用于防治赤霉病病害的组合物和方法

用于防治赤霉病病害的组合物和方法
【专利摘要】本文提供了包含微生物菌株和培养物的组合物及其使用方法。某些菌株、培养物，及其组合物可用于防治例如各种作物植物的赤霉病病害。还提供了生物防治组合物及使用其预防、抑制或治疗植物病原体的发育或病害的发展以及维护植物产量的方法。
【专利说明】用于防治赤霉病病舍的组合物和方法
[0001]序列表的并入
[0002]所附序列表的内容以引用的方式完整地并入本文。所附的名称为“SGI1520_1W0_ST25.txt”的文件是2012年7月24日创建的，大小为55Kb。该文件可在使用Window OS的计算机上使用Microsoft Word存取。
【技术领域】
[0003]本发明涉及植物病原性病害的生物防治。具体地，它涉及可用于防治诸如小麦和大麦的谷类植物上的赤霉病病害的组合物和方法。
[0004]发明背景
[0005]赤霉病，也称为头部疮痂病(head scab)、粉红色霉菌(pink mold)、头部发白(whiteheads)和硬化疮痂病(tombstone scab),是折磨着全世界,尤其美国、欧洲和中国的小麦、大麦和数种其他谷类作物的破坏性病害。在世界上的潮湿和半潮湿谷类种植区，包括印度、俄罗斯、法国、德国和英国，这种病害可达到流行水平并且对谷物，尤其小麦和大麦造成大范围损害。尤其，在美国，小麦疮痂病或赤霉病是更具损害性的小麦病害之一。从全国范围来看，这种病害已经使小麦产业蒙受数百万美元的产量损失。在中西部和高平原，小麦疮痂病是近年来小麦生产的主要障碍。赤霉病除了攻击小麦外，还攻击大麦、燕麦、玉米和许多其他谷类并在其上繁殖。
[0006]这种严重的植物病害可由数种植物病原体引起，但主要由真菌属镰刀菌属(Fusarium)的数种物种引 起。例如，小麦赤霉病病害的致病物包括许多不同的镰刀菌属物种，例如，黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)(有性型，玉米赤霉菌(Gibberella zeae))、燕麦键刀菌(F.avenaceum)(有性型,燕麦赤霉菌(G.avenacea))、梨孢镰刀菌(F.poae),以及非镰刀菌属病原体诸如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale)(有性型，雪腐明梭抱菌(Monographella nivalis))和Microdochium majus。在美国、欧洲和世界上大多数农业重要国家，赤霉病的主要致病物为禾谷镰刀菌(有性型，狭义的玉米赤霉囷)。
[0007]这些病原体通常在植物残体上生存。它们在开花期间侵袭并损害谷物头部的小穗，从而阻止或部分阻碍谷物的谷物头部的发育。因此，侵袭的疮痂病病原体可灭杀谷物头部的一部分或整个谷物头部。一些受感染种子活力低下并且经常无法发芽。发芽的受感染种子由于冠腐病或根腐病而经常在苗期早期死亡，导致后面的作物植物站立欠佳。健康幼苗在出苗时也可能会被感染。除了站立欠佳、不稳(unthrifty)之外,如果条件对病害发展有利，那么病原体侵染造成的产量损失也可能会相当高。
[0008]镰刀菌属的真菌病原体蔓延到世界各地的谷物栽培区，并且已知会造成严重的损害，尤其是在开花期和灌浆期之间具有高降雨量的地区更是如此。当禾谷镰刀菌是致病物时，这种病害是首要关注的，不但因为它除了造成产量损失之外还会降低受污染谷物的商业价值，而且还因为镰刀菌感染还可能会导致单端孢霉烯霉菌毒素在谷物中的累积，从而威胁到人类和牲畜的健康。单端孢霉烯是全世界谷类的主要霉菌毒素污染物，导致非反刍动物拒食、呕吐、腹泻和体重减轻并且在暴露水平高时对其他动物和人类的健康构成威胁。这一威胁已因为在美国禾谷镰刀菌菌株最近朝向更高的产毒能力或活力的转变而加剧。最经常发现的霉菌毒素是脱氧瓜萎镰菌醇(DON，也称为呕吐毒素)和玉米烯酮(ZEA)。尤其是脱氧瓜萎镰菌醇是非常危险的毒素，导致食用受感染谷物的人和动物发生胃肠功能紊乱，伴有出血性病状等，在一些情况下导致死亡。因为脱氧瓜萎镰菌醇对PH的变化和高温一般具有稳定性，所以解毒可能非常困难。因此，受污染超出一定水平的谷物不能以任何的酿造、加工或牲畜饲料的形式使用，因而经常需要销毁。
[0009]迄今为止，已利用各种策略防治作物植物上的赤霉病。有前途的供选方案包括化学措施、对抗性作物栽培品种的开发，及田地作物轮作和耕作的传统实践。在这些供选方案中，化学杀害虫剂在减轻赤霉病侵染方面可能有些效果，但是有关杀真菌剂在作物发育后期，通常在就在收获前几周的开花期的使用的残留担忧减低了它们的吸引力。使用传统育种和遗传工程开发抗性栽培品种代表另一种可选的病害防治替代方案，这方面也出现进展。报道的遗传工程进展的实例包括改变植物激素的产量或操纵植物激素信号转导途径。近年来，在传统育种领域中，已在理解对赤霉病病害的抗性的遗传基础方面取得相当大的进展，并且已报道赋予抗性的许多基因和数量性状基因座(QTL)。然而，在提高作物对赤霉病病害的抗性方面的进展缓慢，主要是因为研究这种病害的难度。事实上，目前对牵涉到抗性或敏感性的机制的了解相对很少。另外，作为该病害的主要致病物的镰刀菌属物种的遗传多样性经常引发关于化学杀真菌剂和抗性栽培品种的功效将如何耐久的担忧。因此，目前大规模生产的几乎所有的小麦栽培品种仍然易受感染。 [0010]另外，尽管有望通过传统实践诸如在收获后犁地来掩埋受致病物，例如，禾谷镰刀菌侵染的作物残茬在防治赤霉病病害方面取得一些成功，但是常规的收获后田地耕作与少耕的土壤保持实践不相容。鉴于接种物可能会长距离散布并且多种多样的作物可以充当病原体的替代寄主，作物轮作经常是站不住脚的解决方案。除了环境中杀害虫剂残留问题之外，杀害虫剂抗性及谷物中DON含量增加的实例的报告也可能会影响到它们的使用。进一步地，成本及公共和私营部门对环境和食品安全中杀害虫剂残留的越来越多的担忧使得这种病害防治替代方案不那么有吸引力，并且已导致要求使用尽可能少的杀害虫剂进行作物栽培。
[0011]总起来说，尽管在开发防治赤霉病的技术方面取得相当大的进展，但是减少这种破坏性病害对谷物产量和质量的影响仍然是一个棘手的问题。因此，鉴定和开发新赤霉病防治技术是改进许多谷类作物的产量和质量所必不可少的。这些问题不仅在美国，而且在全球各地，包括亚洲和欧洲，都亟待解决。
[0012]自从20世纪90年代中期以来，赤霉病病害的生物防治已经吸引相当大的关注。生物防治剂(BCA)，尽管目前的数量非常有限，但可能是显著降低由诸如镰刀菌的病原体引发的病害的水平的环境上可接受的方法。公众接受度、与其他病害管理措施的相容性，及耐久性是支持开发生物防治赤霉病病害的策略的有利因素之一。生物防治剂可在有机谷类生产中发挥重要作用。在常规生产中，此类药剂在化学杀真菌剂不能再施加后，可延长对穗的保护至跨越开花期。迄今为止，已经在生物防治领域取得显著进展。例如，产孢子细菌(诸如芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的物种)和酵母菌(诸如隐球菌属(Cryptococcus)的物种)的某些菌株在防治赤霉病病害和减少霉菌毒素污染上显示出一些前景。然而，尽管取得这些和其他进展，但仍然需要用于赤霉病病害的生物防治的改良微生物体。尽管BCA已成为更能让人接受的植物病原体解决方案并且BCA产品已得到比以往任何时候都更高的程度的销售，但是迄今为止很少有人尝试开发生物防治赤霉病病害的策略和拮抗微生物体。此外，镰刀菌属某些种及赤霉病病害的其他致病物的生命周期提示，该病原体可以潜在地易受使用处于不同发育阶段的拮抗微生物体的生物防治技术影响。因而，需要鉴定优选具有不同作用模式的新生物防治剂，以及可帮助有效预防或阻抑赤霉病病害发展的生物防治方法。
[0013]发明概述
[0014]本文提供了包含微生物菌株和培养物的组合物。某些菌株、培养物，及其组合物可用于防治，例如，包括小麦和其他谷类植物在内的各种作物植物的赤霉病病害。还提供了生物防治组合物及使用其预防、抑制或治疗植物病原体的发育或病害的发展以及维护植物产量的方法。还提供了作为生物防治剂的此类组合物与其他农业上有效的防治有害植物病原体的化合物或组合物组合使用的方法。
[0015]在一方面，本发明提供了具有对抗赤霉病病害的阻抑活性的分离的微生物菌株。根据本发明这个方面的微生物菌株选自由微杆菌属、芽孢杆菌属、球腔菌属和贪噬菌属组成的组。在一些优选实施方案中，微生物菌株选自由以下组成的组:球腔菌属菌株SG1-010-H11(保藏号为NRRL50471)、微杆菌属菌株SG1-014-C06 (保藏号为NRRL B-50470)、微杆菌属菌株SG1-005-G08 (保藏号为NRRL_-—)、贪噬菌属菌株SG1-014-G01 (保藏号为 NRRL B-50469)、芽孢杆菌属菌株SG1-015-F03 (保藏号为NRRLB-50760)、芽孢杆菌属菌株SG1-015-H06(保藏号为NRRL B-50761)，及其中任何一者的杀虫活性变异体。根据一些其他优选实施方案的微生物菌株可包含与序列表中任何一个核苷酸序列展现至少85%的序列同一性的DNA序列。进一步提供了本文所公开的微生物菌株的生物上纯的培养物和富集培养物。
[0016]还在本发明的另一方面提供了组合物，其包含本发明微生物菌株或其培养物，及农业上有效的量的选自由以下组成的组的化合物或组合物:杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂、杀害虫剂和肥料。在这个方面的一些实施方案中，组合物可被制备成选自由以下组成的组的制剂:乳状液、胶体、粉状物(dust)、颗粒剂、小丸剂、粉剂(powder)、喷洒剂、乳状液和溶液。在一些其他实施方案中，组合物可与载体一起提供。在一些优选实施方案中，载体为农业上可接受的载体。在一些特别优选的实施方案中，载体为植物种子。在其他优选实施方案中，组合物为种子包衣制剂。在本公开中进一步提供了用根据本发明的组合物包衣的种子。
[0017]在本发明的另一方面，提供了预防、抑制或治疗植物病原体的发育的方法。该方法涉及在寄主植物的生长培养基或土壤中的寄主植物生长之前或与其同时，让本发明微生物菌株或其培养物在该生长培养基或土壤中生长。在这个方面的一些优选实施方案中，该植物病原体引起赤霉病病害。在一些特别优选的实施方案中，该植物病原体为禾谷镰刀菌。
[0018]在本发明的又一个方面，提供了预防、抑制或治疗植物赤霉病病害的发展的方法。该方法涉及将有效量的本发明微生物菌株或其培养物施加至植物上，或施加至植物的周围环境中。在一个实施方案中，此种赤霉病病害由真菌禾谷镰刀菌引起。在这个方面的一些实施方案中，将微生物菌株或其培养物施加至土壤、种子、根、花、叶、植物的一部分，或整株植物上。在优选实施方案中，该植物易受禾谷镰刀菌感染。在一些其他优选实施方案中，该植物为小麦植物、玉米植物、大麦植物，或燕麦植物。在另一个优选实施方案中，本发明微生物菌株或其培养物被确定为植物上的内生菌。
[0019]本发明的另一个进一步方面提供了非天然产生的植物。非天然产生的植物经受本发明微生物菌株或其培养物的人工感染。在这个方面的一些优选实施方案中进一步提供了非天然产生的植物的种子、生殖组织、营养组织、植物部件和子代。
[0020]本发明的又一个方面提供了制备农业组合物的方法。该方法涉及将根据本发明的微生物菌株或其培养物接种到底土层(substratum)中或底土层上,并让它在1_37°C的温度下生长直至获得许多的、每毫升或每克至少IO2-1O3个的细胞或孢子。
[0021]根据本发明的以下详细描述和权利要求书，本发明的这些和其他目的和特征将变得更为显而易见。
[0022]发明详述
[0023]一胜定 SI
[0024]除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、符号及其他科学术语或专门名词意图具有本发明所属领域技术人员所通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中出于清楚和/或便于参考的目的加以定义，并且在本文中纳入此类定义应不必解释为代表与本领域中一般理解的含义有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是熟知的并且通常由本领域技术人员通过使用常规方法加以采用。
[0025]除非上下文另 外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该(所述)”包括复数指代。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括它们的混合物。
[0026]在本文可互换使用的关于微生物体的措辞“拮抗微生物体”和“微生物拮抗剂”，意图意指受试者菌株表现出的赤霉病病害的抑制程度以统计学上显著的水平超过未经处理的对照。
[0027]抗生素:如本文所使用的术语“抗生素”是指能够灭杀微生物体或抑制微生物体的生长的任何物质。抗生素可以通过以下任一种或多种方式生产:1)微生物体、2)合成工艺，或3)半合成工艺。抗生素可以是分泌挥发性有机化合物的微生物体。此外，抗生素可以是由微生物体分泌的挥发性有机化合物。
[0028]杀细菌:如本文所使用的术语“杀细菌”是指组合物或物质增加细菌的死亡率或抑制细菌的生长速率的能力。对细菌生长速率的抑制通常可量化为随着时间的推移能存活的细菌细胞的减少。
[0029]生物防治:如本文所使用的术语“生物防治”和其缩写形式“生物防治(biocontrol) ”被定义为使用至少一种除人以外的第二生物体来防治病原体或昆虫或任何其他不期望的生物体。已知的生物防治机制的实例是使用通过与真菌争夺根表面上的空间而防治根腐病的微生物体或抑制病原体生长或灭杀病原体的微生物体。在生物防治的上下文中的“寄主植物”是易受病原体引起的病害感染的植物。在将诸如真菌物种的生物体从其天然环境分离出来的上下文中，“寄主植物”是支持真菌生长的植物，例如真菌作为内生菌的物种的植物。
[0030]如本文所使用的术语“谷类”意图指可能易受赤霉病病害感染的任何谷类物种。报道易受感染的谷类包括小麦、大麦、燕麦和黑小麦，尽管小麦和大麦是这种病害在其中带来显著经济问题的两种作物。
[0031]“有效量”是指足以影响有益或所需结果的量。就病害管理、治疗、抑制或保护来说，有效量是足以阻抑、稳定、逆转、减慢或延迟靶标感染或病害状态的进展的量。因此，措辞“有效量”在本文中用于指相对于未经处理的对照中发生的情况获得病原体发育水平的降低和/或病原性病害水平的降低所必需的拮抗剂处理剂的量。通常，给定拮抗剂处理剂的有效量在合适的处理条件下提供了相对于未经处理的对照中发生的病害水平和/或病原体发育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之间，更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，以及甚至更通常介于90%至95%之间的降低。有效量可以在一次或多次施用中施用。液体制剂的实际施加速率范围将通常在最小约I X IO3至约I X IOltl能存活细胞/mL，优选在约I X IO6至约5 X IO9能存活细胞/mL。在大多数情况下，下面实施例中描述的本发明拮抗微生物菌株在范围为约IX IO6至IX IO9能存活细胞/mL的施加速率下将是最佳有效的，假定施加模式将实现与至少约50%的植物组织基本上均匀地接触。如果拮抗剂作为固体制剂来施加，则应该控制施加速率以使得每单位面积的植物组织表面的能存活细胞数量与通过前述的液体处理速率获得的数量相当。通常，当以超过106CFU/g(菌落形成单位/克)，优选超过107CFU/g，更优选108CFU/g，最优选109CFU/g的浓度递送时，本发明的生物防治剂是生物上有效的。
[0032]进一步地，如本文使用的关于微生物体的措辞“有效微生物拮抗剂”意图意指受试者微生物菌株表现出的赤霉病病害的抑制程度以统计学上显著的水平超过未经处理的对照的水平。通常，有效的微生物拮抗剂在合适的处理条件下具有实现相对于未经处理的对照中发生的病害水平和/或病原体发育水平的至少20%，或更通常介于30%至40%之间，更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，以及甚至更通常介于90%至95%之间的降低的能力。
[0033]组合物:“组合物”意图表示活性剂与至少另一种化合物、载体或组合物的组合，所述至少另一种化合物、载体或组合物是惰性的(例如，可检测试剂或标记或液体载体)或活性的，诸如杀虫剂。
[0034]分离的微生物菌株、分离的培养物、生物上纯的培养物和富集培养物:如本文所使用的，如应用于微生物体(例如，细菌或微真菌)上的术语“分离的”是指已从其天然产生的环境中移出和/或纯化出的微生物体。因此，如本文所使用的微生物的“分离菌株”是指已从其天然的周围环境中移出和/或纯化出的菌株。因而，“分离的微生物体”不包括寄居在其天然产生的环境中的微生物体。进一步地，术语“分离的”未必反映微生物纯化的程度。微生物菌株的“实质上纯的培养物”是指实质上不含除所需的一种或多种微生物菌株以外的其他微生物的培养物。换句话说，微生物菌株的实质上纯的培养物实质上不含其他污染物，所述污染物可以包括微生物污染物以及不期望的化学污染物。进一步地，如本文所使用的，“生物上纯的”菌株意图表示与在自然界通常与其相关联的物质分离的菌株。应注意，与在自然界通常未发现的其他菌株或化合物或物质相关联的菌株仍被定义为“生物上纯的”。特定菌株的单一培养物当然是“生物上纯的”。如本文所使用的，术语分离的微生物菌株的“富集培养物”是指含有超过50%、60%、70%、80%、90%或95%的分离菌株的微生物培养物。
[0035] 如本文所使用的，“内生菌”是在其生命期的至少一部分时间内定居在植物内而不引起明显病害的内生共体。内生菌可垂直传播(从亲代直接传播至后代)或水平传播(从个体传播至无亲缘关系的个体)。垂直传播的内生真菌通常是无性的，并且经由透入寄主种子的真菌菌丝从母体植物传播至后代。内生细菌也可以从种子垂直转移至幼苗中(Ferreira等，2008)。相反地，水平传播的内生菌通常是有性的，并且经由可被风和/或昆虫媒介扩散的孢子传播。作物植物的内生菌由于它们的防治病害和昆虫侵染以及促进植物生长的能力而获得相当多的关注。
[0036]功能相当的蛋白质:如本文所使用的短语“功能相当的蛋白质”描述具有至少一种共同特征的那些蛋白质。此类特征包括序列相似性、生物化学活性、转录模式相似性和表型活性。通常，功能相当的蛋白质共享一些序列相似性或至少一种生物化学活性。在这个定义内，同系物、直向同系物、旁向同系物和类似物被认为是功能相当的。另外，功能相当的蛋白质一般共享至少一种生物化学和/或表型活性。功能相当的蛋白质将会引起类似，但未必相同的程度的相同性质。通常，在定量测量时，由于功能相当的蛋白质中的一者是另一者的至少20%，更通常介于30%至40%之间，甚至更通常介于50-60%之间，甚至更通常介于70%至80%之间，甚至更通常介于90%至95%之间，甚至更通常介于98%至100%之间，功能相当的蛋白质给出相同的特征。
[0037]杀真菌:如本文所使用的，“杀真菌”是指组合物或物质降低真菌的生长速率或增加真菌的死亡率的能力。
[0038]镰刀菌属真菌:为了本发明的目的，应理解，术语镰刀菌属真菌的使用意图包括这种生物体的有性(有性型)阶段，并且还包括无性(无性型)阶段，它们也分别称为完全和非完全真菌阶段。例如，禾谷镰刀菌的变形阶段是玉米赤霉菌，赤霉病病害的致病物。这种病害通常在当花或种子头部接种了分生孢子时发生，该分生孢子由子囊孢子的不完全形式产生，子囊孢子由这种真菌的完美形式产生。
[0039]突变体:如本文 所使用的，有关微生物体的术语“突变体”或“变异体”是指亲代菌株的修饰，其中所需生物活性与亲代菌株表达的生物活性类似。例如，在微杆菌属的情况下，“亲代菌株”在本文被定义为诱变之前的原始微杆菌属菌株。突变体或变异体可以自然产生，无需人为干预。它们也可以通过用本领域技术人员已知的多种方法和组合物处理获得或者通过本领域技术人员已知的多种方法和组合物获得。例如，亲代菌株可用化学物诸如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍、乙基甲烷砜处理，或通过使用Y、X射线照射处理，或UV-照射处理，或通过本领域技术人员熟知的其他方式处理。
[0040]杀线虫:如本文所使用的术语“杀线虫”是指物质或组合物增加线虫的死亡率或抑制线虫的生长速率的能力。
[0041]病原体:如本文所使用的术语“病原体”是指能够在植物或动物中产生疾病的生物体，诸如藻类、蛛形纲动物、细菌、真菌、昆虫、线虫、寄生植物、酵母菌、原生动物或病毒。如本文所使用的术语“植物病原体”是指感染植物的病原性生物体。
[0042]同一性百分比:如本文所使用的“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳局部比对的序列确定的，所述比较窗口由两个序列之间的局部比对的长度限定。与用于两个序列的最佳比对的参考序列(不包含添加或缺失)相比较，比较窗口中的氨基酸序列可包含添加或缺失(例如缺口或突出端)。两个序列之间的局部比对仅包括根据取决于用来进行比对的算法(例如BLAST)的标准视为足够相似的每个序列的区段。如下计算同一性百分比:确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目从而产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100。比较用序列的最佳比对可通过Smith和Waterman (1981) Add.APL.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443，1970)的总体同源性比对算法、Pearson 和Lipman (Proc, Natl.Acad.Sc1.USA85:2444, 1988)的相似性搜索方法、这些算法的探试实施(NCBI BLAST, WU-BLAST, BLAT, SIM, BLASTZ)或通过观察来进行。假设有两个经鉴定用于比较的序列，优选使用GAP和BESTFIT确定它们的最佳比对。通常，使用默认值缺口权重5.00和缺口权重长度0.30。多核苷酸或多肽序列之间的术语“基本序列同一性”是指这样的多核苷酸或多肽，其包含使用该程序与参考序列相比较具有至少50%的序列同一性，优选至少70%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%，最优选至少96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。
[0043] 可针对存在于公共或专有数据库中的提交核酸或氨基酸序列搜索查询核酸和氨基酸序列。此类搜索可使用 National Center for Biotechnology Information BasicLocal Alignment Search Tool (NCBI BLAST v2.18)程序完成。NCBI BLAST 程序可在因特网上从 National Center for Biotechnology Information (blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast, cgi)获得。通常，可以使用以下的NCBI BLAST参数:过滤选项设为“默认”，比较矩阵设为“BL0SUM62”，缺口成本设为“存在:11，延伸:1”，字体大小设为3，预期值(E阈值)设为le-3，并且局部比对的最小长度设为查询序列长度的50%。序列同一性和相似性也可以使用 GenomeQuest? 软件(Gene-1T, Worcester Mass.USA)确定。
[0044]如本文所使用的术语“杀害虫”是指物质或组合物降低害虫，即不期望生物体的生长速率，或增加害虫的死亡率的能力。
[0045]生物防治剂对植物病原体的“阻抑活性”意指该药剂阻抑、抑制、稳定、逆转、减慢或延迟病原体本身的发育，或由病原体引起的感染或病害状态的进展的能力。
[0046]变异体:如本文所使用的关于微生物体的“变异体”是这样的菌株，其具有它所属的物种的识别特征，同时相对于亲代菌株具有至少一种核苷酸序列变异或可识别的不同性状，其中该性状以基因为基础(可遗传的)。例如，对于具有杀真菌活性的微杆菌属SG1-SG1-014-C06菌株，可识别的性状包括I)阻抑禾谷镰刀菌及其有性型玉米赤霉菌的生长的能力；2)阻抑赤霉病病害的发展的能力；3)具有与微杆菌属SG1-014-C06的管家基因有大于95%、大于96%、大于97%、大于98%,或大于99%的序列同一性的管家基因，可用于证实变异体为微杆菌属SG1-014-C06。
[0047]对于核酸和多肽，术语“变异体”在本文用于表示与参考多肽或多核苷酸相比较分别在其氨基酸或核酸序列上具有一些合成产生或天然产生的差别的多肽、蛋白质或多核苷酸分子。例如，这些差别包括在参考多肽或多肽中的置换、插入、缺失或任何所需的此类变化的组合。多肽和蛋白质变异体可进一步由电荷变化和/或翻译后修饰(诸如糖基化、甲基化、磷酸化等)组成。
[0048]本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，引用程度如同每篇单独的出版物或专利申请均被具体单独地指出以引用的方式并入。
[0049]不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的论述陈述其作者所声称的内容，本 申请人:保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地了解，尽管在本文中提及许多现有技术出版物，但是这种提及并不构成对任何这些文献形成本领域中公知常识的一部分的承认。
[0050]分类学鉴定的方法
[0051]微生物体经常可基于直接显微镜分析(检查时样品中的所有细胞是否看起来一样)、染色特征、简单分子分析(诸如简单的限制性片段长度多态性(RFLP)测定)等辨别。除了如在本公开的实施例2-3中描述的此类分类学分析技术的说明性实例之外，微生物体的分类学鉴定还可涉及多达数种不同水平的分析，并且每种分析可基于生物体的不同特征。此类分类学分析可包括基于核酸的分析(例如，针对个别特定基因的关于它们的存在或它们的确切序列的分析，或者对具体基因或基因家族的表达的分析)、基于蛋白质的分析(例如，在功能水平上使用直接或间接酶测定，或者在结构水平上使用免疫检测技术)，等等。[0052]a.基于核酸的分析:本领域普通技术人员将会意识到，多种多样的基于核酸的技术是已知的并且可用于获得给定微生物体的分类学鉴定。这些技术可用来通过基因序列鉴定细胞或者可用来鉴定具有具体基因或基因家族的细胞。可用于分类学研究的常见基因家族包括16S基因家族、肌动蛋白基因家族和重组酶A(recA)基因家族。这些方法通常包括从非常少数量的细胞中扩增和测序基因，因此经常克服了从稀释的悬浮液浓缩细胞及其DNA的问题。术语“核酸扩增”一般是指增加样品或样本中核酸分子的拷贝数的技术。可用于核酸扩增的技术是本领域中熟知的。核酸扩增的实例是聚合酶链反应(PCR)，其中使从受试者收集的生物样品与一对寡核苷酸引物在允许该引物与样品中的核酸模板杂交的条件下接触。将引物在合适的条件下延伸，从模板解离，并接着再退火，延伸并解离从而扩增核酸的拷贝数。活体外扩增技术的其他实例包括链置换扩增、无转录等温扩增、修复链反应扩增、连接酶链反应、缺口填充连接酶链反应扩增、联合的连接酶检测和PCR，以及无RNA转录的扩增。
[0053]除了本文提供的说明性实例引物之外，参见，例如，实施例2-3和序列表，对于个别物种或系统发育组的微生物体，也已经照惯例地设计了引物并且新的引物正在不断被设计。此类被狭窄靶向的引物可以与本文所描述的方法一起使用，从而仅特异性地筛选和/或鉴定感兴趣的微生物体。
[0054]用于制备和使用核酸引物的方法描述在例如Sambrook等(见MolecularCloning:A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel 等(编著)(见 CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York, 1998)中。扩增引物对可以来源于已知的序列，例如通过使用预期用于这一目的的计算机程序诸如Primer (WhiteheadInstitute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)获得。本领域普通技术人员将了解，具体探针或引物的特异性随着它的长度而增加。因此，例如，包含rRNA编码核苷酸或其侧接区域的30个连续核苷酸的引物将退火至具有比仅15个核苷酸的对应引物的特异性更高的特异性的靶标序列。因此，为了获得更高特异性，可以选择包含诸如16S rRNA的靶标核苷酸序列的至少20、25、30、35、40、45、50或更多个连续核苷酸的探针和引物。
[0055]用于制备可用于核酸应用(例如，PCR)的核酸的常见技术包括苯酚/氯仿提取或者使用在市场上可获得的许多DNA提取试剂盒中的一种。可以进行DNA扩增的另一种方式是通过将细胞直接添加至核酸扩增反应混合物中并且依靠扩增的变性步骤来裂解细胞和释放DNA。[0056]核酸扩增反应的产物可以通过本领域中熟知的一种或多种标准技术来进一步表征，这些技术包括电泳、限制性核酸内切酶酶切图谱、寡核苷酸杂交或连接，和/或核酸测序。当杂交技术用于细胞鉴定目的时，多种探针标记方法可能是有用的，包括荧光标记法、放射性标记法和非放射性标记法。当使用核酸测序技术时，可以使用各种已知序列数据库进行经扩增核酸分子的核苷酸序列的同系物搜索，所述数据库包括但不限于DDBJ/GenBank/EMBL 数据库。
[0057]b.基于蛋白质的分析:除了核酸的分析之外，还可以直接基于特定蛋白质的存在(或不存在)在分类学上表征和鉴定微生物体。此种分析可以是基于具体指定的蛋白质的活性，例如通过酶测定或通过共培养的生物体的反应，或通过具体指定的蛋白质的单独存在(其例如可以使用免疫学方法诸如原位免疫荧光抗体染色来测定)。
[0058]酶测定:举例来说，可以将荧光或发色底物类似物包括进生长培养基(例如，微量滴定板培养物)中，接着进行温育并针对反应产物进行筛选，从而基于它们的酶活性来鉴定培养物。
[0059]共培养反应:在本发明的一些实施方案中，可以基于共培养生物体(例如报告生物体)的反应(或反应程度)来测定由微生物分离株携带的酶的活性。
[0060]还可以使用多种方法通过使至少一种抗体或抗体来源分子结合至微生物体的分子或更具体地分子的表位来鉴定从源环境中选择和分离的微生物体。
[0061]抗微生物体蛋白质抗体可以使用描述于许多教科书中的标准程序来产生，所述教科书包括 Harlow 和 Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988) ? 可以通过使用常规程序或通过修改常规程序来容易地确定特定试剂实质上仅结合至所需微生物体的蛋白质。一种合适的活体外测定利用了蛋白质印迹程序(描述于许多标准教科书中，包括 Harlow 和 Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988))。
[0062]更短的抗体片段(抗体来源分子,例如FAb、Fv和单链Fv (SCFv))也可以用作特异性结合试剂。制备这些片段的方法是常规的。
[0063]与本发明阵列上的细胞结合的抗体的检测可以使用提供可检测的信号例如荧光或发光信号的标准技术，例如ELISA测定。
[0064]本发明的分离的培养物
[0065]如在本公开的实施例部分中更详细描述的， 申请人:已发现数种农业上有益的新型微生物体，例如，赤霉病病害的有效阻抑剂。具体地，这些新型拮抗微生物体对于降低赤霉病的严重性以及对于抑制小麦赤霉病病害的主要致病物禾谷镰刀菌的生长有效。从具有大约5，000个微生物菌株的库鉴定微生物拮抗剂，所述大约5，000个微生物菌株是从收集自美国不同地点的野生植物样品中获得的。基于在活体外拮抗测定中拮抗微生物体阻抑禾谷镰刀菌病原体及其有性型玉米赤霉菌的发育的能力，对该微生物体进行初步选择。然后，针对微生物菌株降低真菌感染的严重性的能力及针对它们维护种子产量的能力，在温室研究中在小麦幼苗上对所选择的微生物拮抗剂进行生物测定，其涉及给幼苗接种微生物菌株，接着重复接种禾谷镰刀菌孢子。发现以这种方式选择的拮抗微生物体在温室试验中有效地降低赤霉病的严重性。
[0066] 分类学分析进一步确定本公开中描述的每种拮抗微生物体均是具有近亲缘关系的细菌的微杆菌属、细菌的芽孢杆菌属、细菌的贪噬菌属，或真菌的球腔菌属。[0067]微杆菌属是微杆菌科的典型属，一般被认为提供革兰氏阳性、不形成孢子、呈杆状的细菌，其最初在产乳酸细菌的早期研究期间分离出来。微杆菌属成员最初的主要特征是它们的显著耐热性、存在于乳制品中，及从葡萄糖产生少量L(+)乳酸。与其中物种以相关肽聚糖类型为特征的微杆菌科的其他属相比，微杆菌属物种在肽间桥中或在B型肽聚糖的3位处具有鸟氨酸或赖氨酸。在诸如类异戊二烯醌(MK-11、MK-12、MK-13)、极性脂质、脂肪酸及DNA碱基组成的其他化学分类学性质中，该属的成员表现出在微杆菌科的其他属中发现的通常的多样性范围。微杆菌属和金杆菌属这两个细菌属可以根据一些分类学研究联系起来。迄今为止，微杆菌属的成员包含至少33个物种，它们已从包括土壤、乳制品、植物虫瘿、昆虫或临床标本在内的广泛范围的生境分离出来。Evtushenko和Takeuchi (2006)最近概述了它们的生态学、系统发育、分类学、培养方法和长期保存条件的各个方面。本领域技术人员将容易了解可以主要通过以下任一项技术在分类学上鉴定微杆菌属的微生物体:包括细胞壁肽聚糖的化学分类学分析在内的上文描述的分类学鉴定技术，及如Evtushenko和Takeuchi (2006)和其中引用的参考文献中描述的16S rDNA序列比较分析，以及本公开的实施例2-3中描述的那些。如下面详细论述的，迄今为止，数种天然产生的微生物体已被报道具有对抗赤霉病病害的拮抗活性。然而，在本发明之前没有描述具有此种拮抗活性的微杆菌属微生物体的报道。进一步地，在本发明之前，本发明人没有获悉使用微杆菌属细菌菌株作为生物防治剂来预防、抑制或治疗赤霉病病害的致病病原体的发育的任何方法或工艺。
[0068]芽孢杆菌属是革兰氏阳性/可变、形成孢子、呈杆状的细菌的属。与和微生物学早期历史相关的其他属诸如假单胞菌属或弧菌属类似，芽孢杆菌属的将近266个物种成员遍在地存在，并且它被广泛地认为是具有最大16S多样性和环境多样性的属之一。芽孢杆菌属物种可以是专性需氧菌或兼性厌氧菌，并且对过氧化氢酶测试呈阳性。芽孢杆菌属在自然界遍在地存在，既包括独立生存的物种，又包括病原物种。在应激的环境条件下，细胞产生可保持长时间休眠的椭圆形内生孢子。这些特征最初定义了该属，但是并非所有此类物种都具有近亲缘 关系并且许多被转移至其他属。事实上，数项研究已试图重建该属的系统发育。覆盖有最大多样性的芽孢杆菌属特定研究由Xu和Cote [Intl.J.0f Syst.Evol.Microbiol.53(3): 695-704; 2003]使用16S和ITS区进行，在这里该属被分成10个组，包括嵌套(nested)的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短小芽孢杆菌属(Brevibacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、海洋芽孢杆菌属(Marinibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)0然而，根据更新的研究，芽孢杆菌属含有非常大的数量的嵌套分类群且尤其在16S和23S中，它由于Bacillus coahuilensis和其他而被认为是乳杆菌目(乳杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、李斯特菌属等)的并系群(参见,例如,Yarda等,Syst.Appl.Microbiol.31(4): 241-250，2008 ;Yarda等，Syst.Appl.Microbiol.33 (6): 291-299，2010]。在目前分类标准下由炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、腊状芽孢杆菌(B.cereus)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、假蕈状芽孢杆菌(B.pseudomycoides)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和韦氏芽抱杆菌(B.weihenstephanensis)形成的一个特定分支应当是单一物种(在97%的16S同一性内)，但是由于医学原因，它们被认为是分开的物种。除了本公开的实施例2-3中描述的分类学分析方法之外，芽孢杆菌属物种的系统发育和分类学分析还可以通过多种技术进行，所述技术包括在Xu和Cote, 2003 ；Yarda等,2008 ；Yarda等，2010中详细论述的那些。
[0069]贪曬菌属最初是通过将争论产碱菌(Alcaligenes paradoxus)再分类为争论贪曬菌(Variovorax paradoxus) (Willems等，1991)而创建的，争论贪卩遼菌被广泛地认为是这个属的典型物种。争论贪噬菌作为新型生物降解剂以及微生物/微生物相互作用和微生物/植物相互作用的模型得到广泛研究。其他物种包括V.dokdonensis、V.soli (Kim等，2006)和V.boronicumulans (Miwa等，2008)。贪噬菌属物种在分解代谢上是非常多样的并且与其他细菌物种以互利相互作用的方式参与许多生物降解，并因此具有生态重要性和高应用潜力。例如，土壤甲烷营养菌(soilmethanotroph)仅在与争论贪噬菌菌株一起共培养时才表现出对甲烷(非常强烈的温室气体)的高亲和力，并且这种性状在实验室培养物中通常观察不到。类似地，已发现贪噬菌属的近亲属为光合营养聚生体“聚生染绿菌(Chlorochromatium aggregatum) ”内的核心非光合成伴侣。贪曬菌属的一些物种也具有干扰其他细菌通讯的能力。贪噬菌属的另一些其他物种可以与各种生态系统中的其他生物群(例如，植物)紧密地相互作用。而且，一些寄居于刚好在植物根部外面和/或在植物内的区域中的贪噬菌属物种已被报道能够经由以下方式促进植物生长:减少乙烯的水平、阻遏群体感应控制的发病机制，及增加对重金属的抵抗力，这些大大有利于植物修复。除了本公开的实施例2-3中描述的分类学分析方法之外，贪噬菌属物种的系统发育和分类学分析还可以通过包括本文其他地方详细论述的技术在内的多种技术进行。
[0070]球腔菌属是非常大的真菌属，具有超过2，000个物种名称和至少500个与多于40个无性型属(尤其尾孢菌属(Cercospora)、假尾孢菌属(Pseudocercospora)、壳针孢属(Septoria)、柱隔孢属(Ramularia)等)相关的物种。另外，数千个无性型缺乏有性型。球腔菌属包括作为病原体、污水生物、内生菌，或具有共生关系的物种。它们的生态学、系统发育、分类学、培养方法和长期保存条件的各个方面最近已被报道(参见，例如，Crous等，Persoonia, 23:119-146，2009)。本领域技术人员将容易了解可通过上文描述的任何分类学技术或它们的组合 在分类学上鉴定球腔菌属的微生物体。最常用的技术包括如在例如Crous 等，Studies in Mycology, 55:235-253，2006 ;Crous 等，2009,同上文；Goodwin 等，Phytopathology 91: 648-658，2001描述的使用16S rDNA序列和内转录间隔区的序列比较分析；及本公开的实施例2-3中描述的那些。
[0071]生物材料的保藏
[0072]已经依据用于专利程序的布达佩斯条约和其下的规定(布达佩斯条约)，将鉴定出具有对抗赤霉病病害的阻抑活性的纯化的微生物菌株培养物保藏于农业研究服务培养物保藏中心(位于 1815N.University Street, Peoria, IL61604, USA) (NRRL)。这些保藏物的登录号如下:
[0073]
【权利要求】
1.一种分离的微生物菌株,其选自由微杆菌属菌株、芽孢杆菌属菌株、球腔菌属菌株和贪噬菌属菌株组成的组，其中所述微生物菌株具有对抗赤霉病病害的阻抑活性。
2.根据权利要求1所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株选自由以下组成的组:球腔菌属菌株SG1-010-H11(保藏号为NRRL50471)、微杆菌属菌株SG1-014-C06 (保藏号为NRRL B-50470)、微杆菌属菌株SG1-005-G08 (保藏号为NRRL_-—)、贪噬菌属菌株SG1-014-G01 (保藏号为NRRL B-50469)、芽孢杆菌属菌株SG1-015-F03 (保藏号为NRRLB-50760)、芽孢杆菌属菌株SG1-015-H06(保藏号 为NRRL B-50761)，及其中任何一者的杀虫活性变异体。
3.根据权利要求2所述的分离的微生物菌株，其中所述微生物菌株包含与序列表中任何一个核苷酸序列展现至少85%的序列同一'丨生的DNA序列。
4.一种根据权利要求1所述的微生物菌株的生物上纯的培养物。
5.一种根据权利要求1所述的微生物菌株的富集培养物。
6.一种组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物，及农业上有效的量的选自由以下组成的组的化合物或组合物:杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂、杀害虫剂和肥料。
7.一种组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物，及载体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述载体为农业上可接受的载体。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述载体为植物种子。
10.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被制备成选自由以下组成的组的制剂:乳状液、胶体、粉状物、颗粒剂、小丸剂、粉剂、喷洒剂、乳状液和溶液。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述组合物为种子包衣制剂。
12.—种种子，其具有包含根据权利要求7所述的组合物的包衣。
13.—种预防、抑制或治疗植物病原体的发育的方法，其中所述方法包括在寄主植物的生长培养基或土壤中的寄主植物生长之前或与其同时，让根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物在所述生长培养基或土壤中生长。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述植物病原体引起赤霉病病害。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述植物病原体为禾谷镰刀菌。
16.一种预防、抑制或治疗植物赤霉病病害的发展的方法，其中所述方法包括将有效量的根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物施加至所述植物上，或施加至所述植物的周围环境中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中将所述微生物菌株或其培养物施加至土壤、种子、根、花、叶、植物的一部分，或整株植物上。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述植物易受禾谷镰刀菌感染。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述植物为小麦植物、玉米植物、大麦植物，或燕麦植物。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述微生物菌株或其培养物被确定为在所述植物上的内生菌。
21.一种非天然产生的植物，其是用根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物进行人工感染的植物。
22.根据权利要求21所述的非天然产生的植物的种子、生殖组织、营养组织、植物部件，或子代。
23.—种制备农业组合物的方法，其中所述方法包括将根据权利要求1-5中任一项所述的微生物菌株或其培养物接种到底土层中或底土层上，并让所述微生物菌株或其培养物在1_37°C的温度下生长直至获得许多的、每毫升或每克至少IO2-1O3个的细胞或孢子。
【文档编号】A01H5/00GK103974620SQ201280046495
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2012年7月24日 优先权日:2011年7月25日
【发明者】C·J·格兰德利克, W·A·格林, J·S·克罗沃, R·T·麦卡恩 申请人:孟山都技术公司