亲本植物或植物细胞中一个或多个MSHl基因的表达；b)将步骤(a)的亲本植物、步骤(a)的亲本植物的后代、获自步骤(a)的植物细胞的植物或获自步骤(a)的植物细胞的植物的后代与其中MSHl未受抑制的第二植物异型杂交；c)针对至少一种有用的性状筛选获自步骤(b)的异型杂交的后代植物群体，其中后代植物群体的一部分表达MSHl ;和(1)选择表达MSHl的包含所述性状的后代植物，其中该性状与一个或多个突变的染色体位点相关。在特定的实施方案中，突变的染色体位点包含核苷酸倒位、插入、删除、置换或其组合。在特定的实施方案中，染色体位点包含可逆的突变。在特定的实施方案中，染色体位点包含不可逆的突变。在前述任一方法的特定实施方案中，所述方法进一步包括从以下植物产生种子的步骤:i)步骤(d)的自交后代植物，ii)步骤(d)的异型杂交的后代植物，或iii)来自步骤(d)的自交和异型杂交的后代植物两者。在特定的实施方案中，所述方法可以进一步包括分析种子或从种子生长的植物中所述性状的存在的步骤。在前述任一方法的特定实施方案中，第一亲本植物或植物细胞包含可以抑制MSHl表达的转基因。在所述方法的特定实施方案中，转基因选自通过产生小抑制RNA (siRNA)、微RNA (miRNA)、共同抑制正义RNA和/或反义RNA抑制MSHl表达的转基因的组。在前述任一方法的特定实施方案中，可以通过将雌性植物与不同的雄性植物杂交来获得第一亲本植物或植物细胞，其中雌性或雄性植物中的至少一个包含抑制亲本植物的内源性MSHl基因表达的转基因，并且其中植物在引入转基因之前是等基因近交系。在前述任一方法的特定实施方案中，在第一亲本植物或植物细胞中的MSHl抑制之前，第一亲本植物或植物细胞与第二亲本植物是等基因的。在前述任一方法的特定实施方案中，性状选自产量、雄性不育、不开花、对生物应激的抗性和对非生物应激的抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱胁迫、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在所述方法的特定实施方案中，生物应激可以选自植物真菌病原体、植物细菌病原体、植物病毒病原体、昆虫、线虫和食草动物及其任意组合。在前述任一方法的特定实施方案中，性状不是由后代植物的线粒体中的亚化学计量转移(SSS)引起的。在前述任一方法的特定实施方案中，性状是雄性不育，并且不是由于后代植物的线粒体中的亚化学计量转移(SSS)引起的。在前述任一方法的特定实施方案中，与未发生MSHl表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞亲本植物等基因的植物相比，步骤(d)中的后代植物或其后代呈现出性状的提高。在前述任一方法的特定实施方案中，植物是作物植物。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自棉花、加拿大油菜(canola)、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草皮草(turf grass)、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、疗菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向曰葵、红花、大豆、草莓、甜菜 、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、棉花、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、莴苣、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属(Jatropha)、亚麻莽属(Camelina)和龙舌兰属(Agave)。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、小麦、水稻、西红柿、烟草、粟和高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱，并且所述性状选自穗长、穗重、干生物量及其组合。
[0017]本文中还提供了呈现出由MSHl抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的植物、植物部分(包括种子)或者植物或种子的产品。在特定的实施方案中，与没有发生MSHl表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物、植物部分(包括种子)或者植物或种子的产品相比，呈现出由MSHl抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的植物种子或其产品呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，呈现出由MSHl抑制导致的染色体位点中的改变和/或突变引起的有用性状的本发明这些植物、种子或产品可以包含由MSHl抑制诱导的一个或多个染色体位点中的一个或多个改变和/或突变。在特定的实施方案中，提供了通过前述任一方法产生的植物或作物植物，其中与未发生MSHl表达抑制但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比，作物植物呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，上述植物或作物植物中的任一种是近交的，并且与一个或多个亲本植物相比，呈现出至少一种有用性状的改善。本文中还提供了获自上述植物或作物植物中的任一种的种子。本文中还提供了来自上述任一植物、作物植物或种子的加工产品，其中所述产品包含可检测量的染色体DNA、线粒体DNA、质体DNA、质体和线粒体DNA或其任意组合。在特定的实施方案中，所述产品可以包含可检测量的包含MSHl抑制诱导的一个或多个染色体位点中的一个或多个改变/或突变的染色体DNA。在上述任一加工产品的特定实施方案中，产品可以是油、粗粉、棉绒(lint)、外壳或滤饼。
[0018]本文中还提供了用于产生种子的方法，其包括从本发明的上述任何植物或作物植物收获种子。在特定的实施方案中，提供了用于产生一批种子的方法，包括将本发明的植物或作物植物群体自交，种植自交的植物，并从其收获种子的步骤。在特定的实施方案中，收获的种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。
[0019]本文中还提供了使用包含任一种改善性状的本发明的上述任一植物或作物植物的方法，其中所述方法包括种植、繁殖或栽培呈现出改善的性状的本发明的植物或作物植物。还提供了获得提高的产量的方法，包括收获本发明上述任一植物或作物植物的任何植物部分，包括种子。在特定的实施方案中，收获的种子或从其获得的植物呈现出至少一种有用性状的改善。
[0020]在特定的实施方案中，提供了用于鉴定植物中可以赋予有用性状的一个或多个改变的染色体位点的方法。在一个实施方案中，提供了包括以下步骤的方法:a.将没有呈现出有用性状的参照植物中的一个或多个染色体区域与呈现出有用性状的测试植物中的一个或多个相应染色体区域相比较，其中测试植物表达MSHl并且获自其中MSHl已经抑制的亲本植物或植物细胞jPb.选择参照植物中不存在的而存在于测试植物中的并且与有用性状相关的一个或多个改变的染色体位点。在特定的实施方案中，改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任何组合。在特定的实施方案中，所述选择包括分离包含改变的染色体位点的植物或后代植物或者获得与改变的染色体位点相关的核酸。在特定的实施方案中，参照植物和测试植物都是获自从其中MSHl已经抑制的亲本植物或植物细胞获得的后代植物群体。在特定的实施方案中，在亲本植物或植物细胞中的MSHl抑制之前，参照植物和亲本植物或植物细胞是等基因的。在特定的实施方案中，有用的性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性和非生物应激抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱应激、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在所述方法的特定的实施方案中，生物应激抗性可以选自植物真菌病原体抗性、植物细菌病原体抗性、植物病毒病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性和食草动物抗性及其任何组合。在特定的实施方案中，有用的性状选自增强的抗倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。本文中还提供了通过前述任一方法鉴定的改变的染色体位点。这样的改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组
口 o
[0021]本文中还提供了包含通过前述任一方法鉴定的任何改变的染色体位点的植物。
[0022]本文中还提供了用于产生呈现出有用性状的植物的方法。在特定的实施方案中，这些方法可以包括步骤:a.将与有用性状相关的染色体修饰引入植物中，其中染色体修饰包括与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变；和b.选择包含该染色体修饰并呈现出有用性状的植物。在特定的实施方案中，该方法可以进一步包括从以下植物产生种子的步骤:i)步骤(b)的选定植物的自交后代植物，ii)步骤(b)的选定植物的异型杂交后代植物，或iii)来自步骤(b)的选定植物的自交和异型杂交后代植物两者。在该方法的特定实施方案中，染色体修饰可以包含改变的染色体位点，并且通过分析与改变的染色体位点相关的染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合的存在来选择植物。在特定的实施方案中，染色体修饰包含转基因或染色体突变，并且通过分析转基因或染色体突变的存在来选择植物。在其他实施方案中，通过分析有用性状的存在来选择植物。在特定的实施方案中，染色体修饰包含改变的染色体位点，并且改变的染色体位点包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。在特定的实施方案中，改变的染色体位点具有包含基因表达降低的遗传效应，并且染色体修饰包含提供基因表达降低的转基因或染色体突变。在其中改变的染色体位点具有包含基因表达降低的遗传效应且染色体修饰包含转基因的特定实施方案中，该转基因通过产生针对该基因的小抑制RN`A(SiRNA)Ji RNA(miRNA)、共同抑制正义RNA和/或反义RNA来降低基因的表达。在特定的实施方案中，改变的染色体位点具有包含基因表达提高的遗传效应，并且染色体修饰包含提供基因表达提高的转基因或染色体突变。在前述任一方法的特定实施方案中，有用性状选自产量、雄性不育、不开花、生物应激抗性和非生物应激抗性。在特定的实施方案中，非生物应激可以选自干旱应激、渗透应激、氮应激、磷应激、矿物质应激、热应激、冷应激和/或光应激。在特定的实施方案中，对非生物应激的抗性可以包括耐旱性、耐高光性、耐热性、耐冷性和耐盐性。在该方法的特定实施方案中，生物应激可以选自植物真菌病原体、植物细菌病原体、植物病毒病原体、昆虫、线虫和食草动物及其任何组合。在该方法的特定实施方案中，有用性状选自增强的抗倒伏性、提高的生长速率、提高的生物量、增强的分蘖、增强的分枝、延迟的开花时间和延迟的衰老。本文中还提供了通过前述任一方法产生的植物。在前述任一方法的特定实施方案中，植物是作物植物。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自棉花、加拿大油菜、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草坪草、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、棉花、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属、亚麻荠属和龙舌兰属。在前述任一方法的特定实施方案中，作物植物选自玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、小麦、水稻、西红柿、烟草、粟和高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱。在前述任一方法的特定实施方案中，作物是高粱，并且所述性状选自穗长、穗重、干生物量及其组合。
[0023]本文中还提供了包含与有用性状相关的染色体修饰或与有用性状相关的染色体改变的植物，植物部分(包括但不限于，种子、叶、茎、根和花)或者植物或植物部分的产品(包括但不限于，种子)。在特定的实施方案中，植物部分可以包含非再生的植物部分或植物部分的非再生部分。在特定的实施方案中，产品可以是加工的产品，其包括，但不限于，获自植物部分的饲料或膳食。在特定的实施方案中，与不包含染色体修饰的植物、植物部分(包括种子)或者植物或种子的产品相比，呈现出由染色体修饰引起的有用性状的植物种子或其产品呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，这样的呈现出有用性状的植物、种子或产品可以包含染色体修饰，其包含与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在特定的实施方案中，这样的呈现出有用性状的植物、植物部分、种子或产品可以包含改变的染色体位点，其包含染色体DNA甲基化状态、与染色体位点相关的组蛋白的翻译后修饰或其任意组合。在特定的实施方案中，包含染色体DNA甲基化状态的改变的染色体位点可以包含在未发生MSHl抑制的植物、植物部分或植物产品中未发现的改变的染色体位点的区别部分。在特定的实施方案中，改变的染色体位点的区别部分可以包含至少约25个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、500个核苷酸或更多个核苷酸的甲基化DNA分子。在特定的实施方案中，提供了通过前述任一方法产生的植物、植物细胞或植物产品，其中与不包含染色体改变但其他方面与第一亲本植物或植物细胞等基因的植物相比，该植物呈现出至少一种有用性状的改善。在特定的实施方案中，上述任何植物是近交的，并且与一个或多个 亲本植物相比，呈现出至少一种有用性状的改善。本文中还提供了从上述任何植物、植物细胞或作物植物获得的种子。本文中还提供了来自上述任何植物、作物植物或植物部分(包括，但不限于种子)的加工产品，其中产品包含可检测量的包含上述任何染色体修饰的染色体DNA，所述染色体修饰包括但不限于，改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在上述任一加工产品的特定实施方案中，产品可以是油、粗粉、棉绒、外壳或滤饼。
[0024]本文中还提供了用于产生种子的方法，包括从本发明上述任一植物或作物植物收获种子。在特定的实施方案中，提供了用于产生一批种子的方法，其包括如下步骤:将本发明的植物或作物植物群体自交、生长自交的植物和从其收获种子。
[0025]本文中还提供了使用包含任一改善的性状的本发明的上述任一植物或作物植物的方法，其中所述方法包括生长、繁殖或栽培呈现出改善的性状的本发明的植物或作物植物。还提供了获得提高产量的方法，包括收获本发明上述任一植物或作物植物的任何植物部分，包括种子。[0026]本文中还提供了任一植物、植物部分或其部分(包括但不限于植物细胞)、非再生的植物部分或其部分(包括但不限于植物细胞)或加工的植物产品在任何方法中的用途。其中本文中提供的植物、植物部分或其部分、非再生植物部分或其部分或加工的植物产品可以采用的方法包括，但不限于，用于育种、用作生物燃料、用作动物饲料、用于人类食品中，以及用于任何工业、食品或饲料制造方法中。
[0027]本文中还提供了呈现出有用性状的种子，和获自呈现出有用性状的改善的种子的植物。在特定的实施方案中，种子可以包含与一个或多个有用性状相关或产生该有用性状的改变的染色体位点。
[0028]在特定的实施方案中，本文中提供的植物、植物部分、非再生的植物部分、植物细胞、非再生的植物细胞、植物产品或加工的植物产品可以包含可检测量的染色体D NA，其包含与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点、提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的转基因或提供与有用性状相关的由MSHl抑制诱导的改变的染色体位点相同的遗传效应的染色体突变。在特定的实施方案中，包含染色体DNA甲基化状态的改变的染色体位点可以包含在未发生MSHl抑制的植物、植物细胞、非再生植物细胞、植物部分、非再生植物部分、植物产品或加工的植物产品中未发现的改变的染色体位点的区别部分。在特定的实施方案中，改变的染色体位点的区别部分可以包含至少约25个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、500个核苷酸或更多个核苷酸的甲基化DNA分子。本文中提供的包含染色体DNA或其区别部分的加工产品包括，但不限于，包含油、粗粉、棉绒、外壳或滤饼的产品。
[0029]附图简述
[0030]说明书中结合的并且形成说明书一部分的【专利附图】

【附图说明】了本发明的特定实施方案。在附图中:
[0031]图1说明了发生MS`Hl抑制的各种植物中观察到的各种表型，如细胞质雄性不育、杂色性和改变的叶绿体发育、降低的生长速率和矮化病、改变的开花时间或不开花、降低的类黄酮生物合成和缺乏花青素、增强的病原体易感性、改变的叶形态和高光耐受性。
[0032]图2说明了已经发生MSHl抑制的拟南芥(上图)、西红柿(中图)和高粱(下图)植物中的叶杂色性。
[0033]图3说明了已经发生了 MSHl抑制的高粱(上图)和西红柿(下图)植物中的矮化。
[0034]图4说明了已经发生了 MSHl抑制的拟南芥中的线粒体DNA重排。
[0035]图5说明了发生了 MSHl抑制的西红柿、烟草和粟植物中观察到的反应性氧物质(ROS)的增加。
[0036]图6说明了用于获得呈现出作为发生MSHl抑制的结果的本文中称为“离散变异”(VD)的各种类型的可遗传表型变异的植物和用于获得可以呈现出“数量变异”或“VQ”和各种有用性状的植物系的示例性的和非限制性的方案。
[0037]图7说明了相对于未发生MSHl抑制的其他方面等基因亲本植物(Col-O)呈现出生物量提高的拟南芥植物系(mshlXCol-0F3)。
[0038]图8说明了源自其中MSHl表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAI1-1l(方形)、GA11-15 (三角形)、GAI1-22 (相对括号)、GAI1-24和GAI1-28 (圆形)中获得的植物高度(以CM计)的分布。野生型参照系是fx WT (菱形)。[0039]图9说明了源自其中MSHl表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAI1-1l(方形)、GA11-15 (三角形)、GAI1-22 (相对括号)、GAI1-24和GAI1-28 (圆形)中获得的穗重(以克计)的分布。野生型参照系是fx WT (菱形)。
[0040]图10说明了源自其中MSHl表达受抑制的植物的异型杂交的不同高粱系GAI1-1l(方形)、GA11-15 (三角形)、GAI1-22 (相对括号)、GAI1-24和GAI1-28 (圆形)中获得的粒产量(以克计)的分布。野生型参照系是fx WT (菱形)。
[0041]图1lA-H说明了拟南芥和高粱中MSHlipi系的增强生长的表型。显示了用于得到高粱和拟南芥ep1-群的转基因和杂交程序。(A)源自杂交Tx430x MSHl-dr的Fl后代的表型。(B)田间生长的印iF2、F3和F4高粱系显示出植物结构和高度的变异。(C)来自Tx430 (左，66gm,8mm^)相对于ep1-F2个体(右，112gm,的穗。(D)来自C中所示的穗的种子产量。(E)田间条件下的MSHl-dr高粱表型。(F)拟南芥的epi_F4系中增强的莲座丛生长的证据。(G)相对于Col-0，显示出提高的植物生物量、莲座丛直径和花茎直径的拟南芥ep1-F4植物。数据显示为来自>6的平均值土SE。(H)开花时的拟南芥epiF4表型。
[0042]图12说明了高粱MSHl-印iF2系中增强的表型变异。对于两个田间定植中生长的三个独立高粱epiF2群体的植物高度和粒产量显示表型分布。通过垂直虚线显示群体平均值。
[0043]图13A、B说明了高粱MSHl-印iF2、F3和F4系中的表型变异。(A)对于植物高度和每穗的粒产量选择的MSHl-印iF4系。对于植物高度，为低植物高度选择系4b-10、10.3和3a.2，为高植物高度选择所有其他系。对于粒产量，为低产量选择了系15.2，为高产量选择所有其他系。(B)框图显示对四个独立群体选择的单个群体反应。水平虚线表示Tx430野生型的平均值。在粒产量的情况中，在温室中进行F3选择。
[0044]图14A-E说明了拟南芥中的MSHlipi增强生长与叶绿体效应有关。(A)线粒体半-补充系 AOX-MSHlx Col-OFl ; (B)质体-补充的 SSU-MSHlx Col_0F2 表现为与 Col-O 野生型相同，(C)SSU-MSHl-衍生的F2系相对于Col-O的莲座丛直径和新鲜生物量；(D)显示出增强生长的线粒体补充的AOX-MSHlx Col_0F2 ； (E) AOX-MSHl-衍生的F2系的莲座丛直径和新鲜生物量显著高于Col-O (P〈0.05)。(F)AOX-MSHlx Col-O的F4代中增强的生长表型。
[0045]图15A-C说明了拟南芥Col-O野生型和MSHl-印iF3系中的全基因组5-甲基-胞嘧啶分布。(A) CG、CHG和CHH甲基化相对于基因组的差异和非差异甲基化的相对分布。注意到基因间区域在条的顶部，接下来的顺序是TE基因、假基因、ncRNA、3’ _UTR、5’ -UTR、内含子和CDS。(B) CG-DMP和CG-N-DMP沿各染色体的分布，与Becker等，Nature480, 245(2011)所用的分析程序平行，数据针对各染色体的最高值标准化。(C)Col-O甲基化分析取自Becker等(同上)的图1c以证明NDMP分布的相似性和DMP的不相似性。
[0046]图16说明了从mshl叶绿体半补率系x Col-O野生型的杂交获得的拟南芥Fl植物。转基因介导的mshl叶绿体半补充恢复了野生型表型。然而,这些半补充系与Col-O的杂交导致Fl中大约25%的植物呈现出不同强度的叶卷缩。这种表型的原因还是未知的，但在衍生的F2群中不再可见。
[0047]图17说明了拟南芥Col_0、epiF4和epiF5系中开花时间的分布。基于最少50株将各个分布绘图。
[0048]图18A、B、C使用重亚硫酸盐测序说明了拟南芥系col-0和mshl_epif3之间的差异甲基化区域的验证。AT3G27150内的DMR区域(MIR2111_5p的靶基因)的比对。预测突出显示的G(即，图中加下划线的)在Col-O中是未甲基化的，和在MSHl-印iF3中是甲基化的。序列表中提供了图 18A、B 和 C 的序列如下:AT3G27150(SEQ ID NO: 27)，ColO-MIR2_2 (SEQ IDN0:28), ColO-MIR2-3(SEQ ID NO:29)，ColO-MIR2_4(SEQ ID NO:30)，ColO-MIR2_5(SEQ IDN0:31), ColO-MIR2-6(SEQ ID NO:32)，Col0-MIR2_10(SEQ ID NO:33)，ColO-MIR2_ll(SEQID NO:34)，ColO-MIR2-12 (SEQ ID NO:35)，CoI 0-M I R2 - 26 ( SEQ IDN0:36),ColO-MIR2-27(SEQ ID NO:37)，ColO-MIR2_28(SEQ ID NO:38)，ColO-MIR2_29(SEQID N0:39),F3-Mir2-1(SEQ ID N0:40)，F3_Mir2_2(SEQ ID NO:41)，F3_Mir2_4(SEQ IDN0:42), F3-Mir2-5(SEQ ID NO:43)，F3_Mir2_7(SEQ ID N0:44)，F3_Mir2_ll(SEQ IDN0:45), F3-Mir2-12(SEQ ID N0:46)，F3_Mir2_15(SEQ ID NO:47)，F3_Mir2_16 (SEQ IDN0:48),F3-Mir2-27(SEQ ID NO:49)和 F3_Mir2_28(SEQ ID NO:50)。
[0049]详细说明
[0050]1.定义
[0051]如本文中所用的，短语“染色体修饰”指的是以下的任一种:a) “多个改变的染色体位点”和“改变的染色体位点” ;b) “多个突变的染色体位点”、“突变的染色体位点”、“多个染色体突变”和“染色体突变”;或c)转基因。
[0052]如本文中所用的，短语“多个改变的染色体位点”(复数)或“改变的染色体位点”(单数)指的是相对于相应的亲本染色体位点已经发生了可遗传和可逆的表观遗传变化的染色体的部分。在改变的染色`体位点中的可遗传和可逆的遗传变化包括，但不限于，染色体DNA的甲基化，并且特别地，胞嘧啶残基甲基化成5-甲基胞嘧啶残基，和/或组蛋白的翻译后修饰，并且特别地，包括，但不限于，乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化和SUMO化(sumoylation)(小泛素样修饰蛋白的共价连接)的组蛋白修饰。如本文中所用的，“染色体位点”指的是位于细胞核中的染色体中的位点。
[0053]如本文中所用的，术语“包含”意思是“包括但不限于”。
[0054]如本文中所用的，短语“多个突变的染色体位点”(复数)(复数)，“突变的染色体位点”(单数)、“多个染色体突变”和“染色体突变”指的是相对于相应亲本染色体位点中的核苷酸序列已经发生了核苷酸序列的可遗传的遗传改变的染色体的部分。突变的染色体位点包含，包括但不限于，核苷酸序列倒位、插入、删除、置换或其组合的突变。在特定的实施方案中，突变的染色体位点可以包含可逆的突变。在这种情况中，染色体中的可逆突变可以包括，但不限于，转座因子的插入、缺失的转座因子和特定的倒位。在特定的实施方案中，染色体位点包含不可逆的突变。在这种情况中，染色体中的不可逆突变可以包括，但不限于，删除。
[0055]如本文中所用的，术语“离散变异”或“VD”指的是明显不同的、可遗传的表型变异，其包括以任意组合或分离地可观察到的雄性不育、矮化、杂色性和/或延迟的开花时间的性状。
[0056]如本文中所用的，术语“MSH-dr”指的是发生MSHl抑制的植物中观察到的植物分蘖、高度、节间伸长和气孔密度的变化。[0057]如本文中所用的，短语“数量变异”或“VQ”指的是源自其中MSHl表达受抑制并且呈现出与其他植物的离散变异的植物的异型杂交的单个后代系中观察到的表型变异。
[0058]如本文中所用的，术语“微RNA”或“miRNA”指的是与植物中发生的天然miRNA以及与人工miRNA基本上相似的miRNA两者。在特定的实施方案中，转基因可以用于产生与植物中发生的天然miRNA或人工miRNA基本上相似的miRNA。
[0059]如本文中所用的，短语“获得与改变的染色体位点相关的核酸”指的是用于从未改变的共价连接的核酸物理分离或富集与改变的染色体位点相关的核酸的任何方法。在这种情况中，核酸不必定包含改变(即，如甲基化)，但至少包含一个或多个改变的核苷酸碱基。因此，与改变的染色体位点相关的核酸可以通过如下方法获得，包括但不限于，分子克隆、PCR或基于序列数据的直接合成。
[0060]如本文中所用的短语“可操作地连接”指的是核酸序列的接合，以使得一个序列可以提供与连接的序列所需的功能。在启动子的情况中，“可操作地连接”意思是启动子与目标序列连接以使得该目标序列的转录受该启动子控制和调节。当目标序列编码蛋白时和当该蛋白的表达是所需的时候，“可操作地连接”意思是启动子以所得到的转录产物将有效翻译的方式连接该序列。如果启动子与编码序列的连接是转录融合且编码蛋白的表达是所需的，进行连接以使得所得到的转录产物中的第一个翻译启动密码子是编码序列的启动密码子。或者，如 果启动子与编码序列的连接是翻译融合且编码蛋白的表达是所需的，则进行连接以使得与启动子相关的5’未翻译序列中所含的第一个翻译启动密码子的连接使得所得到的翻译产物与编码所需蛋白的翻译开放阅读框同框。可以可操作地连接的核酸序列包括，但不限于，提供基因表达功能的序列(即，基因表达元件，如启动子、5’未翻译区、内含子、蛋白编码区、3’未翻译区、多腺苷酸化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即，位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即，抗生素抗性标记、生物合成基因)、提供可评分标记功能的序列(即，报告基因)、在体外或体内有助于序列操作的序列(即，多接头序列、位点特异性重组序列、同源重组序列)和提供复制功能的序列(即，细菌复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
[0061]如本文中所用的，短语“抑制MSHl基因的表达”指的是提供植物或植物细胞中降低水平的功能性MSHl活性的任何遗传或环境操作，所述降低的水平是相对于未发生这种遗传或环境操作的其他方面等基因的植物或植物细胞中发生的功能性MSHl活性的水平。
[0062]如本文中所用的，在染色体修饰的情况中，术语“转基因”指的是来自已经整合至宿主细胞中稳定维持的染色体中的异源来源的任何DNA。在该情况中，DNA的异源来源包括，但不限于，来自不同于宿主细胞生物体的生物体的DNA、不同于宿主细胞物种的物种、作为不同品种或相同品种的相同物种的品种、已经发生了任何体外修饰的DNA、重组DNA或其任意组合。
[0063]如本文中所用的，术语“非再生的”指的是不能产生完整植物的植物部分或植物细胞。
[0064]I1.描述概览
[0065]提供了用于引入产生呈现出有用性状的植物的可遗传和表观遗传和/或遗传的变异的方法，以及通过这些方法可获得的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和加工的植物产品。在特定的实施方案中，本文中提供的方法可以用于将表观遗传和/或遗传的变异引入变种或非杂种植物中，其产生有用的性状以及有用的植物、植物部分(包括但不限于种子)、植物细胞和加工的植物产品(其呈现出、携带或另外反映出由所述有用性状赋予的益处)。在其他实施方案中，本文中提供的方法可以用于将表观遗传和/或遗传变异引入也易发生杂交的植物中。
[0066]在大部分实施方案中，本文中提供的方法涉及抑制植物MSHl基因的表达，恢复功能性植物MSHl基因的表达并且选择呈现出一种或多种有用性状的后代植物。在特定的实施方案中，这些有用的性状与已经发生可遗传和可逆的表观遗传改变的一个或多个改变的染色体位点、与已经发生可遗传的遗传改变的一个或多个突变的染色体位点或与其组合相关。
[0067]II1.植物或植物细胞中MSHl表达的抑制
[0068]总地来说，本文中提供的用于将表观遗传和/或遗传变异引入植物中的方法只需要简单地将MSHl表达抑制一段足以引入该变异的时间。因此，可以使用各种MSHl抑制方法来实施本文中提供的方法，并且所述方法不限于特定的抑制技术。
[0069]由于MSHl基因和MSHl基因删除的效应表现为在植物中是高度保守的，因此进一步预期本文中提供的方法可以用于多种不同的植物或植物细胞。本文中提供了来自拟南芥(Arabidopsis)、大豆、玉米(Zea mays)、高粱、水稻、短柄草(Brachypodium)、葡萄(VitisVinifera)、棉花和黄瓜的MSHl基因或其片段的序列。在特定的实施方案中，这样的基因可以直接用于同源或异源的植物物种中以在同源或异源植物物种中提供内源性MSHl基因的抑制。Sandhu等，2007提供了非限制性的示例性证明，其中来自一个物种的MSHl基因显示出在同源和异源物种中抑制内源性MSHl基因是有效的，其中提供西红柿MSHl序列的MSHl抑制RNA (RNAi)的转基因显示出抑制西红柿和烟草两者的内源性MSHl基因。提供玉米MSHl序列的MSHl抑制RNA `(RNAi)的转基因可以抑制粟、高粱和玉米的内源性MSHl基因。可以通过各种技术获得来自其他植物的MSHl基因并用于抑制那些植物中的相应MSHl基因的表达或不同植物中的MSHl基因，所述其他植物包括，但不限于，棉花、加拿大油菜、小麦、大麦、亚麻、燕麦、黑麦、草坪草、甘蔗、苜蓿、香蕉、花茎甘蓝、卷心菜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、疗菜、柑桔、棉花、萌芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、白杨、松树、向日葵、红花、草莓、甜菜、红薯、烟草、木薯、花椰菜、芹菜、柑桔、葫芦、桉树、大蒜、葡萄、洋葱、生菜、豌豆、花生、胡椒、白杨、松树、向日葵、红花、大豆、草莓、甜菜、烟草、麻风树属、亚麻荠属和龙舌兰属。用于获得各种植物的MSHl基因的方法包括，但不限于如下的技术，如:i)搜寻包含来自植物物种的序列的氨基酸和/或核苷酸序列数据库以通过序列同一性比较鉴定MSHl基因；ii)通过从基因组序列的PCR或表达的RNA的RT-PCR克隆MSHl基因；iii)使用PCR和/或基于杂交的技术从基因组或cDNA文库克隆MSHl基因；iv)在针对MSHl蛋白的抗体用于鉴定含MSHl克隆的情况中，从表达文库克隆MSHl基因；v)通过mshl突变体或MSHl缺陷植物的补充来克隆MSHl基因；或vi) (i)、(ii)、(iii)和/或(V)的任意组合。可以通过以下方法来容易地确定或证实来自植物的MSHl基因的恢复:构建提供基因抑制的植物转化载体、用载体转化植物并且确定用载体转化的植物是否呈现出MSHl表达受抑制时通常在各种植物物种中观察到的特征性反应，包括叶杂色性、细胞质雄性不育(CMS)、降低的生长速率表型、延迟开花或不开花表型和增强的对病原体的易感性。
[0070]在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSHl基因或其片段将具有与本文中提供的一个或多个MSHl基因或其片段(包括但不限于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3-10和 SEQ ID NO: 14)具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或 100%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSHl基因或其片段编码MSHl蛋白或其部分，所述MSHl蛋白或其部分将具有与本文中提供的一个或多个MSHl蛋白(包括但不限于SEQ ID NO: 2，和SEQ ID NO: 3-10编码的MSHl蛋白)具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSHl基因或其片段将具有与本文中提供的一个或多个MSHl基因、其片段、其直系同源物(ortholog)或其同系物(包括但不限于SEQ ID N0:51和SEQ IDN0:52)具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在特定的实施方案中，本文中提供的方法中所用的MSHl基因或其片段编码将具有与本文中提供的一个或多个MSHl蛋白或MSHl同系物(包括但不限于SEQ ID N0:51和SEQ IDNO: 52编码的蛋白)具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的MSHl蛋白或其片段。
[0071 ] 来自本文中提供的那些以外的植物的MSHl基因也可以通过表征许多MSHl基因的编码的DNA结合结构域(结构域I)、ATP酶结构域(结构域V)和羧基-端GIY-YIG型核酸内切酶结构域(结构域VI)来鉴定(Abdelnoor等,2006)。在这点上,预期18至20个核苷酸的MSHl核酸片段，但更优选21个核苷酸或更多个核苷酸的MSHl核酸片段，可以用于有效抑制内源性MSHl基因。在特定的实施方案中，至少18、19、20或21个核苷酸至约50、100、200,500或更多个核苷酸的MSHl核酸片段可以用于实现内源性MSHl基因的抑制。
[0072]在特定的实施方案中，用转基因实现植物中的MSHl抑制。可以用于抑制MSHl表达的转基因包括，但不限于，产生提供内源性MSHl基因抑制的MSHl的显性负突变体的转基因、小抑制RNA (siRNA)、微RNA (miRNA)、共同抑制正义RNA和/或反义RNA。通过引用全部并入本文中的描述了通过 转基因抑制内源性植物基因的US专利包括US7，109，393、US5, 231，020 和 US5, 283，184 (共同抑制方法);及 US5, 107，065 和 US5, 759，829 (反义方法)。在特定的实施方案中，特别设计来产生与MSHl基因同源的双链RNA (dsRNA)分子的转基因可以用于降低内源性MSHl基因的表达。在这样的实施方案中，可以通过间隔序列将dsRNA的正义链序列与反义序列隔开，间隔序列优选是促进dsRNA (双链RNA)分子形成的序列。这样的间隔序列的实例包括但不限于，Wesley等，Plant J.,27 (6):581-90 (2001)和 Hamilton 等，Plant J., 15:737-746 (1998)中所列的那些。Sandhu 等，2007 已经描述了显示出在烟草和西红柿中提供MSHl抑制的一个示例性和非限制性的载体，其中内含子序列分隔了 MSHl序列的正义和反义链。
[0073]在特定的实施方案中，提供MSHl抑制的转基因可以包含提供可操作地连接的MSHl抑制序列的诱导或下调的受调控启动子。在这种情况中，MSHl抑制序列可以包括，但不限于，提供植物的内源性MSHl基因抑制的MSHl显性负突变体、小抑制RNA (siRNA)、微RNA (miRNA)、共同抑制正义RNA和/或反义RNA。这样的启动子可以通过提供或保留诱导物或下调子在受控的时间段内提供MSHl的抑制。诱导型启动子包括，但不限于，PR-1a启动子(US专利申请
【发明者】S·A·麦肯齐, R·德拉罗萨桑塔玛里亚 申请人:内布拉斯加大学评议会