具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法
【专利摘要】本申请提供了通过增加编码低硫上调的多肽(LSU)的核酸在植物中的表达而增强产量相关性状的方法。本发明还提供了具有增加了编码LSU多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于相应的对照植物而言具有增强的产量相关性状。本发明还提供可用于增加植物的产量相关性状的LSU编码核酸以及包含该核酸的构建体。
【专利说明】具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法[0001]本发明一般地涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码POI(目的蛋白质)多肽的核酸在植物中的表达而增强一种或多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有调节了编码POI多肽之核酸的表达的植物，所述植物相对于相应的对照植物而言具有一种或多种增强的产量相关性状。本发明还提供可用于本发明方法的构建体。
[0002]持续增加的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改进手段利用选择性育种技术来鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术典型地耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，这可能不总是导致从亲代植物中传递所希望的性状。分子生物学进展已经允许人类改进动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(典型地处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改进性状的作物或植物的能力。
[0003]性状是增加的产量。产量通常定义为作物产生的可测量的经济价值。这可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等等。根发育、养分摄入量、胁迫耐性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。
[0004]种子产量是重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、低芥酸油菜(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消耗，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消耗。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的苗和根的来源)和胚乳(萌发和幼苗早期生长过程中胚生长的养分来源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存性高分子，以充盈籽粒。
[0005]对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改善早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻栽培品种两者上的一个重要目标。长的根在水栽稻中对于正确土壤固着是重要的。在将稻直接播种至涝田的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下,较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好的出苗是重要的。人工改造植物内早期萌发势的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带生殖质(Corn Belt germplasm)的玉米(Zeamayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。
[0006]另一重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等，Planta218，1-14，2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。改进植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民具有极大的经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的地域上栽培作物。
[0007]因此可通过优化上述因素之一来增加作物产量。
[0008]取决于最终用途，对某些产量性状的修饰可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是期望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，在种子参数方面的增加可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。
[0009]现已发现可以通过在植物中调节编码POI (目的蛋白质)多肽的核酸在植物中的表达而改进植物中的多种产量相关性状。
[0010]背景
[0011]在硫缺乏的条件下，许多植物基因显示出增加的表达。在文献中已经报道，这些基因中的两个，LSUl和LSU2(低硫上调的基因；也称为对低硫应答的基因)在硫缺乏条件下是上调的(Lewandowska M, Wawrzynska A, Moniuszko G, Lukomska J, Zientara K,Piecho M，Hodurek P，Zhukov I，Liszewska F，Nikiforova V，Sirko A.A contributionto identification of novel regulators of plant response to sulfur deficiency:characteristics of a tobacco gene UP9C， its protein product and the effects ofUP9C silencing.Mol Plant.2010Mar ；3(2):347-60 ；Maruyama-Nakashita AiNakamura Y，Watanabe-Takahashi A，Inoue E，Yamaya T，Takahashi H.1dentification of a novelcis—acting element conferring sulphur deficiency response in Arabidopsisroots.Plant J.2005May ；42 (3):305-14 ；Nikiforova VJ, Daub CO，Hesse H，WillmitzerL，Hoefgen R.1n tegrative gene-metabolite network with implemented causalitydeciphers informational fluxes of sulphur stress response.J Exp Bot.2005Jul ；56(417):1887-96)。
[0012]At5g24660 (LSU2)在拟南芥属(Arabidopsis)中属于称为 LSU1-4 (分别地，At3g49580、At5g24660、At3g49570和At5g24655)的4个基因的小家族。在其他物种中存在这些基因的同源物。已经在烟草中鉴定了 6个成员(UP9A至UP9F)，其中之一，UP9C已经显不出参与植物对硫缺乏应答的调节(Lewandowska M，Wawrzynska A，Moniuszko G，LukomskaJ，Zientara K，Piecho M，Hodurek P，Zhukov I，Liszewska F，Nikiforova V，Sirko A.Acontribution to identification of novel regulators of plant response to sulfurdeficiency-characteristics of a tobacco gene UP9C， its protein product and theeffects of UP9C silencing.Mol Plant.2010Mar ；3(2):347-60)。在硫缺乏条件下，与亲本株系(对照株系)比较，下调烟草中UP9C基因表达，导致转基因株系的成熟叶中更低水平的谷胱甘肽。此外，在硫缺乏条件下观察到了硫醇(含硫代谢物)水平的降低的缺失。
[0013]已经更详细地研究了烟草同源物UP9C的序列(Lewandowska M，Wawrzynska A，Moniuszko G， Lukomska J， Zientara K， Piecho M， Hodurek P， Zhukov I， Liszewska F，Nikiforova V， Sirko A.A contribution to identification of novel regulators ofplant response to sulfur deficiency !characteristics of a tobacco gene UP9C，its protein product and the effects of UP9C silencing.Mol Plant.2010Mar ；3(2):347-60)。在其序列中发现了卷曲螺旋区(在残基24和63之间)和核定位信号(残基16至33)。通过分析UPC9-EYFP融合构建体确认UPC9在核中的亚细胞定位。进行了 Y2H筛选，导致了 17个UPC9的可能蛋白质配偶体的鉴定(Lewandowska M，Wawrzynska AiMoniuszkoG，Lukomska J，Zientara K，Piecho M，Hodurek P，Zhukov I,Liszewska F，Nikiforova V，
【权利要求】
1.用于在植物中相对于对照植物增强一种或多种产量相关性状的方法，包括增加编码LSU多肽的核酸在植物中的表达，其中所述LSU多肽由包含选自下述的核酸分子的核酸分子编码:(i).SEQ ID NO:1、33、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35 或 47 (的任意之一)所表不的核酸；(ii).SEQ ID NO: 1、33、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35 或 47 (的任意之一)所表示的核酸的互补序列；(iii).编码SEQ ID NO:2、34、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36 或48(的任意之一)所表示的多肽的核酸，优选由于遗传密码的简并性，所述分离的核酸可以来源于 SEQ ID NO:2、34、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36 或 48(的任意之一)所表不的多肽序列，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(iv).核酸，所述核酸以递增的优先顺序与SEQID NO:1、33、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、35 或 47 的任一所述核酸序列具有至少 30 % ,31 % ,32 % ,33 %,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41 %,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状； (v).第一核酸分子，其在严格条件下与(ii)的第二核酸分子杂交，并优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(vi).编码多肽的核酸，所述多肽以递增的优先顺序与SEQID NO:2、34、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36或48(的任意之一)所表示的氨基酸序列具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95^^96%、97 或99%的序列同一性，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(vii).编码多肽的核酸，其中所述LSU多肽在其来源物种中的表达在硫缺乏的条件下得到增加，并且其中所述LSU多肽具有小于7.0的等电点(pi)且是等于或者小于125个氨基酸的短长度的成熟蛋白质，并优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；或(viii).包含上文(i)至(vii)的特征的任意组合的核酸。
2.用于在植物中相对于对照植物增强一种或多种产量相关性状的方法，包括增加编码LSU多肽的核酸在植物中的表达，其中所述LSU多肽是靶向胞质和/或核的小于15000Da的小型酸性蛋白质。
3.权利要求1或2的任一项的方法，其中所述LSU多肽由权利要求1的(i)至(viii)之一中定义的核酸编码，并且所述LSU多肽是小于15000Da的小型酸性蛋白质，当用InterProScan 软件(Zdobnov E.M.和 Apweiler R.: " InterProScan-an integrationplatform for the signature-recognition methods in InterPr0." ；Bioinformatics,.2001,17(9):847-8 ;InterPro 数据库，Release36.0，2012 年 2 月 23 日)分析时，所述 LSU多肽没有可检测的特征。
4.权利要求1至3的任一项的方法，其中所述增加的表达通过在植物中引入和表达编码所述LSU多肽的所述核酸而实现。
5.权利要求1至4的任一项的方法，其中所述LSU多肽包含 a.全部以下基序:基序 4 (SEQ ID NO:45):M[KR][SKR]E[ML][LQ][QR][LA]W[RE]R[TL][QVR]VAEEAEERLCSQL[AG]ELE[AV]E[SA][LV] [SD] [QH]ARD[YC]H[SDA]RI [VIL] [FS]L[MV] [DN] [QE]基序 5 (SEQ ID NO:46):TV [K 或无][ATD] [AG] [ES]E[VEM] [DEM] [E 或无]L[RK] [RK] [RK] N [GE] E [LM] E [KR] [EA][VL]基序 I (SEQ ID NO:37):M[KR][KR]E[ML][LQ]Q[LA]W[RE]R[TL][QVR]VAEEAEERLCSQL[AG]ELE[AV]E[SA][LV]DQARDYH[SD]RI[VIL][FS]L[MV][DN][QE]基序 2 (SEQ ID NO:38):TV [AT] A [ES] E [VE] [DE]EL[RK] [RK] [RK] N [GE] E [LM] E [KR] [EA] [VL]基序 3 (SEQ ID NO:39):[VM][AT]EEAEE[RQHS]LCSQL[AG]ELE[AV]E或b.a下所定义的基序I至5中任意4个、3个或2个；或c.基序3和基序2或基序I或者全部三个基序I和基序2和基序3;或d.a下所定义的基序3或基序I或基序2或基序4或基序5。
6.权利要求1至5的任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状包含相对于对照植物增加的生物量和/或增加的种子产量，并且优选包含相对于对照植物增加的地上生物量和/或增加的糖产量。
7.权利要求1-6的任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
8.权利要求1至6的任一项的方法,其中所述一种或多种增强的产量相关性状在环境胁迫条件下，优选在温度胁迫、盐胁迫、氮缺乏和/或干旱条件下获得。
9.权利要求1至8的任一项的方法，其中所述编码LSU多肽的核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自十字花科(Brassicaceae),更优选来自拟南芥属(Arabidopsis),最优选来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
10.权利要求1至8的任一项的方法，其中所述核酸分子或所述多肽分别是植物来源的，优选来自双子叶植物，还优选来自杨柳科(Salicaceae),更优选来自杨属(Populus),最优选来自毛果杨(Populus trichocarpa)。
11.权利要求1至10的任一项的方法，其中所述编码LSU多肽的核酸编码表A中列出的任意一种所述多肽或者是该核酸的一部分，或者是能与该核酸的互补序列杂交的核酸。
12.权利要求1至10的任一项的方法，其中所述核酸序列编码表A中给出的任一所述多肽的直向同源物或旁系同源物。
13.权利要求1至12的任一项的方法，其中所述核酸与组成型启动子，优选与中等强度的组成型启动子，优选与植物启动子，更优选与G0S2启动子，最优选与来自稻的G0S2启动子有效连接。
14.核酸分子，所述核酸分子选自:(i)SEQID NO:1或33，优选SEQ ID NO:1所表示的核酸；(ii)SEQID NO:1或33，优选SEQ ID NO:1所表示的核酸的互补序列；(iii)编码LSU多肽的核酸，所述多肽以递增的优先顺序与SEQIDNO:2或34，优选与SEQ ID NO:2所表示的所述氨基酸序列具有至少40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%, 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或者备选地包含一个或多个基序，所述基序以递增的优先顺序与SEQ ID NO:37、38、39、45或46中，优选与SEQID NO:37、38或39，更优选与SEQ ID N0:39中给出的任何一个或多个所述基序具有小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个或O个替换，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(iv)编码LSU多肽的核酸，所述多肽以递增的优先顺序与SEQID NO:2或34，优选与SEQ ID勵:2所表示的所述氨基酸序列具有至少40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，并另外地包含一个或多个基序，所述基序以递增的优先顺序与SEQ ID NO:37,38、39、45或46中，优选与SEQID NO:37、38或39，更优选与SEQ ID N0:39中给出的任何一个或多个所述基序具有小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个或O个替换，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；和(V)核酸分子，所述核酸分子在闻严格杂交条件下与(i)至(iii)的核酸分子杂交并且优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状。
15.多肽，所述多肽选自:⑴SEQ ID NO:2或34所表示的氨基酸；(ii)氨基酸序列，其以递增的优先顺序与SEQ ID NO:2或34，优选与SEQ ID NO:2所表示的所述氨基酸序列具有至少 40%,45%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性，或者备选地包含一个或多个所述基序，所述基序以递增的优选顺序与SEQ ID NO:37,38,39,45或46中，优选与SEQ ID NO:37、38或39，更优选与SEQ ID NO:39中给出的任何一个或多个基序具有小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个或O个替换，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(iii)氨基酸序列，其以递增的优先顺序与SEQID NO:2或34，优选与SEQ ID NO:2所表示的所述氨基酸序列具有至少40%、45%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或者另外地包含一个或多个基序，所述基序以递增的优选顺序与SEQ ID NO:37,38,39,45或46中，优选与SEQ ID NO:37、38或39，更优选与SEQ ID NO:39中给出的任何一个或多个所述基序小于10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、I个或O个替换，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状；(iv)上文(i)或(ii)给出的任何氨基酸序列的衍生物，并且还优选相对于对照植物赋予一种或多种增强的产量相关性状。
16.通过权利要求1至13的任一项的方法获得的植物、其植物部分，包括种子或植物细胞，其中所述植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求14中所定义的编码LSU多肽的重组核酸或如权利要求1、2、5、9至12的任一项中所定义的编码LSU多肽的重组核酸，或者包含权利要求15所定义的LSU多肽或权利要求2、3、9或10中任一项中所定义的LSU多肽。
17.过表达构建体，包含:(i)权利要求1、2、5、9 至12或14的任一项中所定义的编码LSU多肽的核酸或者编码权利要求15所定义的LSU多肽的核酸或权利要求2、3、9或10中任一项中所定义的核酸；(ii)能驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地(iii)转录终止序列。
18.权利要求17的过表达构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选中等强度的组成型启动子，优选植物启动子，更优选G0S2启动子，最优选来自稻的G0S2启动子。
19.用权利要求17或18的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
20.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，和更优选相对于对照植物增加的种子产量和/或增加的生物量，所述方法包括:(i)在植物细胞或植物中引入和表达权利要求14或权利要求1、2、5、9至12的任一项中所定义的编码LSU多肽的核酸；其中通过编码LSU多肽的所述核酸的表达，增加所述编码的LSU多肽的丰度，和(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞或植物。
21.转基因植物或来源于所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物在环境胁迫条件和/或非胁迫条件下相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于对照植物增加的产量，和更优选增加的种子产量和/或增加的生物量，所述转基因植物产生自权利要求14或权利要求1、2、5、9至12的任一项中所定义的编码LSU多肽的核酸的增加表达。
22.权利要求16、19或21的转基因植物或其来源的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物，例如双子叶植物如大豆、棉花、油菜包括低芥酸油菜、甜菜、糖萝卜或苜蓿；或者单子叶植物如甘蔗；或谷物如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、野小麦、德国小麦、一粒系小麦、teff、高粱和燕麦。
23.权利要求16、19、21或22的任一项的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是地上生物量，优选苗生物量、甜菜块根生物量和/或种子。
24.来源于权利要求16、19、21或22的植物和/或来源于权利要求23的植物的可收获部分的产品。
25.权利要求14或权利要求1、2、5、9至12的任一项中所定义的编码LSU多肽的核酸或者权利要求17或18的构建体或者权利要求15或权利要求2、3、9或10中任一项中所定义的LSU多肽的用途，用于在植物中相对于对照植物在环境胁迫条件和/或非胁迫条件下增强一种或多种产量相关性状，优选在植物中相对于对照植物用于增加产量，和更优选用于增加种子产量和/或用于增加生物量。
26.用于产生产品的方法，所述方法包括培养权利要求16、19、21、22或24的任一项的植物，并从或通过(i)所述植物；或(ii)所述植物的一部分，包括种子 产生所述产品的步骤。
27.重组染色体DNA，所述重组染色体DNA包含权利要求16或17的构建体。
28.包含于植物细胞中的权利要求16或17的表达构建体或者权利要求25的重组染色体 DNA。
【文档编号】C12N15/63GK103533827SQ201280022678
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年5月9日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】C·勒佐, J·鲁斯诺瓦 申请人:巴斯夫植物科学有限公司