一种改变植物性状的方法

专利名称：一种改变植物性状的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种改变植物性状的方法。
背景技术：
现有技术中，普遍采用转基因技术来改变植物的性状或表型，获得植物的新品种。 尽管现有技术中植物的转基因技术已经被广泛地研究和应用，经典的例如利用农杆菌携带目的基因，将之转化植物的愈伤组织，该技术对于许多种类的植物均是有用的，例如模式植物拟南芥、经济作物水稻、小麦、棉花、烟草等等。人们却发现，对豆科作物等其它一些植物采用常规的转基因技术(如农杆菌法)以获得转基因植物非常困难。目前还没有特别高效的针对豆科作物的转基因技术，这大大限制了豆科作物的品种改良。此外，由于可能存在对健康的影响，一些转基因植物目前还不能被很多人接受。豆科作物为种子植物中很大的一个科，分布很广。例如，作为豆科作物的一种，紫花苜蓿是一种分布广泛的豆科牧草，还可以作为饲料和绿肥以及人们日常食用的蔬菜。干旱是影响豆科作物正常生长以及产量的主要因素之一。因此，目前迫切需要提高豆科作物的抗旱能力，从而扩大豆科作物的种植面积，提高产量。因此，本领域迫切需要研究一种可方便、有效地改变植物性状或表型的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种改变植物性状的方法。一种改变植物或作物性状或表型的方法，所述方法包括(1)提供一种重组根瘤菌，所述的重组根瘤菌细胞中含有外源基因的表达盒(游离于基因组之外，也可以整合到基因组中)；所述的外源基因是改变植物性状相关基因，或是被表达后能形成改变植物性状相关成分的基因；和(2)将重组根瘤菌与植物接触共生，从而所述的外源基因(在植物体内，特别是根瘤内)被表达并被转运到植物的细胞、组织或器官内；或者所述的外源基因(在植物体内， 特别是根瘤内)被表达并形成改变植物性状相关成分(如激素，生长素，细胞分裂素等)，该成分被转运到植物的细胞、组织或器官内。在一个优选例中，所述的重组根瘤菌的出发菌株选自(但不限于)苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv. viciae) > 花生根瘤菌(Bradyrhizobium sp. arachis)、茎瘤固氮根瘤菌(田菁(茎瘤)根瘤菌) (Azorhizobium caulinodans)，埃氏慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)(Bradyrhizobium elkanii)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、华癸中生根瘤菌(紫云英) (Mesorhizobium huakuii)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)，埃特里根瘤菌(菜豆)(Rhizobium etli)、豌豆根瘤菌(菜豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar
4phaseoli)、豆宛豆木艮瘤菌(三叶草生物型)(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii) > 甘草 瘤菌(Mesorhizobium glycyrrhiza)或Jtl^t艮瘤菌(Mesorhizobium astragalus)。在另一优选例中，所述的植物是能与根瘤菌共生的植物。在另一优选例中，所述的植物选自豆科植物(豆科作物)。在另一优选例中，所述的豆科植物选自苜蓿、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、 蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。在另一优选例中，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因、赤霉素3合成酶基因、古巴焦磷酸合成酶基因，内根-贝壳杉烯合成酶基因，内根-贝壳杉烯19-氧化酶基因，内根-贝壳杉烯酸7 β羟化酶基因，GA12-醛合成酶基因， GA-7-氧化酶基因，GA-13-羟化酶基因，GA20-氧化酶基因，GA3 β羟化酶基因，GA2-氧化酶基因或细胞色素Ρ450单加氧酶基因。在另一优选例中，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因。在本发明的另一方面，提供一种重组根瘤菌，其细胞中含有外源基因的表达盒；所述的外源基因是改变植物性状相关基因，或是被表达后能形成改变植物性状相关成分(如植物细胞分裂素)的基因。在另一优选例中，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因和赤霉素3合成酶基因、古巴焦磷酸合成酶基因，内根-贝壳杉烯合成酶基因，内根-贝壳杉烯19-氧化酶基因，内根-贝壳杉烯酸7 β羟化酶基因，GA12-醛合成酶基因， GA-7-氧化酶基因，GA-13-羟化酶基因，GA20-氧化酶基因，GA3 β羟化酶基因，GA2-氧化酶基因或细胞色素Ρ450单加氧酶基因。在另一优选例中，所述的重组根瘤菌表达异戊烯基转移酶，所述的异戊烯基转移酶能合成植物细胞分裂素。在另一优选例中，所述的植物细胞分裂素是反式玉米素。在另一优选例中，所述的重组根瘤菌表达Y-氨基丁酸合成酶，所述的Y-氨基丁酸合成酶能合成Y-氨基丁酸。在本发明的另一方面，提供所述的重组根瘤菌的制备方法，所述方法包括将表达载体转移入根瘤菌中；其中，所述的表达载体中含有外源基因的表达盒，所述的外源基因是改变植物性状相关基因或是被表达后能形成改变植物性状相关成分的基因。在一个优选例中，采用辅助菌(优选选自大肠杆菌(Escherichia coli)MT616/ PRK600和MM294/pRK20i;3)进行辅助接合，从而将表达载体转移入根瘤菌中。在另一优选例中，所述的表达载体选自(但不限于)pSRK-km、pMB393和 PPHU231。在本发明的另一方面，提供一种所述的重组根瘤菌的用途，用于改变植物(或作物)性状。在另一优选例中，所述的重组根瘤菌表达异戊烯基转移酶或Y-氨基丁酸合成酶，该重组根瘤菌用于提高植物(优选豆科作物)的抗旱能力，提高植物的固氮酶活力，促进植物的生长，提高植物的生物量，提高植物组织中细胞分裂素含量，提高植物组织的水份含量，降低植物组织(如叶片)中过氧化物的含量，提高植物组织(如叶片)中抗氧化酶类基因的表达或提高植物抗病虫害(铃夜蛾、沙柳木蠹蛾和番茄叶霉菌)能力。在本发明的另一方面，提供一种改变植物(或作物)性状的组合物，包括(1)有效量的所述的重组根瘤菌；和(2)农药学上可接受的载体。在一个优选例中，所述的组合物是肥料。在另一优选例中，所述的组合物为选自下组的剂型可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。在另一优选例中，所述组合物还含有选自下组的物质表面活性剂、展着剂、填充物质、或根瘤菌活性促进剂。在本发明的另一方面，提供一种制备改变植物(或作物)性状的组合物的方法，所述方法包括将有效量的所述的重组根瘤菌与有效量的农药学上可接受的载体混合。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1.苜蓿根瘤菌工程菌株的构建流程示意图。图2.接种工程根瘤菌的紫花苜蓿的生物量与结瘤固氮能力。A，Sioot，接种根瘤菌的紫花苜蓿地上部分的生物量(生长至第四周的茎和叶，纵坐标单位为克)；plant，接种根瘤菌的紫花苜蓿总的生物量(纵坐标单位为克)；B，接种根瘤菌的紫花苜蓿上形成的总瘤数；C，接种根瘤菌的紫花苜蓿上形成的根瘤的固氮酶活性(单位为[nmol乙烯]/ nmol[乙炔]/g植物的总生物量)。WT，接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector) ；LMG202，接种苜蓿根瘤菌工程菌株。图3.接种工程根瘤菌的紫花苜蓿对干旱的耐受能力测试。A，未经干旱处理接种根瘤菌的紫花苜蓿(生长至第4周)；B,经过干旱处理4天接种根瘤菌的紫花苜蓿；C，经过干旱处理6天接种根瘤菌的紫花苜蓿；D，经过干旱处理6天再重新浇水后第2天的接种根瘤菌的紫花苜蓿。WT，接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector) ；LMG202，接种苜蓿根瘤菌工程菌株。图4.大豆根瘤菌工程菌株的构建流程示意图。图5.接种工程大豆根瘤菌LMG102增强了栽培大豆的抗旱性。左侧植株为接种工程大豆根瘤菌LMG102的大豆植株；右侧植株为接种野生型大豆根瘤菌(慢生型大豆根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum/pvector)白勺大豆植株0图6.苜蓿中华根瘤菌处理的紫花苜蓿叶片中细胞分裂素(CK)含量。接种工程苜蓿中华根瘤菌LMG202的紫花苜蓿叶片中CK含量较接种携带空载体苜蓿根瘤菌的CK含量明显增加。图7.接种工程苜蓿根瘤菌的紫花苜蓿的水分含量。A.干旱处理前没有明显差异；
B.干旱处理后，产生差异。Sioot，紫花苜蓿地上部分的水份含量；whole，接种根瘤菌的紫花苜蓿总的水份含量；root，紫花苜蓿根的水份含量。纵坐标单位百分数(％)。图中CK指对照植株即接种携带空载体苜蓿根瘤菌的紫花苜蓿植株。图8. PCR检测IPT基因在根瘤菌中表达情况。以rpsF (苜蓿中华根瘤菌核糖体蛋白S6基因)的表达作为阳性对照。图中CK指携带空载体的野生型苜蓿中华根瘤菌。A.自生状态下的根瘤菌；B.共生状态下的根瘤菌。图9.经干旱处理的紫花苜蓿叶片的过氧化物DAB染色。接种工程苜蓿中华根瘤菌LMG202的紫花苜蓿叶片中过氧化物含量明显降低。图10、紫花苜蓿叶片的抗氧化酶的表达。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，意外地发现可应用一些植物与根瘤菌形成共生关系的特殊性质，在植物根瘤细胞内部定殖的根瘤菌中表达外源基因(如异戊烯基转移酶基因， 其可合成植物细胞分裂素(如反式玉米素))，然后通过植物体内已经存在的运输系统将外源基因的表达产物或由该外源基因的表达而形成的成分转运到植物的其它组织或器官，从而改变植物的性状或表型。植物如本文所用，所述的“植物”是能与根瘤菌共生的植物。本领域人员清楚哪些植物是能够与根瘤菌共生的。多种植物都可形成根瘤结构，这种根瘤结构是相同或相似的，并且都能与根瘤菌共生。作为本发明的一种实施方式，所述的植物选自豆科植物(豆科作物)。其中豆科植物种类很多，本发明的方法适用于任何具有根瘤结构或可形成根瘤结构且能够与根瘤菌形成共生关系的豆科作物。例如，所述的豆科植物包括如下食用类如大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、赤豆、豇豆、菜豆、藕豆、木豆、落花生等；饲料类如紫云英、苜蓿、蚕豆、翘摇等；材用类如合欢、黄檀、皂角、格木、红豆、槐等；染料类如马棘、槐花、木蓝、苏木等；树胶等；树脂类如阿拉伯胶、木黄芪胶、柯伯胶等；纤维类如印度麻、葛藤等；油料类如大豆、落花生等。应理解，在本发明的技术方案的提示下，本领域人员易于想到变换各种豆科作物的种类而实现相同或相似的技术效果，这些变换形式也包含于本发明。外源基因本发明对于外源基因没有特别的限制，只要其能够被根瘤菌表达，并且自身能够改变植物的性状或表型，或表达后能够形成改变植物性状相关成分。所述的外源基因可以是结构基因。合适的外源基因例如但不限于异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因和赤霉素3合成酶基因等。此外，外源基因还包括其变体，该变体表达的蛋白与该外源基因表达的蛋白具有相同的功能。其通过插入或删除部分碱基，进行随机或定点突变等来获得。所述的外源基因的表达盒还可包括操作性与所述外源基因相连的启动子等元件。作为本发明的一种实施方式，所述的源基因是异戊烯基转移酶基因。异戊烯基转移酶(IPT)是一种可指导细胞分裂素合成的催化酶，参与调控植物发育、形态和生理过程， 在调控植物组织中细胞分裂素水平方面具有重要作用。其氨基酸序列例如GenBank登录号 AAK90970. 2所示；其编码基因的序列例如GenBank登录号AE007871. 2所示。所述的异戊烯基转移酶可在根瘤菌中合成植物细胞分裂素，特别是反式玉米素， 所述的反式玉米素(为小分子)是一种细胞分裂素，可调控细胞分裂及影响多种发育事件， 例如枝条(shoot)的发育、库强、根的分支、枝条顶端优势的控制、叶的发育、叶绿体发育和叶片衰老等。其它可用的外源基因包括但不限于Y-氨基丁酸合成酶，赤霉素3合成酶古巴焦磷酸合成酶，内根-贝壳杉烯合成酶，内根-贝壳杉烯19-氧化酶，内根-贝壳杉烯酸7 β羟化酶，GA12-醛合成酶，GA-7-氧化酶，GA-13-羟化酶，GA20-氧化酶，GA3 β羟化酶，GA2-氧化酶或细胞色素Ρ450单加氧酶等的编码基因。Y-氨基丁酸合成酶是一种谷氨酸脱羧酶，是以谷氨酸为底物，合成Y-氨基丁酸的关键酶，参与植物与环境之间的信息交流。其氨基酸序列例如GenBank登录号 ΑΑΒ18493. 1所示；其编码基因的序列例如GenBank登录号Μ84024. 1所示。赤霉素3合成酶是一种参与植物生长调节剂——赤霉素生物合成的关键酶。其氨基酸序列例如GenBank登录号AAC39506. 1所示；其编码基因的序列例如如GenBank登录号 AF047720. 1 所示。古巴焦憐酸合Bl (entcopalyl pyrophosphate synthase，CPS)禾口内*艮一贝壳杉;I；希合酶(ent-kaurene synthase, KS)也是赤霉素生物合成的关键酶，在赤霉菌中CPS和KS是以双功能蛋白复合体形式存在，其氨基酸序列例如GenBank登录号CAA75M4. 1，Q9UVY5. 1 或ABC46413. 1所示；在高等植物中，其氨基酸序列例如GenBank登录号AAA73960. 1， Q0E088. 1，BAH56558. 1，BAH56559. 1，BAH56560. 1，BAD91286. 1 或 Q947C4. 1 等所示。另外，内根-贝壳杉烯19-氧化酶，内根-贝壳杉烯酸7β羟化酶，GA12-醛合成酶， GA-7-氧化酶，GA-13-羟化酶，GA20-氧化酶，GA3 β羟化酶，GA2-氧化酶或细胞色素Ρ450单加氧酶等也是赤霉素生物合成过程中的酶(应用与环境生物学报2008，14 (4) :571 577， 赤霉素生物合成途径及其相关研究进展；植物学通报2002，19(2) 137 149植物赤霉素生物合成和信号传导的分子生物学)，也可以用于本发明。细胞分裂素、Y-氨基丁酸、赤霉素均为小分子化合物，为植物生长调解剂。与 3-吲哚乙酸在植物中主动运输的机制不同，它们在植物中是被动运输的。而且，根瘤菌本身无法合成细胞分裂素、Y-氨基丁酸和赤霉素。编码以上各蛋白(酶)的基因均可用于本发明。所述的蛋白包括全长的蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。例如，所述的异戊烯基转移酶的氨基酸序列可以与 GenBank登录号AAK90970. 2所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的蛋白也包括在本发明中。以上蛋白或它们的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响它们的活性或保留了它们的部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。
任何一种以上蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50 %的全长蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的上述蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的蛋白。所述经过修饰或改良的蛋白可以是一种蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的蛋白可以是与天然存在的蛋白具有较小的共同点，但也能在根瘤菌中合成改变植物性状相关的成分(如细胞分裂素)，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响上述蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。本发明还包括了编码上述蛋白的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。本发明还包括了包含编码所述蛋白或其生物活性片段的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。根瘤菌根瘤菌(rhizobia)是与可形成根瘤结构的植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌是通过植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。例如，豆科作物的根瘤中，有能固氮的根瘤菌与之共生。根瘤菌将空气中的氮转化为植物能吸收的含氮物质，如氨，而植物为根瘤菌提供有机物。尽管根瘤菌通过侵入植物的组织，与植物共生，然而其并非如农杆菌那样，可将携带的任意外源基因良好地转化入植物中。目前本领域人员也无从了解根瘤菌是否可表达外源基因(如异戊烯基转移酶基因)以及是否可形成对于植物的影响(如合成植物细胞分裂素并将植物细胞分裂素转移入植物的组织或器官中)。而本发明人第一次揭示了根瘤菌在与植物共生后，可表达外源基因并有效合成和输送外源基因表达产物或成分进入植物的组织或器官中。基于本发明人的新发现，本发明提供了一种重组根瘤菌，其细胞中含有外源基因 (如异戊烯基转移酶基因)的表达盒，从而能表达外源基因。当所述的外源基因是异戊烯基转移酶基因时，所述的异戊烯基转移酶能够在根瘤菌内合成细胞分裂素如玉米素(特别是反式玉米素)，玉米素能够被根瘤菌输送给与之共生的植物，并改变植物性状，特别是增强的植物抗逆性。当所述的外源基因是Y-氨基丁酸合成酶基因时，所述的Y-氨基丁酸合成酶能够在根瘤菌内合成Y -氨基丁酸，能够增强植物的抗病能力。如本文所用，所述的“重组根瘤菌”可与“根瘤菌工程菌株”或“工程根瘤菌” 互换使用，均是指细胞中含有外源基因的表达盒的根瘤菌。所述的重组根瘤菌的出发菌株(即重组操作前的原始菌株)可以是多种根瘤菌，例如选自但不限于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium Ieguminosarum bv. viciae)艮瘤菌(Bradyrhizobium sp. arachis)lif (Azorhizobium
caulinodans)，埃氏慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)(Bradyrhizobium elkanii)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)，埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、 豆|5豆 瘤菌(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli)、豆豆 f艮瘤菌(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii)、甘草f艮瘤菌(Mesorhizobium glycyrrhiza)或黄瘤菌(Mesorhizobium astragalus) 0也可根据植物的具体种类来选择合适的根瘤菌，这是本领域技术人员所已知的。本发明还提供了所述的重组根瘤菌的用途，用于改变植物的性状或表型。本发明还提供了所述的一种重组根瘤菌的用途，该重组根瘤菌含有外源的异戊烯基转移酶基因，其可用于提高植物抗旱能力、固氮酶活力，促进植物生长，提高植物的生物量，提高植物组织中细胞分裂素含量，提高植物组织的水份含量，降低植物组织(如叶片) 中过氧化物的含量，提高植物组织(如叶片)中抗氧化酶类基因的表达或提高植物抗病虫害(如铃夜蛾、沙柳木蠹蛾和番茄叶霉菌)能力。在参考了本发明的方法后，本领域技术人员可以通过常规的细胞生物学技术大量地生产或培养出所述的重组根瘤菌。生产重组根瘤菌的方法通常是将表达载体转移入根瘤菌中，所述的表达载体中含有外源基因的表达盒。较佳地，为了提高转移的效率，采用辅助菌进行辅助接合，从而将表达载体转移入根瘤菌中。所述的辅助菌可选自大肠杆菌 (Escherichia coli)MT616 和 MM294/pRK2013 等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有外源基因的表达盒的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的外源基因的转录本可有效连接到载体中的适当启动子上。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子或增强子。改变植物性状的方法本发明提供了一种改变植物性状的方法，包括将重组根瘤菌与植物接触共生，从而所述的外源基因被表达并被转运到植物的细胞、组织或器官内；或者所述的外源基因被表达并形成改变植物性状相关成分，该成分被转运到植物的细胞、组织或器官内。作为本发明的一个实施方式，提供了一种提高豆科作物抗旱能力、固氮酶活力或促进豆科作物生长的方法，包括将豆科作物与有效量的可表达异戊烯基转移酶的重组根瘤菌接触，从而植物细胞分裂素(特别是反式玉米素)被转运到豆科作物的细胞、组织或器官内。植物的各种组织和细胞均可与所述的重组根瘤菌接触(从而根瘤菌被接种上去)，例如植物的种子和根系。在本发明的一个优选例中，将所述的重组根瘤菌配制成菌液(介质上生理盐水)形式，通过浸泡的方法接种到植物的种子上。肥料制剂本发明提供了一种改变植物性状的组合物，其中含有有效量的所述的重组根瘤菌，以及余量的农药学上可接受的载体。较佳地，所述的组合物是肥料。本发明中，术语“含有，，表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。 因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。本发明中，“农药学上可接受的”的成分是适用于农业用途而对人或其它动物、植物没有过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。本发明中，“农药学上可接受的载体”是用于将本发明的重组根瘤菌传送给植物的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持重组根瘤菌生物活性的载体。所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于可湿粉剂，可乳化浓缩物， 水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的重组根瘤菌在保持全部或部分活性的前提递送到植物植株或种子上的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为本发明的优选方式，所述组合物是溶液、液体喷洒剂、或喷雾剂。在本发明中，所述的农药学上可接受的载体还可包括辅剂。所述的辅剂是一种辅助成分，在组合物中起辅助调节功能，比如其可以是一种表面活性剂、附着助剂或其它类型助剂。浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20_90wt %，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0. 00005-0. 5wt%。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如杀虫剂或其它肥料。本发明的组合物可含有IO4-IO12个重组根瘤菌/克(mL)组合物；更优选的，含有 IO6-IOltl个重组根瘤菌/克(mL)组合物。在制备组合物时，合适的固体稀释剂包括但不限于硅藻土，玉米壳，磷酸三钙，软木粉，高岭土、膨润土或硅镁土等粘土，和水溶性聚合物。此外，固体组合物还可以含有一种或多种相容性润湿剂，分散剂，乳化剂或色素， 这些成分在固态时也可起稀释剂的作用。这样的固体组合物可以是粉剂，颗粒剂或可湿粉剂的形式。通常通过研磨获得粉剂，通过造粒或压片获得颗粒剂、片剂或砖型剂。液体组合物的形式可以是溶液，悬浮液和乳液，也可以将其包在天然或合成聚合物中，并可以包含润湿剂、分散剂或乳化剂。这样的乳液、悬浮液或溶液可用水性、有机或水-有机稀释剂来制备水溶性聚合物(以及上述稀释剂的混合物)。此外，所述稀释剂中可含有例如以上所述离子型或非离子型的润湿剂、分散剂或乳化剂或它们的混合物。各种制剂的原理都是已知的，并在例如以下文献中有所描述 ffinnacker-Kuchler, "Chemische Technologie “化学技术，Vol. 7, C. Hauser Verlag Munich，第4版，1986 ；van Valkenburg，“农药剂型”，Marcel Dekker N. Y.，第2版，1972-73 ； K. Martens, “喷雾干燥手册”，第 3 版，G. Goodwin Ltd. London。
用于本发明组合物的所需的配制辅剂，(例如惰性物质，表面活性剂，溶剂和其他添加剂)，也是已知的，其描述例如=Watkins“杀虫粉剂稀释剂和载体手册”第2版，Darland Books, Caldwell N. J. ；H. v. Olphen，“粘土胶体化学导引”第 2 版，J. Wiley & Sons, N. Y., Marsden，“溶剂指南”第 2 版，hterscience，N. Y. 1950 ；McCutcheon' s，“除垢剂和乳化剂年刊”，MC Publ. Corp.，Ridgewood N. J. ；Sisley 和 Wood，“表面活性剂百科全书”，Chem. Publ. Co. Inc. , N. Y. 1964 ；Schonfelt, "Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte，，表面活性环氧乙烧力口成产物，Wiss. Verlagsgesell. , Stuttgart 1976 ；Winnacker-Kuchler, "Chemische Technologie"化学技术，Vol. 7，C. Hauser Verlag Munich，第 4 版，1986。可湿粉剂可均勻分散于水。除活性物质之外，可湿粉剂还可包含润湿剂，分散剂， 稀释剂等无环境公害的物质。粉剂的制备可以是将活性物质与精细粉碎后的滑石、高岭土、膨润土之类天然粘土或硅藻土等固体物质一同研磨。颗粒剂的制备可以是用活性物质喷涂吸附于惰性物质颗粒，或将活性物质溶液通过粘合剂(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠，或矿物油)施加于载体(例如砂、高岭土或惰性物质颗粒)表面。如果欲与化肥混合施用，则可将合适的活性物质象制备化肥颗粒那样制备成颗粒。本发明的主要优点(1)本发明首次提出可以利用根瘤菌与可形成根瘤的植物共生，将重组表达的外源基因表达产物或因外源基因表达而形成的成分输送到植物的组织或器官中，从而改变植物的性状或表型。(2)本发明第一次揭示根瘤菌在与植物共生后，可表达异戊烯基转移酶并有效合成和输送植物细胞分裂素，特别是反式玉米素(小分子化合物)进入植物的组织或器官中。 克服了常规的植物转基因技术难以应用于豆科作物的技术难题。(3)由于可能存在对健康的影响，转基因植物目前还不能被很多人接受。而本发明提供了一种无需制备转基因植物即可该便植物性状或表型(如提高植物抗旱能力)的新方法，满足了人们对于环保以及食品安全的要求。(4)发明的重组根瘤菌繁殖方便，成本低廉，可以制成生物肥料，特别是种衣剂，大规模地应用到农牧业生产中。(5)本发明的重组根瘤菌能够特异性与可形成根瘤的植物共生，而对其它动物或植物都没有可见的毒害，是一种安全环保的产品。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、表达异戊烯基转移酶的苜蓿根瘤菌工程菌的构建设计一对靶向根癌农杆菌异戊烯基转移酶基因阅读框架的寡聚核苷酸引物，序列如下正向5，-GCTCATATGTTACTCCATCTCATCTACGG-3，，和反向5，-CAGTCTAGAGTGCAATACTT GTAACAGGATCCGTAG-3’。
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以 Agrobacterium tumefaciens C58 pTiC58 (参见 Danhorn T, Hentzer M, Givskov M, Parsek MR, Fuqua C. Phosphorus limitation enhances biotilm formation of the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens through the PhoR-PhoB regulatory system. J Bacteriol. 2004,186(14) :4492-501,由 Fuqua 博士提供)为模板，通过PCR扩增，获得目标DNA片段；经过限制性内切酶XbaI和NdeI处理后，克隆至表达载体 pSRK-Km (参见 Khan SR, Gaines J, Roop RM 2nd, Farrand SK. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraMexpression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 2008,74(16) :5053-62 ；由 Farrand 博士提供)的 Iac 启动子下游，获得重组质粒PSSJ003 ；通过三亲本接合(辅助菌为MT616/pRK600(参见 Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Leigh JA, Signer ER, Walker GC. Proc Natl Acad Sci USA. 1985,82(18) 6231-5 ；由Walker博士提供)，转移至野生型苜蓿根瘤菌Sinorhizobium meliloti Rml021(参见Leigh等，1985)中，获得工程菌株LMG202。构建过程见图1。实施例2、根瘤菌工程菌LMG202对紫花苜蓿固氮根瘤形成的影响将紫花苜蓿(Medicago sativa Siangdong，购自山东农科院)种子进行表面消毒以后，与生理盐水(浓度0. 85% (w/v))重悬的根瘤菌LMG202(含有IO8个根瘤菌/ml)混合在一起浸泡0. 5小时，再播种于经过消毒的趾石珍珠岩人工土壤中，置于人工气候室中发芽生长至第4周，倒掉人工土壤，洗净植株，观察并统计根瘤数目，测定固氮酶活性。以接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector)的紫花苜蓿为对照。固氮酶活性测定方法如下收集10棵紫花苜蓿根系(子叶以下)，置于一个10毫升的玻璃瓶，盖紧瓶塞，用注射器注入1毫升乙炔，28°c，反应30分钟，吸取100微升气体， 通过气相色谱仪(Gc961)分析气体的组成成分，其中载气为氮气，柱压为0. 1兆帕，柱温为 60°C，使用氢离子火焰监测器。通过计算乙烯的平均含量，来确定固氮酶活性大小。结果发现，接种根瘤菌工程菌株LMG202的紫花苜蓿，形成的有效(红色)或者固氮)根瘤数明显减少(下降了 18. 9%，图2B)，红色根瘤比接种携带空载体苜蓿根瘤菌所诱导的略为增大，根瘤的固氮酶活力明显提高(工程菌是WT的2. 2倍，图2C)。因此，根瘤菌工程菌LMG202可以诱导紫花苜蓿形成较少的固氮根瘤，固氮酶活力明显提高。实施例3、根瘤菌工程菌LMG2促进紫花苜蓿生长将紫花苜蓿种子进行表面消毒以后，与生理盐水(0.85% (w/v))重悬的根瘤菌 LMG202(含有IO8个根瘤菌/ml)混合在一起浸泡0. 5小时，再播种。以接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector, WT)的紫花苜蓿为对照。在种植28 天后，分别对接种根瘤菌工程菌LMG202和接种携带空载体苜蓿根瘤菌(WT)的紫花苜蓿的茎叶和根系的鲜重，分别进行了称量和统计，发现LMG202处理的植株生物量高于WT株(茎叶和总的鲜重分别增加了 5. 8和10. 9%，图2A)。因此，工程菌株LMG202具有促进紫花苜蓿生长的能力。因此，接种根瘤菌工程菌LMG202的紫花苜蓿，4周后的生物量比接种携带空载体苜蓿根瘤菌的紫花苜蓿显著提高。实施例4、接种根瘤菌工程菌LMG202的紫花苜蓿抗旱能力显著增强将紫花苜蓿种子进行表面消毒以后，与生理盐水(0.85% (w/v))重悬的根瘤菌 LMG202(含有IO8个根瘤菌/ml)混合在一起浸泡0. 5小时，再播种。以未接种根瘤菌的紫花苜蓿为对照。在紫花苜蓿生长过程，每周浇Jenson营养液2次，每次80ml。从第3周开始，进行干旱耐受试验。干旱耐受试验开始以后，不再浇水或者营养液，直至发现植株枯萎为止。在试验开始后的第3天，接种携带空载体苜蓿根瘤菌(WT)的植株开始枯萎，第4天就全部枯萎；而接种工程菌株LMG202的紫花苜蓿，到4天才出现轻微的枯萎现象，直到第6 天才大部分枯萎。重新浇水后第2天，接种携带空载体苜蓿根瘤菌的植株仍全部枯萎，无法恢复，而接种工程根瘤菌的植株则全部或者大部分恢复生长(见图3)。以上实验均有两个平行并重复3次以上。实施例5、接种根瘤菌工程菌LMG102的大豆的抗旱能力验证本发明人应用组成型Iac启动子(Ptrp)驱动IPT基因的表达也获得类似的抗旱效果。表达异戊烯基转移酶的大豆根瘤菌工程菌的构建如前述实施例1的方法获得重组质粒PSSJ003 ；通过电转，转移至慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobium japonicum(参见 Mesa S, Reutimann L, Fischer HM, Hennecke H.Posttranslational control of transcription factor FixK2, a key regulator for the Bradyrhizobium japonicum-soybean symbiosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2009,106 (51) :21860-5;由 Hermecke博士提供)中，获得工程菌株LMG102 (图4)。如前述实施例4所述的方法将该根瘤菌与大豆种子接触，并将接种后的大豆种子种植于土壤中，进行干旱耐受试验。干旱耐受试验的处理条件是每周浇水一次，每次每盆植物浇水80ml，从第四周开始不再浇水，进行持续的极端干旱处理。温室的温度23士 1°C，每天光照16小时，黑暗8 小时。至干旱处理5天后观察植物抗旱的效果。结果如图5，LMG102菌株与苜蓿根瘤菌工程菌类似，具有促进宿主植物抗旱的效^ ο实施例6、接种根瘤菌工程菌LMG202的紫花苜蓿叶片中细胞分裂素(CK，玉米素)
含量变化将紫花苜蓿种子进行表面消毒以后，与生理盐水(0.85% (w/v))重悬的根瘤菌 LMG202 (含有IO8个根瘤菌/ml)混合在一起浸泡0. 5小时，再播种于经过消毒的趾石珍珠岩人工土壤中，置于人工气候室中发芽生长至第4周，倒掉人工土壤，洗净植株。以接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector)的紫花苜蓿为对照。CK提取方法如下取0. 4g植物鲜样于液氮中研磨成粉末，加提取液(甲醇水甲酸=15 4 1， 色谱纯，于-20°C预冷)继续研磨成勻浆，转移至离心管中，置于-20°C浸提过夜，次日离心， 收集上清，用提取液定容至2mL。经0.22 μ m滤膜过滤后，用于色谱分析(参考Journal of Chromatography A,2002, (950) :21-29 ；nature protocols,2010,5 (6) :986-992)。CK 测定feif tt Zorbax extend_C18 4. 6*50mm 1. 8um ；
进样量5ul;流速0. 2ml/min ；流动相A= 0. 1%FA H2O B = 0. 1 % FA MeOH, from 0_2min B 30% > 20minl00% > 22min 100%, > 25min 30%，在!35min 结束；检测波长:210,254，280，320，360，226nm ；质谱扫描范围50-400 ；=Nebulizer pressure 40psig, drying gas N2 350C 9L/min, ESI ；Vcap 3500V ；毛细管电压:fragmentor 160v, skimmer 65V, Oct RF Vpp750V ； Η δΙΙ ζ :With negative ms scan mode 2GHzExt Dyn(1700)。图6显示，相对于对照(接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector)的紫花苜蓿)，接种了苜蓿中华根瘤菌LMG202的紫花苜蓿叶片中细胞分裂素的含量增加18%。实施例7、接种根瘤菌工程菌LMG202的紫花苜蓿水份含量变化如实施例6的方法制备接种根瘤菌工程菌LMG202的紫花苜蓿，以接种携带空载体苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021/pvector)的紫花苜蓿为对照。干旱处理过程为将紫花苜蓿种子进行表面消毒以后，与生理盐水(0.85% (w/ ν))重悬的根瘤菌LMG202(含有IO8个根瘤菌/ml)混合在一起浸泡0. 5小时，再播种。以未接种根瘤菌的紫花苜蓿为对照。在紫花苜蓿生长过程，每周浇Jenson营养液2次，每次 80ml。从第3周开始，不再浇水或者营养液，直至植物叶片出现萎蔫。对没有进行干旱处理的接种植株以及干旱处理5天的接种植物，先分别称量植株鲜重，然后将植株包裹在牛皮纸袋中65°C过夜烘干，称量干重，鲜重减去干重即是植株的含水量。接种工程苜蓿根瘤菌的紫花苜蓿的水分含量与接种携带空载体苜蓿根瘤菌的植株的区别请见图7。干旱处理前没有明显差异；干旱处理后，接种工程菌的植物，水分含量较对照植物高40% ；其中，地上部分的含水量差异很明显，达到70%以上，地下部分仅相差 20%左右。实施例8、IPT在根瘤菌中表达获取自生状态下的根瘤菌(接种根瘤菌(Sinorhizobium meliloti Rm 1021)于液体培养基中，过夜培养，离心后收集菌体)，以及本发明的基因工程根瘤菌LMG202。 通过提取总RNA，反转录成cDNA，PCR检测导入的外源基因IPT的表达(采用的引物 IPT:TTCGGACGCCTTTCTCAC(SEQ ID NO 1)，GCCGCCCTGCATCAATAT(SEQ ID NO 2) ；rpsF CCTCGCTCGGCAGGACAT(SEQ ID NO 3), GCCTTGCGGTTCTTCTTGAT(SEQ ID NO :4))。结果如图8，发现IPT基因在本发明的基因工程根瘤菌LMG202中自生(图8A)还是共生(图8B)状态下均表达，而野生型根瘤菌中不论在自生(图8A)还是共生(图8B) 状态下均无任何表达。实施例9、紫花苜蓿叶片的过氧化物DAB的变化苜蓿种子用25%次氯酸钠溶液表面消毒lOmin，浸种催芽后，于根瘤菌菌液中浸泡lOmin，播于无菌无氮的蛭石珍珠岩中，置于人工气候室生长。 将经干旱处理的紫花苜蓿叶片的过氧化物DAB染色，具体为生长期每5天浇水一次，待生长至3周后停止浇水，观察植株表型。DAB染色用于检测内源活性氧(H2O2)含量。第3周停止浇水5天后，出现萎蔫现象时，取植株上从上往下第3-4片叶片，于0. 1% DAB溶液(pH 5. 8，现配)中22°C孵育12h， 然后将叶片转移至95%乙醇中，沸水浴5min，重复3次至背景干净，镜检。结果如图9，对照植株(接种携带空载体的野生型苜蓿中华根瘤菌)的植物叶片中含有较多的过氧化物，接种工程根瘤菌LMG202的植物则明显较少。实施例10、紫花苜蓿叶片的抗氧化酶的表达变化如前述实施例9方法培养紫花苜蓿，接种根瘤菌，以及干旱处理。通过提取叶片总RNA，反转录成cDNA，PCR检测导入的抗氧化酶类基因的表达。采用的PCR引物SOD 超氧化物歧化酶AATGTCACCGTCGGTGATGATG(SEQ ID NO 5), GTTCATCCTTGCAAACCAATAATACC(SEQ ID NO 6)；CAT 过氧化氢酶CCTATTTGATGATGTGGGTGTCC (SEQ ID NO 7), GTCTTGAGTAGCATGGCTGTGGT(SEQ ID NO 8)；sAPX 叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶ACCAACCTCGTTCAGTGTCCAT (SEQ ID NO 9)， AGAGCGCTGTCTGCGTTCTATT(SEQ ID NO 10)；thylAPX 类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶TCATCCTCTTTTGATTCGTTTGG(SEQ ID NO: 11), CTTTGATTGGCTGGAGAAGTTTC(SEQ ID NO :12)；DHAR 脱氢抗坏血酸还原酶GATTGGAGACTGCCCTTTTAGC (SEQ IDNO 13)， CTGTAGCCTTTTCAGGTGGTGT(SEQ ID NO 14)；MDHAR 单脱氢抗坏血酸还原酶AGCGTTCGTTTACGTGATTCTTG (SEQID NO 15)， CATTTGGGAGTTAGCCTTTCCTC(SEQ ID NO: 16)；GR 谷胱甘肽还原酶TTTGAACAAAGGTGCAGAAGAAGG(SEQ ID NO :17)， TGGGAACACAACCACGAATGAC(SEQ ID NO 18)；GPX 谷胱甘肽过氧化物酶TGGACAGGAGCCAGGATCTAGT(SEQ IDNO :19)， ATTTTCAGAGGAGCGGTGGTAG(SEQ ID NO 20)；actin2 肌动蛋白(内参)TGGCATCACTCAGTACCTTTCAAG(SEQ ID NO :21)，ACCCAAA GCATCAAATAATAAGTCAACC(SEQ ID NO 22)；结果如图10，干旱处理前，植物叶片中抗氧化酶类的表达量区别不明显；干旱处理后，对照植株(接种携带空载体的野生型苜蓿中华根瘤菌)的植物叶片中多数抗氧化酶基因的表达明显少于接种工程根瘤菌LMG202的植物。实施例11、工程根瘤菌对紫花苜蓿抗病性的影响以大肠杆菌 E. coli 基因组序列为模板，以 gctcatATGGACCAGAAGCTGTTAACGG(SEQ ID NO :23)和 gcatctagaTCAGGTGTGTTTAAAGCTGTTCTGC(SEQ ID NO :24)为引物，获得大肠杆菌E. coli中的γ -氨基丁酸合成酶基因(GAD)，以Nde I/Xba I酶切后插入到表达载体 PSRK-Km的相应位点中，获得重组质粒。将该重组质粒转化苜蓿中华根瘤菌Rml021，获得工程根瘤菌LMG206，如前述接种工程菌LMG202相同的方法将工程根瘤菌LMG206接种紫花苜蓿。试验的结果显示，接种工程根瘤菌LMG206能够增强苜蓿抗铃夜蛾的能力。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种改变植物性状的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一种重组根瘤菌，所述的重组根瘤菌细胞中含有外源基因的表达盒；所述的外源基因是改变植物性状相关基因，或是被表达后能形成改变植物性状相关成分的基因； 禾口(2)将重组根瘤菌与植物接触共生，从而所述的外源基因被表达并被转运到植物的细胞、组织或器官内；或者所述的外源基因被表达并形成改变植物性状相关成分，该成分被转运到植物的细胞、组织或器官内。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组根瘤菌的出发菌株选自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium Ieguminosarum bv. viciae)艮瘤菌(Bradyrhizobium sp. arachis)lif (Azorhizobium caulinodans)，埃氏慢生根瘤菌(慢生大豆根瘤菌)(Bradyrhizobium elkanii)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobium liaoningense)、华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium Ioti)，埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、 豆|5豆 瘤菌(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli)、豆豆 f艮瘤菌(Rhizobium leguminosarum biovar trifolii)、甘草f艮瘤菌(Mesorhizobium glycyrrhiza)或黄 'jMM (Mesorhizobium astragalus)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是能与根瘤菌共生的植物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的植物选自豆科植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的豆科植物选自苜蓿、大豆、豌豆、花生、菜豆、绿豆、赤豆、蚕豆、豇豆、紫云英、甘草或黄芪。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因、赤霉素3合成酶基因、古巴焦磷酸合成酶基因，内根-贝壳杉烯合成酶基因，内根-贝壳杉烯19-氧化酶基因，内根-贝壳杉烯酸7 β羟化酶基因， GA12-醛合成酶基因，GA-7-氧化酶基因，GA-13-羟化酶基因，GA20-氧化酶基因，GA3 β羟化酶基因，GA2-氧化酶基因或细胞色素Ρ450单加氧酶基因。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y-氨基丁酸合成酶基因。
8.—种重组根瘤菌，其细胞中含有外源基因的表达盒；所述的外源基因是改变植物性状相关基因，或是被表达后能形成改变植物性状相关成分的基因。
9.如权利要求8所述的重组根瘤菌，其特征在于，所述的外源基因选自异戊烯基转移酶基因、Y氨基丁酸合成酶基因、赤霉素3合成酶基因、古巴焦磷酸合成酶基因，内根-贝壳杉烯合成酶基因，内根-贝壳杉烯19-氧化酶基因，内根-贝壳杉烯酸7 β羟化酶基因， GA12-醛合成酶基因，GA-7-氧化酶基因，GA-13-羟化酶基因，GA20-氧化酶基因，GA3 β羟化酶基因，GA2-氧化酶基因或细胞色素Ρ450单加氧酶基因。
10.如权利要求8所述的重组根瘤菌，其特征在于，所述的重组根瘤菌表达异戊烯基转移酶，所述的异戊烯基转移酶能合成植物细胞分裂素。
11.如权利要求8所述的重组根瘤菌，其特征在于，所述的重组根瘤菌表达Y-氨基丁酸合成酶，所述的Y-氨基丁酸合成酶能合成Y-氨基丁酸。
12.权利要求8所述的重组根瘤菌的制备方法，所述方法包括将表达载体转移入根瘤菌中；其中，所述的表达载体中含有外源基因的表达盒，所述的外源基因是改变植物性状相关基因或是被表达后能形成改变植物性状相关成分的基因。
13.—种权利要求8-11任一所述的重组根瘤菌的用途，用于改变植物性状。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的重组根瘤菌表达异戊烯基转移酶或Y -氨基丁酸合成酶，该重组根瘤菌用于提高植物的抗旱能力，提高植物的固氮酶活力， 促进植物的生长，提高植物的生物量，提高植物组织中细胞分裂素含量，提高植物组织的水份含量，降低植物组织中过氧化物的含量，提高植物组织中抗氧化酶类基因的表达或提高植物抗病虫害能力。
15.一种改变植物性状的组合物，包括(1)有效量的权利要求8-11任一所述的重组根瘤菌；和(2)农药学上可接受的载体。
16.一种制备改变植物性状的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括将有效量的权利要求8-11任一所述的重组根瘤菌与有效量的农药学上可接受的载体混合。
全文摘要
本发明涉及一种改变植物性状的方法，应用可形成根瘤的植物与根瘤菌形成共生关系的特殊性质，在植物根瘤细胞内部定殖的根瘤菌中表达外源基因，然后通过植物体内已经存在的运输系统将基因表达产物或成分转运到植物的其它组织器官，从而改变植物的性状或表型。
文档编号C12N15/82GK102206671SQ20111007655
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月28日 优先权日2010年3月26日
发明者徐霁, 李晓琳, 罗利 申请人:中国科学院上海生命科学研究院