具有部分或完全倍增基因组的玉米植物及其用途
【专利摘要】提供了具有部分或完全倍增基因组的玉米植物或植物部分。还提供了产生和使用植物或其部分的方法，以及含其的产品。
【专利说明】具有部分或完全倍增基因组的玉米植物及其用途
【技术领域】
[0001]本发明在其一些实施方式中涉及具有部分或完全倍增基因组的玉米(maize)植物及其用途。
【背景技术】
[0002]玉米(Zea mays L.ssp,玉蜀黍)也被称为玉米(corn)或包谷/玉蜀黍(mielie/mealie)，是在中美洲史前的土著人民驯化的谷物。多叶茎产生含有称为玉米粒的种子的玉米穗。玉米籽粒在技术上是一种水果，但在烹调中用作蔬菜或淀粉。玉米具有10个染色体(n=10)。染色体的组合长度为1500cM。有些玉米染色体具有称为“染色体结节”(chromosomal knobs)的东西:即黑色染色的高度重复的异染色质域。各个结节在玉米和墨西哥类蜀黍(teosinte)的这两个系中是多态性的。
[0003]玉米在美国是最广泛生产的食用谷物，占比超过90%的总生产。大约8000万英亩的土地种植了玉米。多数作物用作家畜饲料；其余加工成多种食品和工业产品，包括淀粉，甜味剂如高果糖玉米糖浆、玉米油，以及用作燃料的乙醇。
[0004]玉米和玉米面(碾磨的干玉米面)构成世界许多地区的主粮。由葡萄牙人在16世纪引入到非洲，玉米已成为非洲最重要的主粮作物。玉米粉也可以用于替代小麦粉，制作玉米面包和其它烘焙产品。玉米也是淀粉的主要来源。玉米淀粉(玉米粉)是家庭烹饪和在许多工业化食品的主要成分。玉米也是烹调油(玉米油)和玉米谷蛋白的主要来源。玉米淀粉能够进行水解和酶处理， 而产生糖浆，特别是高果糖玉米糖浆，甜味剂；并也能发酵和蒸馏，而产生谷物醇。玉米有时用作啤酒的淀粉源。在美国，用于人类消费的玉米用量约占该国种植量的四十分之一。在美国和加拿大，玉米大多种植作为牲畜饲料，草料，青贮饲料(通过切碎的玉米秸杆发酵制成)，或谷物。玉米粉也是一些商业动物性食物产品的重要成分。
[0005]试图使用传统育种，基因工程和其它农业实践措施增加玉米产量在本领域内是众所周知的。
[0006]例如，以谷物和秸杆形式的生物质生产传统上通过使用化肥，杀虫剂和选择育种进行增产。虽然施用肥料和消除虫害已经导致生物质增产，但是所有这些方法的有效性受到植物的基因构成限制。相反，选择育种往往因为近交衰退而使性能、产量和植物大小降低的结果倍增。
[0007]基因修饰(GM)玉米是在2009年商业化种植的11种GM作物之一。自从1997年在美国和加拿大种植以来，在2009年美国玉米作物85 %都是基因修饰的。这在巴西、阿根廷、南非、加拿大、菲律宾、西班牙以及，较小规模地，在捷克共和国、葡萄牙、埃及和洪都拉斯，也是商业化种植的。然而，在美国基因工程玉米的使用超过十年，尽管声称他们可以缓解迫在眉睫的粮食短缺，但对作物产量的影响已经不大。
[0008]相关技术:
[0009]美国专利申请20090162477
[0010]美国专利申请20030005479[0011]美国专利号4，705，910
[0012]其它【背景技术】:
[0013]Dudley and Alexander1969Crop Science9:613-615 ；
[0014]Randolph Proc.N.A.S.18:222-2291923 ；
[0015]Randolph Agricultural Researchl93550(7):591-605 ;
[0016]Randolph Agricultural Researchl94469:47-76 ；
[0017]Rice and Dudleyl974Crop Sciencel4:390-393。
【发明内容】
[0018]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了如本文中所示例的一种具有部分或完全倍增基因组的玉米(玉蜀黍)植物。
[0019]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了具有至少43个染色体并当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米植物至少是一样可繁殖的(多产的，fertile)玉米(玉蜀黍)植物。
[0020]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种具有部分或完全倍增基因组并且其特征在于当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物种子重量高至少10%的玉米植物。
[0021]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种具有部分或完全倍增基因组的玉米植物并且其特征在于当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时比其等基因二倍体玉米植物总干重高至少30%。
[0022]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种具有本发明所述的植物作为亲本祖先(parental ancestor)的杂交植物。
[0023]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包含本发明所述植物的种植场。
[0024]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种包含本发明所述植物的种子的播种场。
[0025]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时具有比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物的种子重量高至少10%。
[0026]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时具有比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物总干重高至少30%。
[0027]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时每单位叶面积比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物表现出更高的CO2摄取量。
[0028]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的。
[0029]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物是非转基因的。
[0030]根据本发明一些实施方式，所述繁殖能力(繁殖率)由以下至少之一确定:
[0031]每株植物的种子数；
[0032]结实分析；
[0033] 配子繁殖能力分析；和[0034]醋酸洋红花粉染色。
[0035]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物是三倍体；
[0036]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物是四倍体。
[0037]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物能够与二倍体或四倍体玉米进行杂交育种。
[0038]根据本发明一些实施方式，本发明所述的植物是一种近交植物。
[0039]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了本发明所述植物的植物部分(植物器官)。
[0040]根据本发明一些实施方式，所述植物部分是种子，或谷粒。
[0041]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种本发明所述植物或植物部分的
加工产品。
[0042]根据本发明一些实施方式，加工产品选自由食品、饲料、草药补充剂、饮料、粘合剂、建材、生物柴油和生物燃料组成的组。
[0043]根据本发明一些实施方式，食物或饲料选自由青贮饲料、玉米糊、玉米片、玉米粥和爆米花组成的组。
[0044]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了由本发明所述植物或植物部分生产的膳食(粉，meal)ο
[0045]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种产油方法，该方法包括:
[0046](a)收获植物的谷粒；和
[0047](b)由谷粒提取油。
[0048]根据本发明一些实施方式，所述方法进一步包括将油加工成生物柴油。
[0049]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种本发明所述植物或植物部分的独立可再生细胞。
[0050]根据本发明一些实施方式，所述细胞在培养基中表现出至少5代的基因组稳定性。
[0051]根据本发明一些实施方式,细胞源自分生组织(mertistem)、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子、谷粒、秸杆或茎。
[0052]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了包含可再生细胞的组织培养物(组织培养，tissue culture)。
[0053]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种生产玉米种子的方法，包括本发明所述植物的自我育种或杂交育种。
[0054]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种使用植物育种技术培育杂交植物的方法，该方法包括使用本发明所述植物作为自我育种和/或杂交育种的育种材料的源。
[0055]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种生产玉米粉的方法，该方法包括:
[0056](a)收获植物的谷粒或植物部分；和
[0057](b)加工谷粒而生产玉米粉。
[0058]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种产生具有部分或完全倍增基因组的玉米种子的方法，该方法包括在瞬时施加的磁场下使玉米种子与G2/M细胞周期抑制剂接触由此产生具有部分或完全倍增基因组的玉米种子。
[0059]根据本发明一些实施方式，所述G2/M细胞周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。
[0060]根据本发明一些实施方式，微管聚合抑制剂选自由秋水仙素，诺考达唑，氨磺乐灵(黄草消，oryzaline),氟乐灵(trifluraline)和硫酸长春碱组成的组。
[0061 ] 根据本发明一些实施方式，该方法进一步包括在接触之前超声处理种子。
[0062]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种具有至少43个染色体并当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的玉米植物的典型种子的样品，其中样品根据布达佩斯合约按照NCMB41973保藏在NCMB。
[0063]根据本发明一些实施方式的一个方面，提供了一种具有至少43个染色体并当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的玉米植物的典型种子的样品，其中具有至少43个染色体的玉米植物的样品根据布达佩斯合约按照NCMB41973保藏在NCMB。
[0064]除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属【技术领域】的普通技术人员之一通常 理解的相同的含义。虽然类似或等同于本文描述那些的方法和材料可以在本发明的实施方式的实践或测试中使用，示例性的方法和/或材料如下所述。在冲突的情况下，本专利说明书，包括定义，将会控制。此外，所述材料、方法和实施方式仅是说明性的，而并非旨在进行必要的限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]本发明的一些实施方式，仅作为实例的方式，参考附图进行描述。现在具体参考详细附图，需要强调的是所示的细节是通过举例的方式而目的在于举例说明性地讨论本发明的实施方式。在这点上，结合附图的描述使本领域的那些技术人员对于如何实施本发明的实施方式变得显而易见。
[0066]在附图中:
[0067]图1是显示所示二倍体(GR)和三倍体杂交种以及雌性二倍体亲本的千粒重(gr)的柱状图。
[0068]图2是显示本发明一些实施方式的二倍体(EXPM100)和三倍体(EXPM104)玉米的累积光合作用的图；
[0069]图3A-图3B是根据本发明的教导产生的玉米种子的图像。图3A显示了雄性二倍体亲本的种子和通过雄性二倍体亲本的基因组倍增产生的四倍体雄性的种子。图3B表示二倍体和三倍体杂交种的种子。
[0070]图4A-图4B显示所示二倍体(GR)和三倍体杂交种以及雌性二倍体亲本的千粒重(gr)的图。
[0071]图5A-图5B是根据本发明的教导产生的玉米种子的图。
[0072]图6是显示本发明一些实施方式的二倍体和四倍体玉米的累积光合作用的图；
[0073]图7A-图7D是杂交二倍体和三倍体玉米种子的图像。【具体实施方式】
[0074]本发明【具体实施方式】的描述
[0075]本发明，在其一些实施方式中，涉及具有部分或完全倍增基因组的玉米(玉蜀黍(Zea mays L.ssp))植物及其用途。
[0076]在详细解释本发明至少一个实施方式之前，应该理解的是，本发明在其申请书中并不一定仅限于下面的描述中提出的或通过实施例例举的细节。本发明能够是其它实施方式或以各种方式进行实践或实施。
[0077]玉米(玉蜀黍)和玉米面(碾磨的干玉米)构成世界许多地区的主粮。随着世界人口不断呈几何增长，对植物产量增长施加了巨大的压力。
[0078]选择育种用于改善，或试图改善，植物中诸如产量，籽粒油率等农艺和经济利益的表型性状已采用了几个世纪。一般来说，选择育种涉及基于所感兴趣的一种或多种表型性状作为下一代亲本的个体选择。然而，这种表型选择经常因为能够影响所感兴趣的表型性状的非遗传因素而变得复杂化。同样，试图通过基因工程提高作物产量已只取得有限的成功。
[0079]本
【发明者】现在设计了一种新颖的程序用于玉米(玉蜀黍)中的诱导基因组倍增，产生的植物在基因组上是稳定而可繁育的。多倍体植物(例如，四倍体和三倍体)避免了不希望的基因组突变，而其特征在于比具有二倍体基因组的等基因的祖代植物活力更强而植物总产量更高(见下文表5)。这些新性状可以有助于更好的气候适应性和对生物和非生物应力的更高耐受性。此外，使用本发明的诱导多倍体植物通过花粉消毒产生的杂交玉米种子(或谷粒，这在本文中互换使用)由于杂交表达可以提高全球玉米产量百分之几十。此外，本发明的一些实施方式的多倍体植物在基因组倍增之后表现出与已经来自早代(例如，第一，第二，第三或第四代)的等基因二倍体祖代植物相当或更好的繁殖能力(繁殖率，fertility)具有可比性或更好的生育力，就无需进行进一步育种才能提高繁殖能力。
[0080]因此，根据本发明的一个方面，提供了具有至少43个染色体并当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的。
[0081]根据另外的或其它方面，提供了一种具有部分或完全倍增基因组并且其特征在于当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时种子重量比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物高至少10%的植物。
[0082]根据另外的或其它方面，提供了具有部分或完全倍增基因组并且其特征在于当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)的总干重高至少30%的玉米植物。
[0083]正如本文中所用的术语“玉米(玉蜀黍)植物”是指传统种植供人或动物的食物或饮料或作为原料、食物补充剂或化学品来源的玉米。玉米植物本质上是二倍体(2N=20)。
[0084]许多商业变种都是可以利用的，包括，但不限于:
[0085]粉质玉米(Zea mays var.amylacea)(通常用于生产玉米花)
[0086]爆裂玉米(Zea mays var.everta)(通常用于生产爆米花)
[0087]马齿玉米(Zeamays var.1ndentata)(马齿形玉米)
[0088]爐石玉米(Zeamays var.1ndurata)(硬质玉米)
[0089]甜型玉米(Zeamays var.saccharata)和甜玉米(Zea mays var.rugosa)(甜玉米)
[0090]粘玉米(Zeamays var.ceratina)(糯玉米)
[0091]玉米(Zea mays)(高直链淀粉)
[0092]英玉米(Zeamays var.tunicata Larranaga ex A.St.Hi I)(有稃种玉米(Podcorn))
[0093]草莓玉米(Zeamays var.japonica)(条纹玉米(Striped maize))
[0094]“植物”是指整株植物或其部分(例如，种子，和秸杆，例如，茎，禾杆，叶，组织等)，加工或未加工的(例如，种子，粉，茎，干组织，糕，油等)，可再生的组织培养物或从中分离的细胞。
[0095]根据一些实施方式中，如本文所用，术语植物还指具有所述诱导的多倍体植物作为其祖先至少之一的杂交种，这将在下文进一步定义和解释。
[0096]如本文所用的“部分或完全倍增基因组”是指导致四倍体植物(4N)或更高的至少I个染色体、部分染色体组(〈10)、染色体组(N=IO)或基因组完整倍增的增加。
[0097]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是3N。
[0098]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是4N。
[0099]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是5N。
[0100]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是6N。
[0101]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是7N。
[0102]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是8N。
[0103]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是9N。
[0104]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是10N。
[0105]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是11N。
[0106]根据一个【具体实施方式】，多倍体植物是12N。
[0107]根据一个【具体实施方式】，诱导的多倍体植物不是基因组倍增的单倍体植物。
[0108]正如所提及的，倍增能够导致不完全染色体组(〈IN)的加入或另外导致不完全倍增染色体组的加入。
[0109] 因此，根据一个【具体实施方式】，本发明的所述多倍体植物包含至少43个染色体。
[0110]正如所提及，多倍体植物当处于相同(同一)发育状态和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍；N=20)植物至少是一样可繁殖的。
[0111]如本文所用的术语“可繁殖的”(多产的，fertile)是指有性繁殖的能力。繁殖能力(繁殖率，fertility)能够使用本领域熟知的方法进行分析。另外，繁殖能力定义为结实的能力。为了确定繁殖能力，可以分析以下参数:种子(谷粒)的数目；结实分析；配子繁殖能力可以通过花粉萌发例如在蔗糖底物上；和可替代地或另外地醋酸洋红染色，由此染色可育花粉进行确定。
[0112]正如所提及的，本发明一些实施方式的所述多倍体植物在基因组倍增之后显示出与已经来自早代(例如，第一代，第二代，第三代或第四代)的等基因二倍体祖先植物相当的繁殖能力(例如，+/-约10%或20%)，否定了进一步培育的需要。
[0113]正如本文所用的术语“稳定的”或“基因组稳定性”是指染色体或染色体复制体的数目，这经过了几代仍然是常数，而同时植物在以下参数至少之一中并没有显示出大幅下降:产量，繁殖能力，生物量和活力。根据一个【具体实施方式】，稳定性被定义为产生典型的后代，保持强健和一致的变种。
[0114]根据本发明的一个实施方式，基因组倍增的植物与源植物，即二倍体玉米是等基因的。基因组倍增的植物在质量上而非在数量上具有与所述二倍体植物基本上相同的基因组的组成。
[0115]根据一个【具体实施方式】，植物(或由其衍生的细胞培养物)在培养物或世代中表现出至少2、3、5、10或更多代的基因组稳定性。根据本发明的一些实施方式中，成熟的基因组倍增植物与其在相同的条件下生长并在相同发育阶段的等基因二倍体祖代具有至少约相同的(+/-10%)种子数量；可替代地或另外第，基因组倍增的植物具有通过醋酸洋红染色的至少90%的可育花粉；并且可替代地或另外在蔗糖上具有至少90%的种子萌芽。
[0116]根据本发明一些实施方式，所述多倍体植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时具有的种子重量比其等基因二倍体玉米植物高至少7%，10%, 20%, 30%, 40%, 50%，60%,70%,80%,90%,100%,120%,150% 或 200%。
[0117]种子重量能够对一定量的种子(例如，1000)或每单个种子进行测定。
[0118]根据本发明的一些实施方式，多倍体植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时具有的总干重比其等基因二倍体玉米植物高至少20%，25%，30%, 40%, 50%, 60%, 70%，80%,90%,100%,120%,150% 或 200%。
[0119]干重用作植物生长的度量。植物从土壤中移出并冲洗掉任何松动的土壤。植物在设定至低热(例如，IO(TC)的烘箱中干燥过夜。植物在干燥环境中冷却而随后称重。
[0120]根据本发明的一些实施方式，多倍体植物当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长比其等基因二倍体玉米植物时展示出更高的CO2摄取量(通过在以下实施例部分中的CO2摄取量分析确定的每单位叶面积，10%, 20%, 50%, 70%或更高)。测定作为植物生长速率度量的CO2摄取量的方法在本领域是已知的，并在以下的实施例部分中进行描述。
[0121]对于表征本发明基因组倍增植物的性状(例如，繁殖率，产量，生物量和活力)所作的对比分析，通常在两者都处于相同发育阶段和两者都在相同生长条件下生长时相比于其等基因的祖代(以下，称为“二倍体祖代植物”)进行实施。
[0122]根据一个【具体实施方式】中，基因组倍增的植物特征在于籽粒蛋白质含量至少与相同发育阶段和在相同生长条件下生长的二倍体玉米等基因祖代植物相同。根据一个【具体实施方式】，籽粒蛋白质含量比相同发育阶段和在相同生长条件下生长的等基因祖代植物高或低约O~20%。
[0123]根据一个【具体实施方式】，基因组倍增植物特征在于谷粒产量/种植面积至少与相同发育阶段和在相同生长条件下生长的二倍体玉米等基因祖代植物相似。根据一个【具体实施方式】谷粒产量/种植面积高10%，15%，20%, 25%，30%, 35%，40%, 45%，50%或甚至更多的80%，90%, 100%, 200%, 250%, 300%, 400%或500%。根据一个【具体实施方式】谷粒产量/种植面积比相同发育阶段和在相同生长条件下生长的等基因祖代植物高0.1-5,0.3-5,0.4-2.5，1-5，2-3 或 2-2.5 倍。
[0124] 本发明的植物特征在于生物量、产量、谷粒产量、谷粒产量/种植面积、谷粒蛋白质含量、谷粒重量、秸杆产量、结实、染色体数目、基因组组成、含油百分率、活力、抗虫性、抗杀虫剂性、耐旱性和非生物应激耐受性中至少一个、两个、三个、四个或全部都比其等基因二倍体植物更高。
[0125]根据一个【具体实施方式】，提供了一种如本文中所示例的具有部分或完全倍增基因组的玉米植物。
[0126]根据一个【具体实施方式】，植物是如本文中所示例的多倍体。
[0127]因此，根据一个实施方式，四倍体植物是具有Z1-2011 二倍体作为等基因祖代的Zl (13)-2011 或 Zl(12)-2011。
[0128]使用本发明的教导，本发明人能够生产许多诱导多倍体的植物变种。具有至少43个染色体并当处于相同发育阶段时和在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的玉米植物典型种子的样品，其中具有至少43个染色体的玉米植物样品，根据布达佩斯合约在2012年5月18日按照NCMB41973保藏于NCMB。
[0129]在母本是N2-2011的情况下也提供了 Zl (13)-2011或Zl (12)-2011的杂交三倍体。因此，杂交三倍体HFl代码EXPM104具有作为亲代雄性的四倍体Zl (13)-2011 ;杂交三倍体HFl代码EXPMl 10具有作为亲代雄性的四倍体Zl (12)-2011。
[0130]根据另一实施方式，四倍体植物是具有Z5-2011 二倍体作为等基因祖代的Z5 (6)-2011 或 Z5 (8)-2011 ο
[0131]在母本是N2-2011的情况下，也提供了 Z5 (6)-2011或Z5 (8)-2011的杂交三倍体。
[0132]因此，杂交三倍体HFl代码EXPM208具有作为亲代雄性的四倍体Z5(6)_2011 ?’杂交三倍体HFl代码EXPM21 1具有作为亲代雄性的四倍体Z5 (8)-2011。
[0133]根据另一实施方式，四倍体植物是具有作为等基因祖代的Z5-2011 二倍体的Z5 (39)-2011, Z5(22)-2011, Z5(8)-2011,或 Z5 (31)-2011。
[0134]在母本是N5-2011 的情况下提供了 Z5 (39)-2011、Z5 (22)-2011、Z5 (8)-2011 或Z5 (31)-2011的杂交三倍体。
[0135]因此，杂交三倍体HFl代码EXPM303具有作为亲代雄性的四倍体Z5 (39)-2011 ?’杂交三倍体HFl代码EXPM307具有作为亲代雄性的四倍体Z5 (22)-2011 ;杂交三倍体HFl代码EXPM309具有作为亲代雄性的四倍体Z5 (8) -2011 ;杂交三倍体HFl代码EXPM310具有作为亲代雄性的四倍体Z5 (31) -2011。
[0136]根据一个【具体实施方式】，植物是非转基因的。
[0137]根据另一实施方式，植物例如通过表达赋予抗虫性或进行栽培的形态性状而是转基因的，正如下文中进一步的描述。
[0138]本发明基因组倍增的植物种子能够使用秋水仙素的改进方法生产，如下面所述。
[0139]因此，根据本发明的一个方面，提供了一种产生具有部分或完全倍增基因组的玉米种子的方法，方法包括在瞬时施加的磁场下使玉米种子与G2/M细胞周期抑制剂接触由此产生具有部分或完全倍增基因组的玉米种子。
[0140]通常情况下，G2/M周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。
[0141]微管周期抑制剂的实例包括，但不限于秋水仙素、秋水仙胺、氟乐灵、氨磺乐灵、苯并咪唑氨基甲酸酯(例如，诺考达唑，昂考哒唑(oncodazole)，甲苯咪唑，R17934，MBC)、邻-异丙基N-苯基氨基甲酸酯，氯异丙基N-苯基氨基甲酸酯、甲基胺草磷(amiprophos-methyl)、紫杉醇、长春喊(vinblastine),灰黄霉素(griseofulvin),咖啡因、双-ANS、美坦辛(maytansine)、长春花碱(vinbalstine),硫酸长春碱和鬼曰毒素(podophyllotoxin)ο
[0142]G2/M抑制剂包含于包括其它活性成分如抗氧化剂、洗涤剂和组蛋白的处理溶液中。
[0143]在用含G2/M周期抑制剂的处理溶液处理种子的同时，植物进一步经受至少700高斯(例如，1350高斯)的磁场约2小时。种子放置于如实施例1中的磁场室中。经过指定的时间，种子从磁场移出。
[0144]为了提高种子对处理溶液的渗透性，在与G2/M周期抑制剂接触之前种子经受超声处理(例如，40KHz达10~20min)。
[0145]湿种子可以更好地响应处理，而因此种子可以在处理开始时浸泡在水溶液(如，蒸馏水)中。
[0146]根据一个【具体实施方式】中，在黑暗中于室温下(约23_26°C)或更低温度下[例如，对于超声(US)处理阶段]执行整个处理。
[0147]因此根据一个【具体实施方式】，种子在室温下浸泡于水中，而然后在蒸馏水中进行US处理。
[0148]一旦渗透，种子置于含有处理溶液的容器和处于接通状态的磁场中。G2/M周期抑制剂浓度的示例性范围提供于以下表1中。处理液可以进一步包含按照下面列出的浓度的DMS0、去污剂、抗氧化剂和组蛋白。
[0149]一旦种子从磁场中移出则它们就受到了第二轮G2/M周期抑制剂的处理。最后，种子进行洗漆，而种植于合适的生长床上。可选地，幼苗在Acadain? (Acadian AgriTech)和Giberllon (后者用于使用作为G2/M周期抑制剂的长春碱处理之时)存在下生长。
[0150]应该理解的是，上述方法可以在诸如本文中的整株植物或植物部分上实施，而不一定非限于种子。
[0151]使用上面的教导，本发明人已经建立了基因组倍增的玉米植物。
[0152]一旦建立，本发明的植物可以通过有性或无性，如通过使用组织培养技术进行繁殖。
[0153]如本文中所使用的短语“组织培养物”是指源自能够产生玉米的植物细胞或植物部分，包括植物原生质体，植物杯状器官，植物团块和植物细胞，其在植物，植物部分中是完整的，如种子，叶，莖，禾杆，花粉，根，根尖，花药，胚珠，花瓣，花，胚，纤维和圆荚。
[0154]根据本发明的一些实施方式，培养的细胞在培养物中表现出至少2、3、4、5、7、9或10代的基因组稳定性。
[0155]产生植物组织培养物和从组织培养物再生植物的技术在现有【技术领域】内是公知的。例如，这样的技术由文献 Vasil., 1984.Cell Culture and Somatic Cell Geneticsof Plants, Vol I，II，III，Laboratory Procedures and Their Applications，AcademicPress, New York ；Green 等，1987.Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press，New York ；Weissbach and Weissbach,1989.Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press ;Gelvin 等，1990，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer AcademicPublishers ;Evans 等，1983，Handbook of Plant Cell Culture，MacMillian PublishingCompany, New York ;和 Klee 等，1987.Ann.Rev.0f Plant Phys.38:467486 中进行了阐述。
[0156]组织培养物可以由细胞或选自种子、叶、茎、花粉、根、根尖、花药、胚珠、花瓣、花和胚胎组成的组中的组织的原生质体产生。
[0157]应该理解的是本发明的植物也能够与其它玉米植物一起进行植物育种(自交育种或杂交育种)以产生表现出本发明玉米植物至少一些特性的新植物或植物系。
[0158]由任何这些植物与另一种植物杂交育种的结果产物能够用于谱系育种，转化和/或回交而产生表现出本发明基因组倍增植物特性和任何其它所需性状的其它品种。采用本领域中公知的分子或生化方法的筛选技术能够用于确保之后所寻求的重要商业特性保留于每个育种代中。
[0159]回交的目的是改变或替换轮回亲本系中的一个单个性状或特性。为了做到这一点，轮回亲本系的单个基因用来自非轮回系的所需基因取代或补充，而同时基本上所保留所有其余所需基因，而因此保留原始系所需的生理学和形态学构造。具体非轮回亲本的选择将取决于回交的目的。主要目的之一是为了给植物增加一些商业所需的农艺上重要的性状。精确的回交方案将取决于要改变或增加是特性或性状，以确定合适的测试方案。虽然当要转移的特性是显性等位基因时回交转育方法得到简化，但是隐性等位基因也可能被转移。在这种情况下，可能有必要引入子代的测试确定所期望的特性是否已经成功转移。同样地，转基因能够使用本领域技术人员公知的任意各种已确立的转化方法引入到植物中，如文献:Gressel., 1985.Biotechnologically Conferring Herbicide Resistance inCrops:The Present Realities,In:Molecular Form and Function of the Plant Genome,L van Vloten-Doting, (ed.), Plenum Press, New York ；Huftner, S.L.,等，1992, RevisingOversight of Genetically Modified Plants, Bio/Technology ;Klee,H.,等，1989,PlantGene Vectors and Genetic Transformation:Plant Transformation Systems Based onthe use of Agrobacterium tumefaciens,Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants ;和 Koncz, C.,等 1986, Molecular and General Genetics 中。
[0160]近交繁育能够通过使用本领域中公知的技术完成。通常情况下，将种子回收并种植。然后对于要寻求的性状或多种性状来评价所得植物，而将显示出所需性状的那些进行自交(self-polinated)且种子经过收获并进行种植。这个过程重复足够的代数直到发育具有所需性状的自交系。这样的自交系用于生产杂交四倍体或三倍体玉米。
[0161]应该理解的是，本发明的植物或杂交植物能够进行遗传修饰以便，例如，引入感兴趣的性状,例如,增强的耐应激性(如,生物或非生物的)。
[0162]因此，本发明提供了新型基因组倍增植物和栽培品种，及其产生它们的种子和组织培养物。
[0163]本发明的植物能够与二倍体或四倍体玉米，或各种倍体的玉米(例如，如本文所述的诱导的高倍体玉米)或与其它玉米品种进行自交育种或杂交育种。
[0164]因此，本发明进一步提供了具有作为亲本祖先的如本文所述的基因组倍增植物的杂交植物。在上文和以下实施例部分中提供了杂交三倍体的实例。
[0165]根据一个【具体实施方式】本发明提供了具有本发明的多倍体玉米作为亲本祖先的杂交植物。
[0166]本发明进一步提供了包含至少10%，20%, 50%或100%本发明所述植物或杂交植物的种子的种子袋。
[0167]本发明进一步提供了包含本发明的任何植物或杂交植物的种植场。[0168]本发明进一步提供了包含本发明的任何植物或杂交植物的播种场。
[0169]本发明进一步设想本发明的植物及其部分的产品和加工产品。
[0170]正如本文所用的“加工产品”是指已经经过机械或化学变化的本发明玉米植物，或其部分。
[0171]加工产品的实例包括但不限于食品、饲料、草药补充剂、饮料、化学品、建筑材料、生物柴油和生物燃料。
[0172]根据一个【具体实施方式】，产品包括对于倍增能够对其进行定量评价植物的细胞或其组件，如DNA。
[0173]任何以下产品或用途，构成了一个非限制性列表，通过本发明的教导可以设想。矢车菊，淀粉，粉及其产品(例如，玉米粥)，爆米花，玉米糊，青贮饲料，酒精饮料。动物性饲料，烘焙点心食品，非酒精饮料，建材，罐头/包装品，谷物类食物，化学品。调味品，糖果，脂肪和油，配制奶制品，燃料酒精，家庭需要，冰淇淋，冰冻甜点，果酱，果冻蜜饯，肉类制品，纸及相关产品，糖浆和糖，纺织品(服装，地毯，床上用品)，烟草，聚合物复合材料(HarvestForm?),可堆肥塑料,塑料泡沫，防冻剂,药品，重组体表达的宿主系统(例如，疫苗，酶，细胞外基质蛋白)。
[0174]本发明还设想生产加工产品或产品的方法。
[0175]例如，本发明提供了一种生产玉米粉的方法，该方法包括:
[0176](a)收获本发明所述植物的谷粒；和
[0177](b)加工谷粒而生产玉米粉。
[0178]可替代地，本发明提供了一种产油的方法，该方法包括:
[0179](a)收获本发明植物的谷粒；和
[0180](b)从谷粒中提取油。
[0181]预期在从本申请成熟的专利寿命期内很多相关产品将被开发，并且术语加工品的范围预想涵盖所有这些先验的新技术。
[0182]正如本文所用的术语“约”是指±10%。
[0183]术语“含有”，“包含”，“包括”，“涵盖”，“具有”和其共轭物是指“包括但不限于”。
[0184]术语“由......组成”意思是“包括并限于”。
[0185]术语“基本上由......组成”是指组合物、方法或结构可以包括其它成分，步骤和
/或部分，但只有在其它成分、步骤和/或部分并不实质上改变所权利要求保护的组合物、方法或结构的基本而新的特性之时。
[0186]正如本文所使用的单数形式“一个”，“一种”和“这种”除非上下文另有明确规定都包括复数引用。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括许多化合物，包括其混合物。
[0187]在整个本申请中，本发明的各种实施方式可以以范围形式提呈。应当理解的是，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，不应该理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当认为已经明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，一个例如从I到6的范围的描述应当认为已经明确公开了这些子范围，例如从I到3，从I到4，从I到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及该范围内的各个数字，例如，1、2、
3、4、5和6。 无论范围的宽度如何，这都适用。[0188]每当在本文中指出数值范围时，它是指包括所指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一指示数字和第二指示数字“之间的范围”和从第一指示数字“到”第二指示数字“的范围”在本文中可以互换使用，并是指包括第一和第二指示数字和其间的所有分数和整数。
[0189]正如本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务方式、手段、技术和程序，包括但不限于，化学、药物学、生物学、生物化学和医学领域中从业人员已知的，或从已知的方式、手段、技术和程序易于开发的那些。
[0190]应该理解的是，本发明的某些特性，为了清楚起见其描述于独立实施方式的上下文中，也可以组合于单一的实施方式提供。相反，本发明的各种特性，为简洁起见，其描述于单个实施方式的上下文中，也可以独立提供，或提供于任何合适的子组合或按照合适提供于本发明的任何其它描述的实施方式中。描述于各种实施方式的上下文中的某些特性并不要当成那些实施方式的基本特性，除非所述实施方式在没有那些要素时是不起作用的。
[0191]上文所划定的和以下权利要求部分要求授权的本发明各种实施方式和方面在下面的实施例中找到实验支持。
[0192]实施例
[0193]现在参考下面的实施例，其连同上面的描述按照非限制性模式举例说明本发明的一些实施方式。
[0194]通常，本文中使用的命名法和在本发明中所利用的实验室方法包括分子，生物化学，微生物学和重 组DNA技术。这样的技术在文献中充分解释说明。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual，，Sambrook 等，(1989) ,CurrentProtocols in Molecular Biology^Volumes 1-1II Ausubel, R.M., ed.(1994)；Ausubel 等，"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, 〃A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons, New York (1988) ；ffatson 等，"Recombinant DNA〃，ScientificAmerican Books, New York ；Birren 等(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998);美国专利 Nos.4，666，828 ；4, 683，202 ；4, 801，531 ；5, 192，659and5, 272，057 中提出的方法;“CellBiology:A Laboratory Handbook，，，Volumes 1-1II Cellis, J.E., ed.(1994) ；uCurrentProtocols in Immunology，，Volumes 1-1II Coligan J.E., ed.(1994) ;Stites 等(eds),“Basic and Clinical Immunology，， (8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology，，，W.H.Freemanand C0., New York(1980);可利用的免疫分析广泛地描述于这些专利和科学文献中，参见，例如，美国专利 Nos.3，791，932 ;3，839，153 ;3，850，752 ;3，850，578 ;3，853，987 ；3，867，517 ;3，879，262 ;3，901，654 ;3，935，074 ;3，984，533 ;3，996，345 ;4，034，074 ；4，098，876 ;4，879，219 ;5，011，771 和 5，281，521 ,Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J., ed.(1984) ；uNucleic Acid Hybridization〃Hames, B.D., and Higgins S.J.,eds.(1985) ；uTranscription and Translation，，Hames, B.D., and Higgins S.J., Eds.(1984) ；^Animal Cell Culture”Freshney, R.1.，ed.(1986) Immobilized Cells andEnzymes” IRL Press, (1986) ;“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B.,(1984)and “Methods in Enzymology”Vol.1-317, Academic Press ;“PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications，，，Academic Press, San Diego, CA(1990) ；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual” CSHL Press (1996);其所有这些都结合于本文中作为参考，就如同完全提呈于本文中一样。在本文档中提供了其它一般性参考文献。其中的这些方法据信在本领域中是众所周知的，并提供用于方便读者。其中包含的所有信息结合于本文中作为参考。
[0195]实施例1
[0196]多倍体玉米的产生
[0197]实验方法与步骤
[0198]所有阶段和步骤都在黑暗中实施。
[0199]种子在25°C下浸泡于装满水的容器中约2小时。
[0200]种子在约23~约26°C下转移至干净的网袋中，并放入蒸馏水充满的超声波浴中。施加超声处理(约40KHz)约10至约20分钟。温度保持低于26V。在约25°C下将种子袋置于包含处理溶液(以下描述)的容器中。将实施容器放置于磁场室(以下描述)中，并培养约2小时。种子从袋子中取出，并放置于塑料托盘上的纸巾床顶部上。用处理溶液浸饱的纸巾的第二层用作封盖。种子在约25°C下培养约24~约48小时，并在整个培养期内保持润湿。将种子收集到干净的容器中，并用水(pH=7)冲洗。制备用25ppm20:20:20的微量元素肥料补充的土壤的育苗托盘。经过处理的种子播种于托盘中并搬到使用约20-约25°C的白天温度范围，约10-约17°C的夜间温度范围和约40%的最低湿度的温床中。
[0201]当使用长春碱时，在播种后立即施用0.5%~1.5%的GIBERLL0N。种子在随后3个星期内用ACADIAN?每周处理2次。
[0202]处理溶液:
[0203]DMS00.5%
[0204]TritonX1005 滴 /L
[0205]微管聚合抑制剂
[0206]抗氧化剂
[0207]组蛋白50_100ug/mL
[0208]pH=6
[0209]-制备于软化的无氮水中
[0210]*立即使用。
[0211]表1
[0212]
【权利要求】
1.一种如本文中所示例的具有部分或完全倍增基因组的玉米植物。
2.一种具有至少43个染色体的玉米植物，并且当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的。
3.一种具有部分或完全倍增基因组的玉米植物，并且其特征在于，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时种子重量比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物的种子重量至少闻10%。
4.一种具有部分或完全倍增基因组的玉米植物，并且其特征在于，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时总干重比其等基因二倍体玉米(玉蜀黍)植物的总干重至少高30%。
5.一种具有根据权利要求1、2、3或4所述植物作为亲本祖先的杂种植物。
6.一种包括根据权利要求1、2、3或4所述植物的种植场。
7.一种包括根据权利要求1、2、3或4所述植物的种子的播种场。
8.根据权利要求2或4所述的植物，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时具有的种子重量比其等基因的所述二倍体玉米(玉蜀黍)植物的种子重量至少高10%。
9.根据权利要求2或3所述的植物，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时具有的总干重比其等基因的所述二倍体玉米(玉蜀黍)植物的总干重至少高30%。
10.根据权利要求2、3或4所述的植物，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时表现出比其等基因的所述二倍体玉米(玉蜀黍)植物的CO2摄取量更高的CO2摄取量。
11.根据权利要求3或4所述的植物，当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时与其等基因的所述二倍体玉米(玉蜀黍)植物至少是一样可繁殖的。
12.根据权利要求11所述的植物，是第一代、第二代或第三代。
13.根据权利要求1、2、3或4所述的植物，是非转基因的。
14.根据权利要求2或11所述的植物，其中，所述繁殖能力由以下至少一项确定的: 每株植物的种子数量； 结实分析； 配子繁殖能力分析；以及 醋酸洋红花粉染色。
15.根据权利要求1-5所述的植物，是三倍体。
16.根据权利要求1-5所述的植物，是四倍体。
17.根据权利要求1-4所述的植物，能够与二倍体玉米或四倍体玉米进行杂交育种。
18.根据权利要求5所述的杂种，是近交的。
19.根据权利要求1-5任一项所述植物的植物部分。
20.根据权利要求19所述的植物部分，是种子。
21.根据权利要求1-5所述的植物或根据权利要求19-20所述的植物部分的加工产品。
22.根据权利要求21所述的加工产品，选自由食品、饲料、草药补充剂、饮料、粘合剂、建材、生物柴油和生物燃料组成的组中。
23.根据权利要求22所述的加工产品，其中，所述食品或饲料选自由青贮饲料、玉米糊、玉米片、玉米粥和爆米花组成的组中。
24.由根据权利要求1-5所述的植物或根据权利要求19-20所述的植物部分生产的膳合
25.一种生产油的方法，所述方法包括: (a)收获根据权利要求1-5所述植物的谷粒；以及 (b)从所述谷粒中提取油。
26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括将所述油加工成生物柴油。
27.一种根据权利要求1-5所述的植物或根据权利要求19-20所述的植物部分的独立可再生细胞。
28.根据权利要求27所述的细胞，表现出在培养物中至少5代的基因组稳定性。
29.根据权利要求27所述的细胞，源自分生组织、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、秸杆、种子或莖。
30.一种包含根据权利要求27-29所述的可再生细胞的组织培养物。
31.一种生产玉米种子的方法，包括根据权利要求1-5中任一项所述的植物的自交育种或杂交育种。
32.一种使用植物育种技术培育杂种植物的方法，所述方法包括使用根据权利要求1、2、3或4所述的植物作为用于自交育种和/或杂交育种的育种材料源。
33.一种生产玉米粉的方法，所述方法包括: (a)收获根据权利要求1-5所述的植物的谷粒或根据权利要求19或20所述的植物部分；以及 (b)加工所述谷粒以生产所述玉米粉。
34.一种产生具有部分或完全倍增基因组的玉米种子的方法，所述方法包括在瞬时施加的磁场下使所述玉米种子与G2/M细胞周期抑制剂接触，由此产生具有部分或完全倍增基因组的所述玉米种子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述G2/M细胞周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述微管聚合抑制剂选自由秋水仙素、诺考达唑、氨磺乐灵、氟乐灵和硫酸长春碱组成的组。
37.根据权利要求34所述的方法，进一步包括在接触前对所述种子进行超声处理。
38.一种具有至少43个染色体并且当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米植物至少是一样可繁殖的玉米植物的代表性种子样品，其中所述样品已经根据布达佩斯条约按照NCMB41973保藏于NCIMB。
39.一种具有至少43个染色体并且当处于相同发育阶段时并在相同条件下生长时与其等基因二倍体玉米植物至少是一样可繁殖的玉米植物的代表性种子样品，其中具有至少43个染色体的所述玉米植物的所述样品已经根据布达佩斯条约按照NCMB41973保藏于NCMB。
【文档编号】A01H5/10GK103929950SQ201280045291
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年7月17日 优先权日:2011年7月20日
【发明者】阿米特·阿维多夫, 阿隆·勒纳, 利莫·巴鲁赫 申请人:凯伊玛生物农业科技有限公司