使用人工microrna以沉默基因家族的方法和组合物的制作方法

使用人工microrna以沉默基因家族的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了方法和组合物使得单个microRNA(niRNA)降低了相同蛋白和／或基因家族的至少两个成员的表达水平。虽然单个21碱基对niRNA能导致多种mRNA发生裂解，整个基因家族不能被沉默，除非该基因家族在也能被单个miRNA裂解的21个碱基对区域内共有相近的同一性。在某些实施例中，给定蛋白和／或基因家族的所有成员可为本文所公开的miRNA表达构建体所抑制，即使它们在也能以miRNA起作用的21碱基对区域内不具有相近的同一性。此类方法和组合物采用了miRNA表达构建体，其具有结构使得由所述构建体产生的丰度最高的miRNA形式为22-核苷酸的miRNA。由miRNA表达构建体产生的22-核苷酸的miRNA进而不仅降低了miRNA靶序列的表达水平，也降低了作为靶序列的来自相同蛋白和／或基因家族的至少一个其他序列的表达水平。
【专利说明】使用人工MICRORNA以沉默基因家族的方法和组合物
【技术领域】
[0001]本发明的领域一般涉及植物分子生物学。更具体地，其涉及降低植物蛋白和/或基因家族中至少两个成员的表达水平的构建体和方法 。
【背景技术】
[0002]多种真核生物体，包括植物、动物和真菌，都进化了多个RNA沉默途径以保护其细胞和基因组、抵御核酸诸如病毒或转座子的入侵，并在发育过程中或响应于外界刺激调控基因表达(综述见于 Baulcombe (2005) Trends Biochem Sci30:290-293 ;Meins 等人(2005) Annu Rev Cell Dev Biol21:297-318)。在植物中，已显示RNA沉默途径会控制多种发育过程，包括开花时间、叶片形态、器官极性、花卉形态以及根的发育(综述见于Mallory和 Vaucheret (2006)Nat Genet38:S31-36)。所有 RNA 沉默系统涉及由类 RNA 酶 III 的酶，在植物中被称为Dicer或类Dicer，将双链RNA(dsRNA)加工为21至25核苷酸(nt)的小 RNA(Bernstein 等人(2001)Nature409:363-366 ；Xie 等人(2004)PLoS Biol2E104:0642-0652 ;Xie 等人(2005)Proc NatlAcad SciUSA102:12984-12989 ;Dunoyer 等人，(2005)Nat Genet37:1356-1360)。这些小RNA被掺入至沉默效应子复合物中，其包含Argonaute 蛋白(综述见于 Meister 和 Tuschl (2004)Nature431:343-349)。
[0003]在拟南芥革巴向病毒mRNA 序列(Niu 等人(2006) Nature Biotechnology24:1420-1428)或内源性基因(Schwab 等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)中已经描述了人工micr0RNA(amiRNA)。为了改变沉默的空间模式，可在不同启动子下表达amiRNA构建体(Schwab 等人(2006)Plant Celll8:1121-1133)。人工 miRNA 替换了 mieroRNA 及其在miRNA前体主链中的互补星序列，并替代靶向被沉默的mRNA的序列。由内源性的miRNA导致的沉默可见于多种空间上的、时间上的、和发育表达上的模式中(Parizotto等人(2007)Genes Devl8:2237-2242 ;Alvarez 等人(2006)Plant Celll8:1134-51)。需要允许人工miRNA被构建成既捕获又扩展沉默模式中的多样性和特异性的方法和组合物。

【发明内容】

[0004]提供了允许单个microRNA(miRNA)来降低相同蛋白和/或基因家族的至少两个成员的表达水平的方法和组合物。虽然单个21碱基对miRNA能导致多种mRNA物类发生裂解，但不能沉默整个基因家族，除非该基因家族在也能被单个miRNA裂解的21个碱基对区域内共有相近的同一性。在某些实施例中，给定蛋白和/或基因家族的所有成员可被本文所公开的miRNA表达构建体所抑制，即使它们在也能作为miRNA起作用的21碱基对区域内不共有相近的同一性。此类方法和组合物采用了 miRNA表达构建体，其具有结构使得由构建体产生的丰度最高的miRNA形式为22-核苷酸的miRNA。由miRNA表达构建体产生的22-核苷酸的miRNA进而不仅降低了 miRNA靶序列的表达水平，也降低了作为靶序列的来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列的表达水平。【专利附图】

【附图说明】
[0005]图1是质粒PHP46272的图表。
[0006]图2是质粒PHP46271的图表。 [0007]图3是显示GM-159FAD2-1B(22)同时沉默fad2_l和2-2 (65%阳性)的图。
[0008]图4 是显示 GM-159FAD2-1B(21)仅沉默 fad2_l (26%阳性)的图。
[0009]图5是PHP23576质粒的图表。
【具体实施方式】
[0010]现将结合附图在下文中更全面地描述本发明，其中示出了本发明的一些而非全部实施例。实际上，这些发明可以许多不同的形式来体现，并且不应理解为受本文所示实施例的限制；相反，提供这些实施例以使本公开满足适用的法律要求。类似的数字在全文中指代类似的元件。
[0011]这些发明所属领域的技术人员应当理解，本文所示发明的许多修改形式和其他实施例具有前述说明和相关附图中所示教导的有益效果。因此，应当了解，本发明不受所公开的具体实施例的限制，并且修改形式和其他实施例也旨在被包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了具体术语，但是这些术语仅以一般性和描述性意义使用而不是为了进行限制。
[0012]1.鉬合物
[0013]提供了采用microRNA(miRNA)的方法和组合物,所述mieroRNA (miRNA)当在植物或植物细胞中表达时能降低蛋白和/或基因家族的多个蛋白/基因的表达。此类方法和组合物采用miRNA表达构建体。如本文所用，“miRNA表达构建体”是指包含miRNA前体主链的DNA构建体，其具有编码miRNA和星序列的多核苷酸序列。miRNA表达构建体被设计成使得从所述构建体产生的丰度最高的miRNA为22-核苷酸的miRNA。
[0014]典型的miRNA为21-核苷酸(21_nt)并产生于发夹前体的茎结构中的对称折返。然而，22-nt miRNA可由前体的非对称折返形成，其导致发夹前体的miRNA链中产生I个核苷酸鼓包。miRNA表达构建体如本文所公开被设计成编码22-nt miRNA，以及在细胞中表达时能降低来自相同蛋白和/或基因家族的至少两个序列的mRNA水平。
[0015]“mieroRNA”或“miRNA”是指寡核糖核酸，一般来讲长度为约19至约24个核苷酸，其调控包含靶序列的多核苷酸的表达。mieroRNA为非蛋白编码RNA，在动物和植物中已被鉴定(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-858 (2001)，Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-739(2002) ；Lau 等人，Science294:858-862(2001) ；Lee 和 Ambros,Science294:862-864(2001) ;Llave等人，Plant Celll4:1605-1619 (2002) ;Mourelatos 等人，Genes.Dev.16:720-728(2002) ;Park 等人，Curr.Biol.12:1484-1495(2002) ； Re inhart等人，Genes.Dev.16:1616-1626 (2002))。在植物中，miRNA来源于较大的前体多核苷酸经由类dicerl加工而成的。如本文其它地方另外详细讨论的，miRNA可为“人工miRNA”或“amiRNA”，其包含被合成设计成沉默靶序列的miRNA序列。
[0016]植物miRNA通过募集沉默因子至靶转录本中的互补结合位点来调控内源性基因表达。mieroRNA被初始转录为长多腺苷酸化的RNA,然后被加工形成具有形成稳定发夹能力的较短序列，然后在以siRNA机制进一步加工时释放miRNA。在植物中，这两个加工步骤是由类Dicer的核酸酶进行的。miRNA通过与互补RNA靶序列碱基配对、由RNA介导的沉默复合物(RISC)触发靶序列的RNA裂解来实现功能。
[0017]在少数情况下，小RNA与靶序列的相互作用能触发从围绕它们初级靶位点的区域生成次级小干扰 RNA(siRNAs) (Sijen 等人(2001) Celll07 (4):465-76)。所述 siRNA 群体的次级扩增和因此基因沉默水平的放大经由RNA依赖的RNA聚合成酶(RDR)依赖的和Dicer依赖的途径进行，所述途径采用初级靶RNA作为模板以生成次级siRNA。新合成的双链RNA (dsRNA)随后被裂解为siRNA，其能指导其他次级靶RNA以不依赖序列的方式降解。仅在植物和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中使用siRNA和双链RNA构建体时观察到经由这种生成次级siRNA的方法的传递性沉默(Sijen等人,参见上文；Vaistij等人(2002)Plant Celll4，857-867)。
[0018]A.编码22-核苷酸miRNA的mieroRNA表汰构建体
[0019]本文提供了编码22-核苷酸(22-nt)miRNA的mieroRNA表达构建体。如本文所用，miRNA表达构建体包含能被转录为RNA序列的多核苷酸，所述RNA序列在细胞中被最终加工形成miRNA。在一些实施例中，由miRNA表达构建体编码的miRNA为人工miRNA。在miRNA表达构建体中可进行不同修饰以编码miRNA。此类修饰在本文其它地方详细讨论。[0020]在一个实施例中，所述miRNA表达构建体包含miRNA前体主链，其具有异源的miRNA和对应的星序列。如本文所用，“miRNA前体主链”是提供了形成发夹RNA结构所需主链结构的多核苷酸，所述发夹RNA结构允许加工和最终形成miRNA。因此，所述miRNA前体主链被用作模板以表达人工miRNA和其对应的星序列。在miRNA表达构建体范围内，所述miRNA前体主链包含具有异源性miRNA和星序列的DNA序列。当表达为RNA时，miRNA前体主链的结构允许形成能被加工为miRNA的发夹RNA结构。在一些实施例中，所述miRNA前体主链包含基因组miRNA前体序列，其中所述序列包含插入了异源性miRNA和星序列的天然前体。
[0021]所述miRNA前体主链可来源于任何植物。在一些实施例中，所述miRNA前体主链来自单子叶植物。在其它实施例中，所述miRNA前体主链来自双子叶植物。在另外的实施例中，所述主链来自玉米或大豆。MicroRNA前体主链先前已有描述。例如，US20090155910AKW02009 / 079532)公开了下述大豆 miRNA 前体主链:156c、159、166b、168c、396b 和 398b，而 US20090155909A1(W02009 / 079548)公开了下述玉米 miRNA 前体主链:159(:、1691'、168&、16411和39611。这些参考文献的每一个均全文以引用方式并入。本文所公开的miRNA前体主链的非限制性例子包括例如miRNA GM_396b前体主链(SEQ ID NO:
9)或其活性变体和miRNA GM-159前体主链(SEQ ID NO: 16)或其活性变体。已经认识到，本文所提供的在miRNA前体主链进行的一些修饰，使得其核苷酸序列与未修饰的miRNA前体主链的核苷酸序列保持至少 60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或更多的序列同一性。此类miRNA前体主链的变体保持了 miRNA前体主链活性，从而继续允许加工和最终形成miRNA。
[0022]当设计miRNA表达构建体以祀向所关注的序列时,主链的miRNA序列可被设计用以靶向任何所关注序列的异源性miRNA所取代。在这种情况下，miRNA表达构建体中的对应的星序列将被改性，使得其碱基与前体RNA中的设计miRNA序列配对形成一个不完美的茎结构。在这种情况下，星序列和miRNA序列两者对于miRNA前体主链是异源性的。[0023]因此，在一个实施例中，可改性miRNA前体主链以允许在miRNA前体主链内有效插入新miRNA和星序列。在这种情况下，采用聚合成酶链反应技术将所述miRNA前体主链的miRNA片段和星片段替换为异源性miRNA和异源性星序列，并克隆至表达质粒中以生成miRNA表达构建体。已经认识到，可以改变异源性miRNA和星序列插入至主链的位点。将miRNA和星序列插入至miRNA前体主链的详细方法已在本文其它地方有所描述(参见实例4和5)并且在例如美国专利申请20090155909A1和US20090155910A1中也有所描述，所述专利申请均全文以引用方式并入本文。
[0024]在一个实施例中，所述miRNA前体主链包含编码miRNA的第一多核苷酸片段和编码星序列的第二多核苷酸片段，其中第一和第二多核苷酸片段对于miRNA前体主链为异源性的。如本文所用，相对于序列的“异源性”旨在表示源自外来物种的序列，或者如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预而从其原生形式在组成和/或基因组基因座方面基本上改性的序列。例如，对于核酸，其可以是源自外来物种的核酸，或者是合成设计的核酸，或者如果源自相同物种，则为通过蓄意的人为干预而从其原生形式在组成和/或基因组基因座方面基本上改性的核酸。因此，在miRNA表达构建体的范围内，异源性miRNA和星序列与miRNA前体主链是非原生的。
[0025]miRNA和星序列在miRNA表达构建体内的页序可以改变。例如，在具体的实施例中，包含miRNA表达构建体的miRNA片段的第一多核苷酸片段位于包含星序列的第二多核苷酸序列的5'端。作为另外一种选择，包含星序列的第二多核苷酸序列可位于包含miRNA表达构建体的miRNA序列的第一多核苷酸序列的5'端。
[0026]如上所讨论，将miRNA表达构建体设计成使得由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA的长度为22-nt。此类表达构建体因此将包含第一多核苷酸片段(其包含miRNA序列)以及第二多核苷酸片段(其包含对应的星序列)，其中星序列比编码对应的miRNA的多核苷酸少至少Ι-nt。在这种情况下，在星序列中少至少I核苷酸将在星序列和miRNA序列彼此杂交时在miRNA序列中形成一个错配或“鼓包”。此类结构体导致22-nt miRNA成为所生成的miRNA中丰度最高的形式。参见Cuperus等人(2010)NatureStructural & Mol.Biol.17(8):997_1004，全文以引用方式并入本文。
[0027]如本文所用，“丰度最高的形式”意为22-nt miRNA代表了由miRNA表达构建体产生的miRNA的最大群体。换句话讲，虽然miRNA表达构建体可产生长度非22_nt (即
19-nt、20_nt、21-nt等)的miRNA,但由miRNA表达构建体产生的丰度最高的miRNA的长度为22-nt。因此，22-nt miRNA代表了由miRNA表达构建体产生的miRNA群体的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、或 100%。
[0028]如本文所用，“星序列”是指在miRNA前体主链内与miRNA互补并与miRNA形成双工以形成发夹RNA的茎结构的序列。在一些实施例中，星序列可包含与miRNA序列小于100%的互补。作为另外一种选择，只要星序列与miRNA序列具有足够的互补以形成双链结构，星序列可包含与miRNA序列至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或更低互补的序列。在另外的实施例中，星序列包含与miRNA序列具有1、2、3、4、5或更多处错配的序列，并仍具有足够的互补与miRNA序列形成双链结构，导致生成miRNA并抑制靶序列。
[0029]由miRNA表达构建体产生的丰度最高的miRNA为22_nt长度，并具有与RNA水平待降低的靶序列足够互补的序列。与靶序列的“足够互补的序列”是指其互补性足够使得22-nt miRNA结合至靶序列并降低靶序列的表达水平。在具体的实施例中，具有与靶序列足够互补的miRNA可与靶序列共有100%互补的序列或可与靶序列共有小于100%互补的序列(即至少 99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%或更低互补的序列)。在其它实施例中，miRNA与靶序列可具有1、2、3、4、5或至多6处改性或错配，只要22-nt miRNA与靶序列具有足够的互补以降低靶序列的表达水平。已经报道了与靶序列有多处错配的内源性miRNA。例如，参见Schawb等人(2005) Developmental Cell8:517-27和Cuperus 等人(2010)Nature Structural and Molecular Biologyl7:997-1003,全文以引用方式并入本文。
[0030]当设计对于本文所公开的miRNA表达构建体的miRNA序列和星序列时，可以有不同的设计选择。参见例如Schwab R，等人(2005)Dev Cell8:517-270在非限制性实施例中，本文所公开的miRNA序列可具有位于5'端的“U”、位于第19核苷酸位点的“C”或“G”、以及位于第10核苷酸位点的“A”或“U”。在其它实施例中，miRNA设计使得miRNA具有如 ZipFold 算法计算的高自由Λ -G(Markham, N.R.和 Zuker, Μ.(2005)Nucleic AcidsRes.迎:W577-W581)。任选地，在miRNA的5'部分内可加入一对碱基对变化，以使所述序列与靶序列相差一个核苷酸。
[0031]“靶序列”是指设计miRNA以降低并从而调控例如降低其RNA表达的序列。被用于设计miRNA的所关注基 因的靶序列区可为开放阅读框、5'或3'非翻译区、外显子、内含子、侧翼序列等的一部分。一般类别的所关注基因包括例如那些涉及信息的诸如转录因子，那些涉及通讯的诸如激酶，以及那些涉及持家的诸如热休克蛋白。更具体的类别例如包括编码对于农艺学、抗昆虫性、抗病性、抗除草剂性、不育、谷粒特征、以及商品的重要性状的基因。所关注基因包括一般来讲涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物代谢的那些，以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些。靶序列可以是内源性序列，或者可以是导入的异源性序列。
[0032]由miRNA表达构建体产生的22_nt miRNA能够降低靶序列的表达水平以及降低靶序列和来自相同蛋白和/或基因家族至少一个其他序列的mRNA水平，所述相同蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21-nt miRNA所降低。用于测定蛋白和/或基因家族的两个或更多成员的表达降低的方法包括例如监测来自相同蛋白和/或基因家族mRNA水平的降低或监测表型的改变。本文其它地方讨论了用于测定蛋白和/或基因家族的两个或更多成员的表达降低的不同的方法。因此，如本文所公开，单个miRNA可沉默蛋白和/或基因家族中的多个蛋白/基因或整个蛋白和/或基因家族。
[0033]如本文所用，“降低”、“抑制”、“沉默”、“抑制作用”互换使用，以表示相对于野生型生物体中其正常表达水平的靶序列产物表达水平的下调。通过“降低RNA的水平”要达到的目的是降低表达至任一统计意义上的显著性数量，例如相对于野生型表达水平降低至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%。如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。因此，核酸分子的表达可以指核酸片段的转录(例如，转录生成mRNA或其他功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白(多肽)。
[0034]由本文所公开的由miRNA表达构建体产生的miRNA可抑制蛋白和/或基因家族的所有成员，或给定的蛋白和/或基因家族内的至少1、2、3、4、5个或更多不同序列。如本文所用，“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，其包括编码序列前的调控序列(5'非编码序列)和编码序列后的调控序列(3'非编码序列)。如本文所用，“蛋白家族”和“基因家族”旨在分别指结构上相关的蛋白和核酸，其通常通过保守结构基序来鉴定。基因家族成员可根据编码结构相关的多肽或根据核酸序列同一性来定义。如本文所用，来自相同蛋白和/或基因家族的序列是结构上相关的，使得给定的核酸与来自相同基因家族的其他序列共有至少 60%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性，或使得给定的多肽与来自相同蛋白家族的其他序列共有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或使得由核酸编码的给定多肽与由来自相同蛋白家族的由核酸编码的多肽共有60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。
[0035]在另一个实施例中，被miRNA抑制的蛋白和/或基因家族成员彼此不具有相同的21个连续的核苷酸。在这种情况下，能沉默具有对应的21-nt序列的序列的“传统的”21-ntmiRNA将不能沉默蛋白和/或基因家族中的至少一个其他序列。如本文其它地方讨论，由瞬时miRNA表达构建体产生的22-ntmiRNA将降低作为靶序列的来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列的表达水平。
[0036]1.靶向肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白/基因家族的miRNA表达构建体
[0037]提供了包含miRNA表达构建体的组合物，其中所述miRNA靶序列为肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白家族的一个成员，而其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低GAS蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。
[0038]如本文所用，“GAS”是指能影响棉子糖家族低聚糖(RFO)生成的基因或编码蛋白:由肌肉肌醇和UDP-半乳糖生成肌醇半乳糖苷。在大豆中，有至少三类GAS基因，对应至少5个GAS基因。代表性的GAS基因序列无限制地包括在美国专利申请公开2006 / 0005280、WOOl / 77306,W098 / 50553 和在美国专利 5，648，210 和 Sprenger 与 Keller (2000)PlantJ.21 =249-258中公开的那些。
[0039]本文呈现的GAS miRNA表达构建体的表达生成作为miRNA丰度最高形式的22_ntmiRNA,并沉默了 GAS蛋白和/或基因家族的至少两个成员。测定GAS基因沉默的方法是本领域已知的。如本文其它地方讨论，可通过测量靶mRNA或蛋白的表达水平与未表达miRNA的对照进行比较来测定沉默。此外，能通过测量种子和体细胞胚芽中棉子糖和水苏糖的水平、与未表达22-nt的GAS miRNA的对照种子或胚芽的水平比较来测定GAS基因家族沉默。降低每个GAS家族成员的表达水平导致棉子糖和水苏糖积累的下降。因此，例如降低GAS家族的每个成员的表达可导致棉子糖家族低聚糖生产下降至小于野生型水平的0.5%。“下降”是指相对于未导入miRNA序列的原生对照植植物、植物部分或细胞，下降至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或更多。例如，实例 7，本文其它地方介绍的，提供了用于测定GAS沉默的详细方法。因此，在一个实施例中，提供了miRNA表达构建体；当其在细胞中表达时，能降低GAS蛋白和/或基因家族中至少1、2、3、4、5或更多成员的表达水平。
[0040]本文还提供了包含GAS miRNA和GAS星序列的miRNA前体主链。本文提供的非限制性miRNA前体主链例如但不限于miRNA GM_396b，以及具有如SEQ ID NO:9所示的序列或它们的活性变体。所述主链的miRNA序列和星序列可使用本文其它地方描述的特异性PCR引物转换为人工GAS miRNA序列和星序列。在表1中提供了示例性GAS引物，其序列如SEQID NO:12 和 13 所示。
[0041]在非限制性实施例中，所述GAS miRNA表达构建体包含由如SEQ ID NO:2所示的序列或其活性变体编码的miRNA，以及由如SEQ ID NO:6所示的序列或其活性变体编码的星序列。在另一个非限制性实施例中，所述GAS miRNA序列包含如SEQ ID NO:1所示的序列或其活性变体，并且所述星序列包含如SEQ ID NO:5所示的序列或其活性变体。给定的miRNA或星序列的活性变体允许形成活性的miRNA。
[0042]本文提供了所述GAS miRNA (即 SEQ ID N0:1)、GAS 星序列(即 SEQ ID N0:5)、以及miRNA前体主链的活性变体。所述miRNA前体主链可被改性，以便例如如本文其它地方所述，允许在miRNA前体主链内有效插入新的miRNA和星序列,使得主链保留形成发夹结构的能力。如本文其他部分所讨论，所述miRNA序列可包含与靶序列有1、2、3、4、5或至多6处错配，并仍然保持活性，从而结合靶序列并抑制靶序列的表达。此外，所述星序列可包含与miRNA序列少于100%的互补。所述星序列比miRNA少至少I个核苷酸,或可包含与miRNA序列有1、2、3、4、5或更多处错配的序列，并仍具有足够的互补与miRNA序列形成双链结构，导致生成miRNA并抑制靶序列。
[0043]ii.靶向Λ 12脂肪酸去饱和酶-2(FAD_2)蛋白/基因家族的miRNA表达构建体
[0044]所提供的组合物包含miRNA表达构建体，其中所述miRNA靶序列为Λ 12脂肪酸去饱和酶-2(FAD-2)蛋白和/或基因家族的一个成员，而由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低FAD2蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。
[0045]Δ 12脂肪酸去饱和酶在内质网中起作用将油酸(18:1)转化为亚油酸(18:2)。如本文所用，“FAD2”是指能催化在从羧基末端数第十二位的脂肪酰基插入双键的基因或编码的蛋白。在大豆中至少有五个FAD2基因家族成员(Schlueter等人，Crop Science47 (SI)(2007))。在大豆中所述FAD2基因包括两个亚家族，FAD2-1和FAD2-2，每一个有两个基因成员(Schlueter等人)。FAD2-1主要在种子中表达，而FAD2-2 —般来讲更多的是在整个植物中表达(Heppard 等人(1996)Plant PhysiologyllO:311-19)。代表性的 FAD2 序列包括例如那些如在2002年6月21日提交的美国专利申请10 / 176，149中所示的，以引用方式并入本文。
[0046]表达本文介绍的FAD2miRNA表达构建体导致22_nt miRNA成为丰度最高形式的miRNA，其降低了 FAD2蛋白和/或基因家族的至少两个或更多成员的表达水平。对于FAD2基因沉默的测定方法是本领域已知的。如本文其他部分讨论的，可通过测量靶mRNA或蛋白的表达水平与未表达miRNA的对照进行比较来测定沉默。此外，可通过测量种子和体细胞胚芽中油酸的水平、与未表达22-nt的FAD2miRNA的对照种子或胚芽的水平进行比较来测定FAD2基因家族沉默。降低FAD2家族中每个成员的表达水平导致油酸积累的增加。“增加”是指相对于未引入miRNA序列的原生对照植物、植物部分、或细胞增加了至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。例如，实例8，如在本文其他地方所呈现，提供了对于FAD2沉默的详细测定方法。因此，在一个实施例中，当提供的miRNA构建体在细胞中表达时，能够降低FAD2蛋白和/或基因家族成员中至少1、2、3、4、5或更多个的表达水平。
[0047]本文还提供了包含FAD2miRNA和FAD2星序列的miRNA前体主链。本文提供的非限制性miRNA前体主链例如但不限于miRNA GM-159，和具有如SEQ ID NO:16所示的序列或其活性变体。所述主链的miRNA序列和星序列可使用本文其他地方描述的特异性PCR引物转换为人工FAD2miRNA序列和星序列。在表1中提供了示例性FAD2引物，其序列如SEQID NO:19 和 20 所示。
[0048]在非限制性实施例中，所述FAD2miRNA表达构建体可包含由如SEQ ID NO:4所示的序列或其活性变体编码的miRNA，以及由如SEQ ID NO:8所示的序列或其活性变体编码的星序列。在另一个非限制性实施例中，所述FAD2miRNA序列包含如SEQ ID NO:3所示的序列或其活性变体，所述星序列包含如SEQ ID NO:7所示的序列或其活性变体。
[0049]本文提供了FAD2miRNA (即 SEQ ID NO:3)、FAD2 星序列(即 SEQ ID NO:7)和miRNA前体主链的活性变体。所述miRNA前体主链可被改性，以便例如如本文其它地方所述，允许在miRNA前体主链内有效插入新的miRNA和星序列,使得主链保留形成发夹结构的能力。如本文其他部分所讨论，所述miRNA序列可包含与靶序列有1、2、3、4、5或至多6处错配，并仍然保持活性，从而结合靶序列并抑制靶序列的表达。此外，所述星序列可包含与miRNA序列少于100%的互补。所述星序列比miRNA少至少I个核苷酸，或可包含与miRNA序列有1、
2、3、4、5或更多处错配的序列，并仍具有足够的互补以与miRNA序列形成双链结构，导致生成miRNA并抑制靶序列。
[0050]B.编码miRNA表达构建体的多核苷酸和制备方法
[0051]组合物还包含分离或重组体多核苷酸，其编码miRNA表达构建体、miRNA表达构建体的各种组分、连同被加工成miRNA的miRNA表达构建体的不同产物。miRNA表达构建体的示例性组分包括例如包含miRNA前体主链、miRNA和星序列的多核苷酸,用于生成编码不同RNA序列的miRNA和核苷酸序列的引物。此类多核苷酸总结于表2中。本文所用术语“编码(encodes或encoding) ”是指可被加工以产生RNA和/或多肽的DNA序列。
[0052]本文可互换使用术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”。这些术语涵盖核苷酸序及类似的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。术语“多核苷酸”的使用并非旨在将本发明限制为包含DNA的多核苷酸。本领域的一般技术人员将认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明所述多核苷酸也涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。
[0053]本文提供的组合物可包含分离或基本上经纯化的多核苷酸。“分离”或“经纯化的”多核苷酸，是基本上或本质上不含那些在天然存在环境中正常伴随多核苷酸或与其相互作用的游离组分。因此，分离或经纯化的多核苷酸基本上不含其他细胞物质、或当通过重组体技术生产时的培养基、或基本上不含当通过化学合成时的化学前体或其他化学物质。最理想地，“分离”多核苷酸不含多核苷酸所来源于的生物的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两翼(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端)的序列(最理想地蛋白编码序列)。例如，在不同的实施例中，所述分离多核苷酸可包含少于多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地存在于所述多核苷酸两翼约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb、或0.1kb的多核苷酸。
[0054]还提供了包含miRNA表达构建体和其不同组分的重组多核苷酸。本文可互换使用术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”。重组构建体包含人工的或异源的核酸序列的组合例如非天然共存的调控和编码序列。例如，miRNA表达构建体可包含miRNA前体主链，其具有包含miRNA序列和星序列的异源性多核苷酸，因此所述miRNA序列和星序列对于miRNA前体主链不是原生的。在其它实施例中，重组构建体可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones 等人，EMBO J.4:2411-2418(1985) ;DeAlmeida 等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86(1989))，因此为了获得显示期望的表达水平和模式的细胞系必须筛选多个事件。这种筛选可通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。[0055]在具体的实施例中，本文所述的一个或多个miRNA表达构建体可以表达盒形式提供以在植物或其他生物体或所关注的细胞类型中表达。所述盒可包括5'和3'调控序列，其被可操作地连接至本文提供的多核苷酸。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，受关注的多核苷酸和调控序列(即一个启动子)之间的可操作的连接为允许该受关注的多核苷酸的表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用于指两个蛋白编码区的连接时，“可操作地连接”意指所述编码区处于同一阅读框中。所述盒可附加地包含至少一个将被转化到生物体中的其他基因。作为另外一种选择，能通过多个表达盒提供其他基因。这样的表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点，用以将重组多核苷酸插入至使其处于所述调控区的转录调控之下的位置。所述表达盒可附加地包含选择性标记基因。
[0056]所述表达盒可包括在转录的5' -3'方向中，转录和翻译起始区(即启动子)、本文所提供的重组多核苷酸、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。所述调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本文所提供的重组多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是天然的/类似的。作为另外一种选择，本文所提供的所述调控区和/或重组多核苷酸对宿主细胞而言或者对彼此而言可以是异源的。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的一个启动子所来自的物种，不同于所述多核苷酸所来源自的物种；或者，如果二者来自相同的/类似的物种，则二者之一或二者均为从其原始形式和/或基因组基因座经过充分修饰的，或者所述启动子并非针对可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。作为另外一种选择，本文所提供的所述调控区和/或重组多核苷酸可以是全部合成的。
[0057]所述终止区就转录起始区而言可以是天然的，就受关注的可操作地连接的重组多核苷酸而言可以是天然的，就植物宿主而言可以是天然的，或者就启动子、受关注的所述重组多核苷酸、植物宿主或者它们的任意组合而言，可以是源自其他来源的(即，外来的或异源的)。使用方便的终止区得自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合成酶和胭脂喊合成酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144 ；Proudfoot(1991)Cell64:671-674 ；Sanfacon 等人(1991)Genes Dev.5: 141-149 ；Mogen等人(1990)Plant Cell2:1261-1272 ；Munroe 等人(1990)Gene91:151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903 ;以及 Joshi 等人(1987)NucleicAcids Res.15:9627-9639 。
[0058]在制备miRNA表达盒的过程中，可操作多个DNA片段以在正确方向上提供DNA序列。为了这一目的，可使用衔接子或连接子以接合DNA片段，或者使用其他操作方法提供方便的限制性位点以移除冗余DNA、移除限制性位点等。为了这一目的，可使用体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再取代，例如转换和颠换。
[0059]许多启动子可用于本文提供的miRNA表达构建体。可基于期望结果选择启动子。应当认识到，通过在植物miRNA表达构建体中使用不同启动子来提高不同应用，以调节miRNA表达的时间、位置和/或水平。如果需要，此类miRNA表达构建体可含有启动子调节区(例如赋予诱导型、组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性表达的调节区)，转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
[0060]在一些实施例中，本文提供的miRNA表达构建体可与组成型、组织优选的或其他启动子合并以在植物中表达。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I'-或2'-启动子、泛素蛋白I启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5，683，439)、Nos启动子、PEmu启动子、nbisco启动子、GRP1-8启动子、以及本领域技术人员已知的来自各种植物基因的其他转录起始区。如果期望低水平的表达，可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(W099 / 43838和美国专利6，072，050)、35S CaMV核心启动子等等。其他组成型启动子包括例如美国专利5，608，149 ;5，608，144 ；5，604，121 ;5，569，597 ;5，466，785 ;5，399，680 ;5，268，463 ;和 5，608，142。还参见美国专利6，177，611，以引用方式并入本文。
[0061]诱导型启动子的例子是可通过低氧或寒冷胁迫诱导的Adhl启动子，可通过热胁迫诱导的Hsp70启动子,PPDK启动子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)启动子，二者都是可光诱导的。还有用的启动子是可化学诱导的启动子，诸如安全剂诱导的In2-2启动子(美国专利5，364，780)，雌激素诱导的ERE启动子，以及植物生长素诱导的和绒毡层(tapetum)特异性的，而且在愈伤组织中也有活性的Axigl启动子(PCT USOl / 22169)。
[0062]处于发育控制下的启动子的例子包括优先在某些组织，诸如叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。示例性启动子是花药特异性启动子5126(美国专利5，689，049和5，689，051)。种子优选的启动子的例子包括但不限于27kD Y玉米醇溶蛋白启动子和腊状启动子，Boronat, A.等人(1986)PlantSc1.47:95-102 ；Reina, Μ.等人 Nucl.AcidsRes.18(21):6426 ;和 Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet203:237_244。在胚芽、果皮和胚乳中表达的启动子公开在美国专利6，225，529和PCT公开W000 / 12733中。这些专利的每一个的公开内容以引用的方式全文并入本文。
[0063]化学调节的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调苄基因在植物中的表达。根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉米Ιπ2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其他化学调节的启动子包括留类化合物反应性启动子(参见例如，Schena 等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425 和 McNellis 等人(1998)Plant J.14(2):247-257)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz 等人(1991)Mol.Gen.Genet227:229_237，和美国专利 5，814，618 和 5，789，156)，以引用方式并入本文。
[0064]组织优选的启动子可用于定向提高特定植物组织内的miRNA表达构建体的表达。组织优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265 ;Kawamata 等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803 ;Hansen 等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343 ；Russell 等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168 ；Rinehart 等人(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341 ；Van Camp 等人(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535 ；Canevascini 等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524;Yamamoto 等人(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778 ；Lam(1994)Results Prob1.CellDiffer.20:181-196 ;0rozco 等人(1993) Plant MolBiol.23(6):1129-1138 ;Matsuoka 等A (1993) Proc Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 ;以及 Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3):495_505。如果需 要的话，可修饰这样的启动子以进行弱表达。
[0065]叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997) PlantJ.12(2):255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol.105:357-67 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778 ;Gotor 等人(1993)Plant J.3:509-18 ;0rozco 等人(1993) Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138 ;和 Matsuoka 等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90(20):9586_9590。此外，可以使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson等人(1958)EMBO J4:2723-2729 和 Timko 等人(1988)Nature318:57_58。
[0066]根优选的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或者从不同相容物种中从头分离启动子。参见例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner (1991)Plant Cell3 (10):1051-1061 (法国菜豆的GRP1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.14 (3):433-443 (根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell3(l):11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。也参见Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7):633_641，其中描述了两种根特异性启动子，它们是从来自固氮非豆科Parasponia andersonii以及相关非固氮非豆科山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的。将这些基因的启动子与β_葡糖醛酸酶报道基因连接，并且导入非豆科的烟草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脉根(Lotus corniculatus)内，在这两种情况下，都保持了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表达的roIC和roID根诱导基因的启动子的分析(参见Plant Science (Limerick) 79 (I):69-76)。他们推断,在这些启动子中增强子和组织特异性DNA决定子是解离的。Teeri等人(1989)使用与IacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合成酶的农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖的表皮中具有特别活性，以及TR2'基因在完整植物中是根特异性的，并且受叶组织中的伤害的刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J8 (2) =343-350)。与nptll (新霉素磷酸转移酶II)融合的TRl'基因表现出类似特征。其他根优选的启动子包括VfEN0D-GRP3基因启动子(Kuster 等人(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772);和 roIB 启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.25(4):681_691。也参见美国专利 5，837，876 ;5，750，386 ;5，633，363 ;5，459，252 ;5，401，836 ;5，110，732 ;和 5，023，179。菜豆蛋白基因(Murai 等人(1983)Science23:476-482 和 Sengopta-Gopalen 等人(1988)PNAS82:3320_3324。
[0067]包含miRNA表达构建体的表达盒也可包含用于选择转化过的细胞的选择性标记基因。利用选择性标记基因以选择转化过的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，诸如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，除草化合物诸如草胺磷铵、溴苯腈、咪唑啉酮类、和2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)以及磺脲类药物。其他选择性标记包括表型标记物诸如β_半乳糖苷酶和荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP) (Su等人2004)Biotechnol.Bioeng.85:610-9和 Fetter 等人(2004)Plant Celll6:215-28)，青色荧光蛋白(CYP) (Bolte 等人(2004)J.Cell Sciencell7:943-54 和 Kato 等人(2002)Plant Physiol.129:913-42)，以及黄色荧光蛋白(来自 Evrogen 的 PhiYFP.TM.;参见，Bolte 等人(2004) J.Cell Sciencell7:943-54) ο 关于其他选择性标记，一般参见 Yarranton (1992) Curr.0pin.Biotech.3:506-511 ；Christopherson 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318 ；Yao 等人(1992)Cell71:63-72 ；Reznikoff (1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422 ；Barkley 等人(1980)The Operon，177-220 页；Hu 等人(1987)Cell48:555-566 ；Brown 等人(1987)Cell49:603-612 ；Figge 等人(1988)Cell52:713-722 ；Deuschle 等人(1989)Proc.Natl.Acad.Ac1.USA86:5400-5404 ；Fuerst 等人(1989)Proc.Nail.Acad.Sc1.USA86:2549-2553 ；Deuschle 等人(1990) Science248:480-483 ；Gossen (1993)博士学位论文，Universityof Heidelberg ；Reines 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921 ；Laboff 等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356 ;Zambretti 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956 ；Baim 等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076 ；ffyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653 ；Hillenand-ffissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10: 143-162 ；Degenkolb 等人(I99I)AntimicrokAgents Chemother.35:1591-1595 ；Kleinscmidt 等人(1988)Biochemistry27:1094-1104 ；Bonin(1993)博士学位论文，University of Heidelberg ；Gossen 等人(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551 ；01iva 等人(1992) Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919 ；Hlavka 等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,第 78 卷(Springer-Verlag, Berlin)；Gill等人(1988)Nature334:721-724。此类公开以引用方式并入本文。上文的选择性标记基因列表并不意味是限制性的。任一选择性标记可用于本文介绍的组合物中。
[0068]C.棺物
[0069]还提供了包含细胞、转基因植物细胞、转基因植物、转基因种子、以及转基因外植体的组合物，其中包含miRNA表达构建体。在一个实施例中，包含miRNA表达构建体的细胞、植物、植物细胞或植物种子，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低蛋白和/或基因家族的两个或更多成员的表达水平，所述蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21-nt miRNA所降低(表达水平)。已经认识到，由miRNA表达构建体编码的miRNA可靶向任一蛋白和/或基因家族。
[0070]在另外的实施例中，细胞、植物细胞、植物或种子包含miRNA表达构建体，其包含miRNA前体主链，还包含异源性miRNA序列和异源性星序列。所述miRNA前体主链可以为来自任何植物。在一些实施例中，所述miRNA前体主链可来自单子叶植物(即玉米)或双子叶植物(即大豆)。例如，miRNA前体主链可包含但不限于miRNA GM_396b前体主链(SEQID NO:9)或其活性变体或miRNA GM-159前体主链(SEQ ID NO:16)或其活性变体。 [0071]在其它实施例中，提供了包含miRNA表达构建体的细胞、植物细胞、植物或种子，其中所述miRNA祀序列为肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白家族的一个成员，而其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低GAS蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。如本文其他地方所述，降低GAS家族成员的表达水平导致植物棉子糖和水苏糖积累的下降。
[0072]还提供了包含miRNA表达构建体的细胞、植物细胞、植物或种子，其中所述miRNA靶序列为Λ 12脂肪酸去饱和酶-2 (FAD-2)蛋白和/或基因家族的一个成员，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低FAD2蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。如本文其他地方所述，降低FAD2家族成员的表达水平导致植物油酸积累的下降。
[0073]如本文所用，“植物”包括作为参照的完整植物、植物器官、植物组织、种子和相同的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞:种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。术语“植物组织”包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分:根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和不同形式的细胞和培养物(例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植物或植物器官、组织或细胞培养物中。
[0074]本文提供的转化的植物或转化的植物细胞是指其遗传改变，诸如转化，已被所关注的基因影响，或来自这种改性的植物或细胞的后代并包含这种改性的植物或植物细胞。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。因此，“转基因植物”是指包含转基因的植物，不论是通过转化或通过育种将转基因引入特定植物的；因此，该定义涵盖了最初转化的植物的后代。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”为测量受试植物或植物细胞的表型变化提供了基准点。对照植物或植物细胞可包括例如:(a)野生型植物或细胞，即，与用于遗传改性生成受试植物或细胞的起始材料具有相同基因型的；(b)与起始材料具有相同基因型、但用空构建体转化了的植物或细胞(即，用不表达miRNA的构建体，诸如包含标记基因的构建体)；(e)为受试植物或植物细胞子代中的非转化的分离体的植物或植物细胞；(d)与受试植物或植物细胞遗传上相同、但未暴露于将导致miRNA表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)处于miRNA表达构建体不表达条件下的受试植物或植物细胞自身。
[0075]被转化以具有本文提供的miRNA表达构建体的植物细胞可长成完整植物。从单个植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的。参见例如 McCormick 等人(1986)Plant Cell Reports5:81-84 ;Weissbach 和 Weissbach,In:Methods for Plant Molecular Biology,(编辑)，Academic Press，Inc.San Diego,Calif.，(1988)。该再生和生长方法通常包括如下步骤:选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植物阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。可以生长两代或多代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型特征的表达已经实现。这样，本文介绍的所述组合物提供了转化的种子(也被称为“转基因种子”)，其具有本文提供的多核苷酸的例如miRNA表达构建体，稳定地整合在其基因组中。
[0076]本文提供的所述miRNA表达构建体可用于转化任何植物种类，包括但不限于单子叶植物(例如玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦)和双子叶植物(例如大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿)。所关注的植物种类的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属植物(例如油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是那些用作种子油源的芸苔属植物物种、苜猜(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(蜀黍(Sorghum bicolor)、南非蜀黍(Sorghum vulgar))、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草属植物(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypiumbarbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffea 属物种)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus 属物种)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蓮(Musa 属物种)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石植(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜果(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘鹿(Saccharum属物种)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、和针叶树。
[0077]蔬菜包括西红柿(Lycopersicon esculentum)、萬苣(例如叶用萬苣(Lactucasativa))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属物种(Lathyrus spp.))、和黄瓜属物种如黄瓜O、香瓜(C.cantalupensts)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹽花(Rhododendron属物种)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、蔷薇(Rosa属物种)、郁金香(Tulipa属物种)、水仙花(Narcissus 属物种)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)、和菊花。
[0078]本文可使用的针叶树包括例如松树诸如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinuselliotii)、北美黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)、和福射松(Pinusradiata);花方萁松(Pseudotsuga menziesii);异叶铁杉(Tsuga canadensis);北美云杉(Picea glauca);红杉(Sequoia sempervirens);真冷杉如银微(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea);和雪松诸如西岸红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄桧(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施例中，本文提供的植物为作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、红花、豌豆、高粱、小麦、粟、烟草属植物等)。在其它实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外的实施例中大豆植物是最佳的。
[0079]其他所关注的植物包括提供所关注种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜尔胶、刺槐豆胶、胡芦巴、大豆、花园豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆
坐寸ο
[0080]根据miRNA靶序列，表达本文提供的miRNA表达构建体的转基因的植物、植物细胞或种子可具有表型变化，包括但不限于改性的病原体或昆虫防御机制、对一种或多种除草剂抗性的增加、耐受胁迫环境条件能力的增加、改性的生产淀粉能力、改性的淀粉生产水平、改性的油脂含量和/或组成、改性的碳水化合物含量和/或组成、改性的脂肪酸含量和/或组成、改性的利用、分配和/或储存氮的能力等。
[0081]II.导入的方法
[0082]本文提供的方法包括将miRNA表达构建体导入细胞、植物细胞、植物或种子，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-ntmiRNA，其能降低靶序列以及相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他成员的表达水平，所述相同蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21_nt miRNA所降低(表达水平)。已经认识到由miRNA表达构建体编码的miRNA能靶向任一蛋白和/或基因家族。
[0083]能被导入细胞、植物细胞、植物或种子的miRNA表达构建体包含miRNA前体主链，其还包含异源的miRNA序列和异源的星序列。所述miRNA前体主链可来源于任何植物。在一些实施例中，所述miRNA前体主链可来自单子叶植物(即玉米)或双子叶植物(即大豆)。例如，miRNA前体主链可包含但不限于miRNA GM_396b前体主链(SEQ ID NO:9)或其活性变体或miRNA GM-159前体主链(SEQ ID NO: 16)或其活性变体。
[0084]在一些实施例中，导入了包含miRNA靶序列的miRNA表达构建体，所述miRNA靶序列是肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的一个成员，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高的形式的miRNA为22-nt miRNA，其能降低GAS蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。在其它实施例中，miRNA表达构建体包含miRNA靶序列，所述miRNA靶序列为Λ 12脂肪酸去饱和酶-2 (FAD-2)蛋白和/或基因家族的一个成员，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22-mmiRNA，其能降低FAD2蛋白和/或基因家族中至少一个其他成员的mRNA表达水平。
[0085]本文提供的方法不依赖于将序列导入宿主细胞的特定方法，只要使多核苷酸进入宿主的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸导入宿主细胞(即植物)中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、和病毒介导的方法。
[0086]术语“导入”和“已导入的”旨在表示提供核酸(例如miRNA表达构建体)或蛋白进入细胞。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合进细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如miRNA构建体)插入细胞内的情况下的“引入”指“转柒”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
[0087]“稳定转化”旨在表示将核苷酸构建体导入宿主并整合进植物基因组中，并且能够由其后代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入宿主(即植物)中并暂时表达。 [0088]转化方案以及用于将多核苷酸序列引入植物内的方案可以根据被定向转化的植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而改变。将多核苷酸引入植物细胞的适当方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniuques4:320-334)、电穿孔(Riggs 等人(1986)Proc.Nail.Acad.Sc1.USA83:5602_5606，Agrobacterium-mediatedtransformation (Townsend 等人，美国专利 5，563，055 ;Zhao 等人，美国专利 5，981，840)，直接基因转移(PaszkoWski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722)，和冲击粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利4，945，050 ；Tomes等人，美国专利5，879，918 ；Tomes等人，美国专利 5，886，244 ;Bidney 等人，美国专利 5，932，782 ;Tomes 等人(1995)“Direct DNA Transferinto Intact Plant Cellsvia Microprojectile Bombardment，，，inPlant Cell，Tissue，and Organ Culture !Fundamental Methods，编辑 Gamborg 和 Phillips (Springer-Verlag，Berlin) ;McCabe 等人(1988) Biotechnology6:923-926) JBLecl 转化(W000/28058)。还参见 Weissinger 等人(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477 ;Sanford 等人(1987) ParticulateScience 和 7echnology5:27-37(洋葱)；Christou 等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe 等人(1988)Bio / Technology6:923-926(大豆)；Finer 和McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182 (大豆);Singh等人(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324 (大豆);Datta 等人(1990) Biotechnology8:736-740 (水稻)；Klein 等人(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (玉米)；Klein 等人(1988)Biotechnology6:559-563 (玉米);Tomes，美国专利 5，240，855 ；Buising 等人，美国专利 5，322，783 和 5，324，646 ;Tomes 等人(1995) “Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment，，，in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture !Fundamental Methods，编辑 Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(玉米)；Klein等人(I988)Plant Physiol.91:440-444 (玉米)；Fromm 等人(I99O)Biotechnology8:833-839 (玉米)；Hooykaas_Van Slogteren 等人(1984) Nature (London) 311:763-764 ；Bowen 等人，美国专利 5，736，369 (谷物)；Bytebier 等人(1987) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349 (百合科)；De Wet 等人(1985) in The ExperimentalManipulation ofOvule Tissues，ed.Chapman 等人(Longman，New York)，第 197-209 页(花粉)；Kaeppler等人(1990) Plant CelIReports9:415-418和Kaeppler 等人(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566(颈须介导的转化);D' Halluin 等人(1992)Plant Cell4:1495-1505 (电穿孔)；Li 等人(1993)Plant Cell Reportsl2:250-255 和 Christou 和 Ford(1995)Annals ofBotany75:407-413 (水稻)；0sjoda 等人(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(玉米，通过根癌农杆菌)；所有这些文献以引用方式并入本文。
[0089]在具体的实施例中，使用多种瞬时转化方法可将本文所公开的miRNA表达构建体导入植物。此类瞬时转化方法包括但不限于将所述miRNA表达构建体或其变体直接导入到植物中。此类方法包括例如显微注射或微粒轰击法。参见例如Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185 ;Nomura 等人(1986)Plant Sc1.44:53-58 ;Hepler 等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.91:2176-2180 和 Hush 等人(1994)The Journal of CellSciencel07:775_784，所有文献以引用方式并入本文。作为另外一种选择，可使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化至植物中。此类技术包括病毒载体系统和以排除后续DNA释放的方式沉淀多核苷酸。因此，来自微粒结合的DNA的转录可以进行，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用以聚乙基亚胺(PEI ；Sigma#P3143)包被的颗粒。
[0090]在其它实施例中，可通过用病毒或病毒核酸接触植物将本文所公开的miRNA表达构建体引入植物。通常，这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体整合进入病毒DNA或RNA分子内。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸导入植物内并且表达其中编码的蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5，889，191,5, 889，190,5, 866，785,5, 589，367、5，316，931、以及 Porta 等人(1996)Molecular Biotechnology5:209-221 ;以引用方式并入本文。
[0091]用于在植物基因组的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本领域中已知的。在一个实施例中，多核苷酸在所期望的基因组位置的插入利用位点特异性重组系统实现。参见例如 W099 / 25821、W099 / 25854、w099 / 25840、W099 / 25855、和 W099 / 25853，它们均以引用方式并入本文。简而言之， 本文提供的miRNA表达构建体可包含在侧翼有两个不同重组位点的转移盒中。所述转移盒被导入植物中，所述植物的基因组中已稳定地整合了两翼与两个不同的重组位点相连的靶位点，所述重组位点对应于所述转移盒中的位点。提供了适当的重组酶，并且所述转移盒被整合至所述靶位点。从而将miRNA表达构建体整合至所述植物基因组的特定染色体位置。
[0092]已经被转化的细胞可根据常规方法生长为植物。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5:81_84。然后可培养这些植物，并用相同的菌株或不同的菌株转化过的植物进行授粉，具有所期望表型特征的组成型表达的所得到的子代被鉴定。可以生长两代或多代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型特征的表达已经实现。这样，提供了稳定地整合至基因组中的、具有本文所公开的miRNA表达构建体的转化过的种子(也被称为“转基因种子”。
[0093]II1.使用方法
[0094]提供了通过将miRNA表达构建体导入细胞(例如植物细胞)以降低两个或更多序列mRNA水平的方法。在此类方法中，相对于miRNA表达构建体不表达情况下每个mRNA的水平，靶序列的mRNA水平和来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列的mRNA水平被降低了。
[0095]本文提供的方法包括将miRNA表达构建体导入细胞(即植物细胞)，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA为22nt的miRNA，其能降低蛋白和/或基因家族的两个或更多个成员的表达水平，所述蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-ntmiRNA相同的区域的21-ntmiRNA所降低(表达水平)。方法还提供了包含miRNA前体主链的miRNA表达构建体，还包含异源的miRNA序列和异源的星序列。已经认识到，在本文提供的方法中可使用任何降低相同蛋白和/或基因家族中两个或更多序列表达水平的miRNA，即使它们在能作为miRNA起作用的21碱基对区不共有相近的同一性。另外，本文所提供的任何miRNA前体主链(即SEQ ID NO:9或16或其活性变体)可应用于所提供的方法中。
[0096]在一些实施例中，所述miRNA靶序列编码GAS家族成员。在此类方法中，miRNA表达构建体被导入细胞、植物细胞或植物。所述miRNA表达构建体包含miRNA靶序列，其编码GAS蛋白和/或基因家族(即SEQ ID NO:2或其活性变体)的成员，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA是22-nt miRNA。因此，靶序列和GAS蛋白和/或基因家族的至少一个其他成员的表达水平被降低了。在这些方法中，如本文其他地方所述，所得的表型是棉子糖和水苏糖积累的下降。
[0097]在其它实施例中，靶序列可以针对FAD2家族成员。在此类方法中，miRNA表达构建体被导入细胞、植物细胞或植物。所述miRNA表达构建体包含miRNA靶序列，其编码FAD2蛋白和/或基因家族(即SEQ ID NO:4或其活性变体)的成员，其中由miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA是22-nt miRNA。因此，靶序列和FAD2蛋白和/或基因家族的至少一个其他成员的表达水平被降低了。在这些方法中，如本文其他地方所述，所得表型是油酸积累的下降。[0098]在具体的实施例中，本文方法中公开的miRNA表达构建体降低了任何植物中受关注的任何靶序列或蛋白和/或基因家族的表达。在具体的实施例中，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物，在另外的实施例中，所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿，而单子叶植物为玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
[0099]在具体的方面，提供了方法，其中如果本文提供的miRNA是长度为21个核苷酸的，基因家族的两个或更多个序列中只有一个会被抑制。
[0100]任何适当的方法可用于测定来自相同蛋白和/或基因家族的两个或更多个序列表达降低的水平。例如，评估植物或植物部分中靶核酸表达降低，可通过多种方法诸如mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的Western印迹分析、或以编码的蛋白功能计的表型分析来实现。在一些实施例中，可分析其他植物副产品诸如油脂的水平作为两个或更多个序列表达水平降低的指示。靶核酸的表达产物可用多种方法中任一进行检测，其取决于产品的性质(例如Western印迹分析和和酶反应分析法)。
[0101]IV.公开的多核苷酸的活性变体
[0102]还涵盖了在组合物和方法中应用的多核苷酸的活性变体。例如，本文涵盖了任何miRNA表达构建体或其组分之一的活性变体，诸如miRNA前体主链、miRNA，或星序列(即SEQID NO:1-9和16)。“变体”是指基本上类似的序列。就多核苷酸而言，变体包括在多核苷酸的一个或多个内部位点有一个或多个核苷酸的缺失和/或插入，和/或在多核苷酸的一个或多个位点有一个或多个核苷酸的取代。如本文其他地方所详述，本文所公开的miRNA表达构建体、miRNA前体主链、miRNA和/或星序列的变体可保留所述miRNA表达构建体、miRNA前体主链、miRNA和/或星序列的活性。变体多核苷酸可包括合成来源的多核苷酸，诸如那些例如通过定点诱变生成的。一般来讲，本文所公开的miRNA表达构建体、miRNA前体主链、miRNA和/或星序列(即SEQ ID NO:1_9和16)的变体，与通过序列比对程序和本文其他地方所述参数确定的特定多核苷酸具有至少约60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性。
[0103]用于比对的序列比对方法是本领域熟知的。因此，能使用数学算法测定任意两个序列之间的序列同一性百分比。此类数学算法的非限制性例子是Myers和Miller (1988)CAB10S4:11-17 的算法；Smith 等人(1981)Adv.Appl.Math.2:482 的局部比对算法；Needleman 和 wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443-453 的全局比对算法；Pearson和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-2448 的局部搜寻比对方法；Karlin 和Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264 的算法，由 Karlin 和 Altschul 改进(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877 的。
[0104]能利用计算机实施这些数学算法，以比对序列、测定序列同一性。此类具体实施包括但不限于:在 PC / Gene 程序中的 CLUSTAL(可得自 Intelligenetics, Mountain View,California) ;ALIGN 程序(版本 2.0)和 GCG Wisconsin Genetics Software Package,版本 10 (可得自 Accelrys Inc, 9685Scranton Road, San Diego, California,USA)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。能够使用默认参数进行使用这些程序的比对。以下文献很好地描述了 CLUSTAL 程序=Higgins 等人(1988)Gene73:237-244(1988) ；Higgins 等人(1989)CAB10S5:151-153 ；Corpet 等人(1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90 ；Huang等人(1992)CAB10S8:155-65 ；以及 Pearson 等人(1994)Meth.Mol.Biol.24:307_331。Altschul 等人(1990) J.Mo 1.Biol.215:403 的 BLAST 程序基于 Karlin 和 Altschul 的算法(1990，参见上文)。可使用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索，得分=100，字长=12，以获取与本文提供的核苷酸序列同源的核苷酸序列。为了获取用于比对目的的空位比对，可利用 Gapped BLAST (BLAST2.0)，如 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res.25:3389。作为另外一种选择，可使用PS1-BLAST(BLAST2.0)进行重复搜索，它检测分子间的较远关系。参见 Altschul 等人(1997，参见上文)。当利用 BLAST、Gapped BLAST、PS1-BLAST 时，可使用相应程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默认参数。参见www.ncb1.nlm.nih.gov。也可通过检查进行手动比对。
[0105]除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10获得的值，使用以下参数:核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比使用50的空位权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；氨基酸序列的同一'丨生百分比和相似性百分比使用8的空位权重和2的长度权重，以及BL0SUM62计分矩阵。“等效程序”是指满足下列条件的任何序列比对程序:就任何正被讨论的两个序列而言，与GAP版本10生成的对应比对相比，所述序列比对程序生成具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同序列同一性百分比的比对。
[0106]单位、前缀和符号可以以其SI接受的形式表示。除非另外说明，核酸是以5'到 方向从左往右写；氨基酸序列是分别以氨基到羧基方向从左往右写。数值范围包括限定
范围数值的端值在内。在本文中氨基酸可用其通常已知的三字母符号或用IUPAC-1UB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以用其通常接受的单字母代码表示。把说明书作为一个整体时，上面定义的术语就定义得更全面。
[0107]本文所公开的方法和组合物的非限制性例子如下述:
[0108]1.能够被转录为RNA序列的分离或重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包含miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体包含:
[0109]a) miRNA前体主链，所述miRNA前体主链包含编码miRNA的第一多核苷酸片段和编码星序列的第二多核苷酸片段；
[0110]b)所述第一和所述第二多核苷酸片段与所述miRNA前体主链是异源的；
[0111]c)所述第一多核苷酸片段包含22-核苷酸(22-nt)，所述22-核苷酸(22_nt)具有与RNA水平待降低的靶序列足够互补的序列；
[0112]d)所述第二多核苷酸片段包含第一多核苷酸片段的互补序列，并且还比所述第一多核苷酸片段少至少I个核苷酸，其中22-nt miRNA是由所述miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA ;并且，
[0113]e)由所述miRNA表达构建体产生的所述22-nt miRNA能够降低所述祀序列和来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列mRNA水平，所述相同蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21_nt miRNA所降低(表达水平)。 [0114]2.实施例1的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段在所述第二多核苷酸片段的5'端。
[0115]3.实施例1的分离或重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸片段在所述第一多核苷酸片段的5'端。
[0116]4.实施例1-3分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链来自植物。
[0117]5.实施例4的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为单子叶植物。
[0118]6.实施例4的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为双子叶植物。
[0119]7.实施例5的分离或重组多核苷酸，其中所述单子叶植物为玉米。
[0120]8.实施例6的分离或重组多核苷酸，其中所述双子叶植物为大豆。
[0121]9.实施例1-4的分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链包含如SEQ IDNO:9或16中任一个所不的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:9或16具有至少90%序列同一性的序列，其中所述序列保留miRNA前体主链活性。
[0122]10.实施例1-8中任一个的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的成员。
[0123]11.实施例10的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ IDNO:2中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
[0124]12.实施例10的分离或重组多核苷酸，其中所述由所述miRNA表达构建体产生的miRNA产物包含SEQ ID NO:1中所示的序列。
[0125]13.实施例1-8中任一个的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码Λ 12脂肪酸去饱和酶2蛋白和/或基因家族的成员。
[0126]14.实施例13的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ IDNO:4中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:8中所示的序列。
[0127]15.实施例13的分离或重组多核苷酸，其中所述由所述miRNA表达构建体产生的miRNA产物包含SEQ ID NO:3中所示的序列。
[0128]16.重组DNA构建体，其包含实施例1_15中任一个的分离或重组多核苷酸。
[0129]17.实施例16的重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至分离或重组多核苷酸的启动子。
[0130]18.转化的植物细胞，其包含实施例1-15中任一个的分离或重组多核苷酸。
[0131]19.转化的植物，其包含实施例1-15中任一个的分离或重组多核苷酸。
[0132]20.实施例18或19的转化的植物细胞或植物，其中所述植物或植物细胞或植物为双子叶植物。
[0133]21.实施例20的转化的植物细胞或植物，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
[0134]22.实施例18或19的转化的植物细胞或植物，其中所述植物为单子叶植物。
[0135]23.实施例22的转化的植物细胞或植物，其中所述单子叶植物为玉米、甘蔗、小
麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
[0136]24.实施例19-23中任一个的转化的植物的种子。
[0137]25.降低细胞中来自相同蛋白和/或基因家族的至少两个序列的mRNA水平的方法，包括将实施例1-15中任一个的重组或分离多核苷酸、或实施例16-17的DNA构建体导入到所述细胞中，其中相对于所述多核苷酸未表达情况下所述至少两个序列中每一个的mRNA水平，所述多核苷酸的表达降低所述至少两个序列中每一个的mRNA水平。
[0138]26.实施例25的方法，其中如果所述miRNA为长度21个核苷酸，则两个或更多个序列中仅有一个的mRNA 水平会降低。
[0139]27.实施例25或26的方法，其中所述细胞为植物细胞。
[0140]28.实施例25-27中任一个的方法，其中所述miRNA前体主链包含如SEQ ID NO:9或16中任一个所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:9或16具有至少90%序列同一性的序列，其中所述序列保留miRNA前体主链活性。
[0141]29.实施例25-26中任一个的方法，其中所述靶序列编码肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的成员。
[0142]30.实施例29的方法，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:2中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
[0143]31.实施例30的方法，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQID NO:1中所示的序列。
[0144]32.实施例25-29中任一个的方法，其中所述靶序列编码Λ 12脂肪酸去饱和酶2蛋白和/或基因家族的成员。
[0145]33.实施例32的方法，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:4中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:8中所示的序列。
[0146]34.实施例33的方法，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQID NO:3中所示的序列。
[0147]35.实施例27-34中任一个的方法，其中所述植物为双子叶植物。
[0148]36.实施例35的方法，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
[0149]37.实施例27-34中任一个的方法，其中所述植物为单子叶植物。
[0150]38.实施例37的方法，其中所述单子叶植物为玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
[0151]
[0152]提供以下实例以示出受权利要求书保护的本发明，但本发明不受以下实例的限制。应当理解本文所述的实例和实施例仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。
[0153]实例I
[0154]设计人工mieroRNA序歹丨j[0155]能够沉默基因家族中多个基因的人工mieroRNA (amiRNA)可主要根据在Schwab R等人(2005)Dev Cell8:517-27中所述的规则进行设计，不同的是所述amiRNA序列为长度22个核苷酸。简而言之，amiRNA序列可具有位于5'端的“U”、位于第19核苷酸位点的“C”或“G”、以及位于第10核苷酸位点的“A”或“U”。对于人工miCToRNA设计的附加要求是用ZipFold 算法(Markham, N.R.和 Zuker, Μ.(2005) Nucleic Acids Res.33:w577~w581)计算amiRNA具有很高的自由Λ -G。任选地，在amiRNA的5'部分内可加入一对碱基对变化使得所述序列与靶序列相差一个核苷酸。
[0156]设计了 amiRNA (SEQ ID NO:1)以沉默GAS基因(对应这个amiRNA的DNA序列如SEQ ID N0:2 所示)。设计了另一个 amiRNA (SEQ ID NO:3)以沉默 FAD2-1 和 FAD2-2 (对应这个amiRNA的DNA序列如SEQ ID NO:4所示)。
[0157]实例2
[0158]设计人工星序列
[0159]“星序列”是前体RNA中碱基对与miRNA序列一起以形成不完全的茎结构的那些序列。可通过包含miRNA和内源性的星序列的内源性的前体结构与包含amiRNA和人工星序列的前体结构的比较来设计人工星序列。采用mfold(M.Zuker (2003)Nucleic Acids Res.31:3406-15 ;和 D.H.MatheWS，J.等人(1999) T.Mol.Biol.288:911-940)折叠所述内源性的前体。然后用amiRNA序列替换miRNA序列，并用除了移除了一个碱基的amiRNA的精确反向互补序列替换了内源性的星序列。这个碱基的移除在miRNA序列折叠时生成一个“鼓包”。发生改变的序列然后用mfol d折叠并目测比较初始结构和改变后的结构。如果必要的话，可将更多的改变导入人工星序列中以保持初始结构。
[0160]设计了人工星序列以沉默GAS基因(SEQ ID NO:5 ；SEQ ID NO:6是对应于这个人工星序列的DNA序列)。也设计了人工星序列以沉默FAD2-1和FAD2-2 (SEQ ID NO:7 ；SEQID NO:8是对应于这个人工星序列的DNA序列)。
[0161]实例3
[0162]将基因组mieroRNA前体转化成人工mieroRNA前体
[0163]基因组miRNA 前体基因(“主链”)，诸如在 US20090155909A1 (W02009 / 079548)和US20090155910A1(W02009 / 079532)中所述的那些，可用重叠聚合酶链反应转化为amiRNA，而所得的DNA可经完全测序然后克隆至能够转化的载体的合适的启动子下游。
[0164]作为另外一种选择，amiRNA可为市售合成的例如由Codon Devices (Cambridge,MA)、DNA2.0 (MenIOPark, CA)和 Genescript (Piscataway, NJ)。然后将合成的 DNA 克隆到一个能够转化大豆的载体中的合适启动子的下游。
[0165]如实例4和5中所示，也可使用In-Fusion?技术构建人工miRNA(Clontech,Mountain View, CA)。
[0166]实例 4
[0167]在大豆中牛成GAS amiRNA前体以沉默多个GAS某闵
[0168]将mieroRNA GM_396b前体(SEQ ID NO:9)改性以包括在所述星和mieroRNA序列两侧紧贴的Pme I位点，形成In-Fusion?预制mieroRNA GM_396b前体(SEQ ID NO:
10)。将这个序列克隆至KS332 (也被称为PHP27753)的Not I位点以形成In-Fusion?预制 mieroRNA GM_396b_KS332 质粒(SEQ ID NO:11)。[0169]所述mieroRNA GM_396b前体(SEQ ID NO:9)被用作聚合酶链反应模板，其引物如表1(SEQ ID NO:12和13)中所示。引物是按照Clontech提供的方案设计，在In-Fusion?重组反应后并不留有Pme I位点的任何位置。扩增的DNA (SEQ ID NO: 14)被重组至用Pme
I消化的 In-Fusion? 预制 mieroRNA GM_396b_KS332 质粒(SEQ ID NO:11)中。这是采用In-Fusion?试剂盒提供的方案进行的。所得质粒GM_396b_GAS C (22) / KS322(也被称为PHP46272)如图1所示并用SEQ ID NO:15表示。
[0170]实例5
[0171]在大豆中牛成FAD2amiRNA前体以沉默FAD2-1和FAD2-2
[0172]将mieroRNA GM-159前体(SEQ ID NO:16)改性以包括在所述星和mieroRNA序列两侧紧贴的Pme I位点，形成In-Fusion?预制mieroRNA GM-159前体(SEQ ID N0:17)。将这个序列克隆至KS332 (也被称为PHP27753)的Not I位点以形成In-Fusion?预制mieroRNAGM-159-KS332 质粒(SEQ ID NO: 18)。
[0173]所述mieroRNA GM-159前体(SEQ ID NO:16)被用作聚合酶链反应模板，其引物如表1 (SEQ ID NO:19和20)中所示。引物是按照Clontech提供的方案设计，在In-Fusion?重组反应后并不留有Pme I位点的任何位置。扩增的DNA(SEQ ID NO:21)被重组至用Pme
I消化的 In-Fusion? 预制 mieroRNA GM-159-KS332 质粒(SEQ ID NO:18)中。这是采用In-Fusion?试剂盒提供的方案进行的。所得质粒GM-159_FAD2_lb (22)/KS322 (也被称为PHP46271)如图2所示并用SEQ ID NO:22表示。
[0174]表1:用于In-Fusion11插入的引物
[0175]
【权利要求】
1.能够被转录为RNA序列的分离或重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包 含miRNA表达构建体，其中所述miRNA表达构建体包含: a)miRNA前体主链，所述miRNA前体主链包含编码miRNA的第一多核苷酸片段和编码星序列的第二多核苷酸片段； b)所述第一多核苷酸片段和所述第二多核苷酸片段与所述miRNA前体主链是异源的； c)所述第一多核苷酸片段包含22-核苷酸(22-nt)，所述22-核苷酸(22_nt)具有与RNA水平待降低的靶序列足够互补的序列； d)所述第二多核苷酸片段包含所述第一多核苷酸片段的互补序列，并且还比所述第一多核苷酸片段少至少I个核苷酸，其中22-nt miRNA是由所述miRNA表达构建体产生的丰度最高形式的miRNA ;并且 e)由所述miRNA表达构建体产生的所述22-ntmiRNA能够降低所述祀序列和来自相同蛋白和/或基因家族的至少一个其他序列的mRNA水平，所述相同蛋白和/或基因家族的成员不会被针对与22-nt miRNA相同的区域的21-nt miRNA所降低。
2.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段在所述第二多核苷酸片段的5'端。
3.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第二多核苷酸片段在所述第一多核苷酸片段的5'端。
4.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链来自植物。
5.根据权利要求4所述·的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为单子叶植物。
6.根据权利要求4所述的分离或重组多核苷酸，其中所述植物为双子叶植物。
7.根据权利要求5所述的分离或重组多核苷酸，其中所述单子叶植物为玉米。
8.根据权利要求6所述的分离或重组多核苷酸，其中所述双子叶植物为大豆。
9.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述miRNA前体主链包含如SEQID NO:9或16中任一个所示的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:9或16具有至少90%序列同一性的序列，其中所述序列保留miRNA前体主链活性。
10.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的成员。
11.根据权利要求10所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:2中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
12.根据权利要求10所述的分离或重组多核苷酸，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:1中所示的序列。
13.根据权利要求1所述的分离或重组多核苷酸，其中所述靶序列编码Λ12脂肪酸去饱和酶2蛋白和/或基因家族的成员。
14.根据权利要求13所述的分离或重组多核苷酸，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQ ID NO:4中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:8中所示的序列。
15.根据权利要求13所述的分离或重组多核苷酸，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:3中所示的序列。
16.重组DNA构建体，包含权利要求1的分离或重组多核苷酸。
17.根据权利要求16所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至所述分离或重组多核苷酸的启动子。
18.转化的植物细胞，包含权利要求1的分离或重组多核苷酸。
19.转化的植物，包含权利要求1的分离或重组多核苷酸。
20.根据权利要求18所述的转化的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
21.根据权利要求20所述的转化的植物细胞，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
22.根据权利要求18所述的转化的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
23.根据权利要求22所述的转化的植物细胞，其中所述单子叶植物为玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
24.根据权利要求19所述的转化的植物，其中所述植物为双子叶植物。
25.根据权利要求24所述的转化的植物，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
26.根据权利要求19所述的转化的植物，其中所述植物为单子叶植物。
27.根据权利要求26所述的转化的植物，其中所述单子叶植物为玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑麦。
28.权利要求19的转化的植物的种子。
29.降低细胞中来自相同蛋白和/或基因家族的至少两个序列的mRNA水平的方法，包括将权利要求1的重组或分离多 核苷酸导入到所述细胞中，其中相对于所述多核苷酸未表达情况下所述至少两个序列中每一个的mRNA水平，所述多核苷酸的表达降低所述至少两个序列中每一个的mRNA水平。
30.根据权利要求29所述的方法，其中如果所述miRNA的长度为21个核苷酸，则所述两个或更多个序列中仅有一个的mRNA水平会降低。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述细胞为植物细胞。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述miRNA前体主链包含如SEQID NO:9或16中任一个所不的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:9或16具有至少90%序列同一性的序列，其中所述序列保留miRNA前体主链活性。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶序列编码肌醇半乳糖苷合成酶(GAS)蛋白和/或基因家族的成员。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQID NO:2中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:1中所示的序列。
36.根据权利要求29所述的方法，其中所述靶序列编码Λ12脂肪酸去饱和酶2蛋白和/或基因家族的成员。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一多核苷酸片段包含SEQID NO:4中所示的序列，并且所述第二多核苷酸片段包含SEQ ID NO:8中所示的序列。
38.根据权利要求37所述的方法，其中由所述miRNA表达构建体产生的所述miRNA包含SEQ ID NO:3中所示的序列。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物、向日葵、棉花或苜蓿。
41.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述单子叶植物为玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱或黑 麦。
【文档编号】C12N15/11GK103547673SQ201280022406
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年5月9日 优先权日:2011年5月9日
【发明者】B.麦戈尼格勒 申请人:纳幕尔杜邦公司