具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法

具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体以及包含这些多核苷酸的宿主细胞连同生产和使用这些多肽的方法。
【专利说明】具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
[0001] 参考一个序列表
[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码这些蛋白酶的分离核酸序列。本发 明还涉及含有这些核酸序列的核酸构建体，载体和宿主细胞（包括植物和动物细胞），以及 制备和使用这些蛋白酶的方法，尤其这些蛋白酶在动物饲料和洗涤剂中的应用。
[0005] 相关技术说明
[0006] 本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0007] 洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用不同的酶超过30年，最常使用的酶包括 各自适应于去除各种类型污渍的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。除了酶之外，洗涤剂组合物典型 地包括复杂的成分组合。例如，大部分清洁产品包括表面活性剂系统、漂白剂或助洗剂。鉴 于当前洗涤剂的复杂性，仍需要开发包含新酶和/或酶掺混物的新洗涤剂组合物。
[0008] 传统上，在升高的温度进行洗涤并且选择熟知的洗涤剂在较高温度进行洗涤。
[0009] 关注于改善洗涤过程以便使得它们更为环境友好地增加导致全球范围内倾向于 降低洗涤时间、pH和温度和减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。
[0010] 因此存在着在较低温度洗涤的需求以及因此对于在低温具有高性能的洗涤剂蛋 白酶的需要。
[0011] 在动物饲料中使用蛋白酶(体内)和/或使用这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白质 (体外）中，注意的是蛋白质对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物 性蛋白质来源获得这些必需蛋白质。重要的植物性蛋白质来源是例如油籽作物、豆类和谷 类。
[0012] 当例如大豆饼粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当大比例的大豆饼粉 固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化 率仅是80%左右)。
[0013] 动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家 禽以及许多鱼中，胃展现了低至PH1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH6-7范围内的一个更中 性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的 饲料并因此典型地处于PH4-6的范围内。蛋白酶消化蛋白质可发生在整个消化道中，假如 该蛋白酶是有活性的并在该消化道的条件下存活。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希 望的的：它们是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是 有效地有活性的。
[0014] 另外，动物饲料常常是以颗粒形式配制的，其中在该造粒过程采用蒸汽。因此以下 也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。
[0015] 在动物饲料中使用蛋白酶以改善饲料中的蛋白质的消化是已知的。W095/28850 披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶的组合以提高植物性蛋白质的溶 解度。WOO 1 /58 2 7 5披露了在动物饲料中使用枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定蛋白酶。 TOO 1/58276披露了与以下蛋白酶相关的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途：衍生自拟诺 卡菌属NRRL18262 (10R蛋白酶）的蛋白酶，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM14010的蛋白酶。 W004/072221、TO04/111220、TO04/111223、TO05/035747、和 TO05/123911 披露了与 10R 蛋 白酶相关的蛋白酶和它们在动物饲料中的用途。另外，W004/072279披露了其他蛋白酶的 用途。
[0016] W004/034776披露了枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌的PWD-1在家 禽饲料中的用途。W004/077960披露了一种通过施用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷 物在反刍动物中的消化率的方法。
[0017] 包括一种蛋白酶的并且上市用于在动物饲料中使用的商业产品包括 RONOZYME? ProAct (DSM NP/Novozymes)、AxtlB? (Danisco)、 Avi/yΠΙΟ --： (Danisco)> PoKzyme? (Danisco)> Allzyme? (Al 1 tech)、Vfersazyme? (BioResources、 Int.)、Poultrygrow? (Jefo)和C..'ihen/a...K: DP100 (Novus)。
[0018] 发明概述
[0019] 本发明涉及一种具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自由以下组成的组：
[0020] (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少82%、至少83%、至少 84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；
[0021] (b) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ IDN0:1的成 熟多肽编码序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、 至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少99%、或100%的序列一致性；
[0022] (c)在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2 的成熟多肽的变体；以及
[0023] ⑷具有蛋白酶活性的（a)、（b)或（c)的多肽的一种片段。
[0024] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；及产生这些多肽的方法。
[0025] 本发明还涉及本发明的这些蛋白酶在动物饲料和在洗涤剂中的用途，生产动物饲 料组合物和洗涤剂组合物的方法，并涉及动物饲料组合物和洗涤剂组合物。
[0026] 本发明还涉及编码一种信号肽的一种多核苷酸，该信号肽包含SEQ ID N0:2的氨 基酸1至29或由其组成；编码一种前肽的一种多核苷酸，该前肽包含SEQ ID NO:2的氨基 酸30至188或由其组成；或编码一种信号肽和一种前肽的一种多核苷酸，该信号肽和前肽 包含SEQ ID N0:2的氨基酸1至188或由其组成，这些多核苷酸的每一种与编码蛋白质的 基因可操作地连接；涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并 且涉及产生蛋白质的方法。
[0027] 附图简要说明
[0028] 图1显示来自澳大利亚糖丝菌的S1蛋白酶与10R蛋白酶相比对大豆-玉米粉的 活性。
[0029] 定义
[0030] 具有蛋白酶活性的多肽
[0031] 具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有时也被称为肽酶、蛋白水解酶、肽水解酶或 蛋白水解的酶。蛋白酶可以是始于任一端水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用 的内切型蛋白酶（内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物 与讨论的蛋白酶的特异性有关。
[0032] 本文将术语"蛋白酶"定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如此处使用 的术语"母体蛋白酶"和"蛋白酶变体"的蛋白酶部分。术语"蛋白酶"包括任何属于EC3. 4 酶组(包括其13个亚类中的每一个）的酶。该EC编号指的是Enzyme Nomenclature (酶命 名法）1992,来自NC-IUBMB，Academic Press (学术出版社)，圣地亚哥，加利福尼亚，包括增 刊 1-5,各自发表于 Eur. J. Bio-chem.(欧洲生物化学杂志）1994, 223, 1-5 ;Eur. J. Biochem. (欧洲生物化学杂志）1995, 232, 1-6 ;Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学杂志）1996, 237, 1-5 ; Eur. J. Biochem.(欧洲生物化学杂志）1997, 250, 1-6 ;以及Eur. J. Biochem.(欧洲生物化 学杂志）1999, 264, 610-650。命名会定期得以增补和更新；见例如万维网（WWW)于http:// www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index. html〇
[0033] 本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自由以下组成的组：
[0034] (a)属于EC3. 4. 21.酶组的蛋白酶；和/或
[0035] (b)肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；
[0036] 如在Biochem. (生物化学杂志）290:205-218 (1993)和在MER0PS蛋白酶数据 库，release (发表），9.4 (www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于Rawlings (罗 林斯），N.D·，Barrett (巴雷特），A.J.&Bateman (贝特曼），Α· (2010)MER0PS: the peptidase database (MER0PS:肽酶数据库），Nucleic Acids Res (核酸研究）38, D227-D233 中。
[0037] 为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和SI家族蛋白酶，可参考上述手册和 其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行此类测定，而不论其是天然或野生型蛋白酶；或 经基因工程改造或合成的蛋白酶。
[0038] S1家族的肽酶包含以His、Asp、Ser顺序的催化三联体。该催化三联体的任意氨 基酸的突变将导致酶活性的变化和损失。来自澳大利亚糖丝菌的S1蛋白酶（SEQ ID N0:2) 的催化三联体的氨基酸可能是位置Hi s-32、Asp-56和Ser-136。
[0039] 可使用任何测定法测定蛋白酶活性，其中使用底物，该底物包括与所讨论蛋白酶 的特异性相关的肽键。使测定-pH和测定-温度同样地适合所讨论蛋白酶。测定-pH值 的实例为？拟，3,4,5,6,7,8,9，10，11或12。测定-温度的实例是151：、201：、251：、301：、 35°C、37°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、80°C、90°C、或 95°C。蛋白酶底物的实 例是酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein (天青精-交联的酪蛋白）（AZCL-酪蛋白）、 或suc-AAPF-pNA，适合的蛋白酶测定的实例在实验部分中描述。
[0040] 蛋白酶活性：术语"蛋白酶活性"意指通过水解多肽链中将氨基酸连接在一起的肽 键而催化酰胺键或蛋白质水解的蛋白水解活性（EC3. 4.21.)。用于确定蛋白酶活性的几种 测定法是本领域可获得的。出于本发明的目的，可以使用Protazyme AK片（交联和染色的 酪蛋白；来自Megazyme (麦格酶公司））确定蛋白酶活性，如本申请的实例中所述。本发明 的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的蛋白酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0041] 等位变体：术语"等位变体"是指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可 变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突 变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多 肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0042] 催化结构域：术语"催化结构域"是指含有酶的催化机构的酶的区域。
[0043] cDNA :术语"cDNA"是指可以通过得自真核或原核细胞的、从成熟的、剪接的mRNA 分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 初始的初级RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0044] 清洁组合物：术语"清洁组合物擁"和"清洁配制品"是指用于从待清洁的物品去 除所不希望的的化合物的组合物，这些物品如织物、地毯、餐具(包括玻璃器具)、隐形眼镜、 硬质表面如瓦面、锌表面、地面和桌面、毛发(香波)、皮肤(肥皂和乳膏)、牙齿(漱□液、牙 膏)，等等。这些术语涵盖针对具体类型所需的清洁组合物和产品形式(例如，液体组合物、 凝胶组合物、颗粒组合物或喷雾组合物）所选择的任何材料/混合物，只要该组合物与组合 物中所用的根据本发明所述的蛋白酶和其他酶相容即可。通过考虑待清洁的表面、物品或 织物和针对使用期间的清洁条件的组合物的所需形式而容易进行清洁组合物材料的具体 选择。这些术语进一步指适于对任何物体和/或表面清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何 组合物。这些术语意在包括，但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和 精细织物洗漆剂；硬质表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属柜台顶面（counter top)和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂、织物清新剂；织物软化剂和纺织品与衣物预除斑剂 (pre-spotters)以及餐具洗漆剂)。
[0045] 编码序列：术语"编码序列"是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码 序列的边界通常由开放读码框确定，其以起始密码子例如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密 码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。 [0046] 控制序列：术语"控制序列"是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是原生的（native)(g卩，来自相同 基因）或外源的（即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这样的控制序列包 括但不局限于前导子，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。最 少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。可以为这些控制序列提供为了引入以 特定限制性位点的接头，以促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接。
[0047] 洗涤剂组合物：除非另外指明，术语"洗涤剂组合物"包括颗粒或粉末形式的通用 或重垢型清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用清洗剂，尤其是所谓的 重垢型液体（HDL)型的；液体精细织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢型餐具清洗剂，尤 其是那些高泡类型的；机洗餐具清洗剂，包括家庭和机构用途的各种片状、颗粒、液体和漂 洗助剂类型的；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿 车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清 洁助剂如漂白添加剂和"去污棒（stain-stick)"、预处理型添加剂。术语"洗涤剂组合物" 和"洗涤配制品"用来指预期在用于清洁污染物体的洗涤介质中使用的混合物。在一些 实施例中，该术语用来指洗涤织物和/或衣物(例如，"衣物洗涤剂")。在可替代的实施例 中，该术语指其他洗涤剂，如用来清洁餐具、刀叉等等的那些洗涤剂(例如，"餐具洗涤剂")。 并不意在使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。预期的是，除了根据本发明 的蛋白酶之外，该术语涵盖含有例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂（chelators)或螯合试剂 (chelating agents)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染 料、香料、晦暗抑制剂（tannish inhibitors)、光亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、悬污剂、防蚀 齐?、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂及荧光染料、抗氧化 剂以及增溶剂的洗涤剂。
[0048] 餐具洗涤组合物：术语"餐具洗涤组合物"指的是用于清洁硬质表面的所有形式的 组合物。本发明不受限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体的洗涤剂。
[0049] 酶去污力益处：术语"酶去污力益处"或"去污力"在此定义为与无酶的相同洗涤剂 相比，酶可以向洗涤剂增加的有利作用。可以由酶提供的重要去污力益处是污渍去除伴随 在洗涤和或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、阻止或减少在洗涤过程中释放的污垢再沉 积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作 用），其中这些纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。对 于酶去污力益处而言，不直接与催化性污渍去除或阻止污垢再沉积相关的纺织品护理益处 也是重要的。这类纺织品护理益处的实例是阻止或减少染料从一种织物转移至另一种织物 或相同织物的另一个部分(一种又称作染料转移抑制或抗回染的作用）、去除来自织物表面 的突出或破损纤维以降低起球趋势或除去已经存在的毛球或绒毛(一种又称作抗起球的作 用)、改善织物柔软度、织物的颜色澄清和去除在织物或服装的纤维中夹带的颗粒状污垢。 酶促漂白作用是另外的酶去污力益处，其中催化活性通常用来催化漂白组分如过氧化氢或 其他过氧化物的形成。
[0050] 表达：术语"表达"包括产生多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于：转录、转录后 修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
[0051] 表达载体：术语"表达载体"是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了 其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
[0052] 织物：术语"织物"包括任何纺织材料。因此，该术语意在包括服装，以及织物、纱 线、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料和任何其他纺织材料。
[0053] 片段：术语"片段"意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺少一个或多 个(例如，若干个）氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
[0054] 硬质表面清洁：术语"硬质表面清洁"在此定义为硬质表面的清洁，其中硬质表面 可包括地板、桌子、墙、屋顶等，连同硬质物体如汽车(洗车）和餐具(餐具洗涤）的表面。餐 具洗涤包括但不限于清洁盘子、杯子、玻璃、碗、和刀具如匙、刀、叉、上菜用具、陶器、塑料、 金属、瓷器、玻璃和丙烯酸脂类。
[0055] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0. 3%SDS、200 毫克 /ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最 终使用2X SSC、0. 2%SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0056] 宿主细胞：术语"宿主细胞"是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，或具 有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的类似者。术语"宿主细胞"涵盖由于 复制期间发生的突变与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何后代。
[0057] 改善的洗涤性能：术语"改善的洗涤性能"在此定义为一种(变体）酶(还有多种酶 的共混物，但不仅限于变体还有骨架，以及与某些清洁组合物的组合)，该酶展示了一种蛋 白酶变体与母体蛋白酶变体的洗涤性能相比的洗涤性能的改变，例如通过增加的去污。术 语"清洗性能"包括在洗衣方面的洗涤性能但也包括在餐具洗涤中的洗涤性能。
[0058] 分离的：术语"分离的"是指处于非天然出现的形式或环境中的物质。分离的物质 的非限制性实例包括（1)任何非天然出现的物质，（2)任何物质，包括但不局限于从与其在 自然中相关的一种或多种或所有天然发生的组分至少部分地除去的任何酶、变体、核酸、蛋 白质、肽或辅因子；（3)相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的任何物质；或（4)通过相 对于与其天然相关的其他组分增加其量而修饰的任何物质(例如编码该物质的基因的多个 拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存 在于发酵液样品中。
[0059] 低严谨度条件：术语"低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3%SDS、200毫克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS， 在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0060] 成熟多肽：术语"成熟多肽"是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N末端加工、C末 端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸189至374,基于使用埃德曼（Edman)降解化学的氨基酸定序。本领域已知， 宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽的混合物（即，具 有不同的C末端和/或N末端氨基酸)。
[0061] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有蛋白酶活性的成熟 多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸665至1222。
[0062] 中严谨度条件：术语"中等严格性条件"意指对于至少100个核苷酸长度的探针而 言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C在5X SSPE、0. 3%SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精 DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在 55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0063] 中-高严谨度条件：术语"中-高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3%SDS、200毫克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0064] 核酸构建体：术语"核酸构建体"是指从天然存在的基因中分离的、或被修饰成以 自然中不会另外出现的方式包含核酸区段的、或合成的单链的或双链的核酸分子，它包含 一个或多个控制序列。
[0065] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列位于相对 于一个多核苷酸的编码序列的适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达。 [0066] 序列一致性：用参数"序列一致性"来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序 列之间的亲缘关系。
[0067] 出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（他6(1161]^11-111118(311)算法（他6(1161]^11(尼 德曼）和Wunsch (翁施)，1970, J. Mol. Biol.(分子生物学杂志）48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice (赖斯）等人，2000， Trends Genet.(遗传学趋势)16:276-277)的Needle程序所实施的，优选5. 0. 0版或更新版 本。所使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5,及EBL0SUM62 (BL0SUM62的 EMBOSS版本)取代矩阵。标记为"最长一致性"的Needle (尼德尔）的输出（使用-nobrief 选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0068] (一致的残基X100) /(比对长度-比对中的空位总数）
[0069] 为了本发明的目标，使用Needleman (尼德曼）-Wunsch (翁施）算法（Needleman (尼德曼)和mmsch (翁施)，1970,同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性， 如在EMBOSS包中的Needle (尼德尔）程序中实施（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套装 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice (赖斯）等人，2000,同 上)，优选是版本5. 0.0或更新版本。使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5， 以及EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为"最长一致性"的Needle (尼德尔）的输出（使用-nobrief选项获得）被用作百分比一致性并且被计算如下：
[0070] (-致的脱氧核糖核酸X100) /(比对长度-比对中的空位总数）
[0071] 子序列：术语"子序列"是指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失的一个或 多个(例如，若干个）核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。
[0072] 基本上纯的多核苷酸：术语"基本上纯的多核苷酸"意指不含其他外部或不想要的 核苷酸并且处在适合于在基因工程化多肽生产系统中使用的形式的多核苷酸制剂。因而， 基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最 多2%、最多1%和最多0. 5%的与该多核苷酸天然或重组地关联的其他多核苷酸物质。然而， 基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地， 该多核苷酸是按重量计至少90%纯的，例如至少92%纯的，至少94%纯的，至少95%纯的，至 少96%纯的，至少97%纯的，至少98%纯的，至少99%纯的，以及至少99. 5%纯的。本发明的 多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
[0073] 基本上纯的多肽：术语"基本上纯的多肽"意指按重量计含有最多10%、最多8%、 最多6%、最多5%、最多4%、最多3%、最多2%、最多1%和最多0. 5%的与其天然或重组地关联 的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该多肽是至少 92%纯的，例如至少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、 至少99%、至少99. 5%纯的、和100%纯的。本发明的多肽优选地处于基本上纯的形式。这可 以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽来实现。
[0074] 纺织品：术语"纺织品"意指任意纺织品材料，包括纱线、纱线中间体、纤维、非织 物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他的纺织品材料、由这些材料制成的织物以及从 织物制成的产品(例如衣服和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织物、机织物、斜纹粗 棉布、非织物、毛毡、纱线和毛巾料的形式。纺织品可以基于纤维素，如天然纤维素、包括棉 花、亚麻/亚麻布、黄麻、芒麻、剑麻或椰壳纤维（coir)或包含粘胶/人造丝、芒麻、醋酸纤维 素纤维（tricel 1 )、溶解性纤维（lyocel 1)或其混合物的人造纤维素(例如，源自木浆)。该 纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和 蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维（spandex/ elastane)、或其混合物以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的混合物。混合物的实例是 棉花和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料（companion material)的混合物，伴随材 料如羊毛、合成纤维(例如、聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤 维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)、和含有纤维素的纤维(例如、人造丝/粘胶、苎 麻、亚麻/亚麻布（flax/linen)、黄麻、醋酸纤维素纤维、溶解性纤维（lyocell))。织物可以 是常规的可洗涤的衣物，例如弄污的家用衣物。当使用术语织物或衣服时旨在也包括更宽 的术语纺织品。
[0075] 纺织品护理益处：对于酶去污力益处而言，不直接与催化性污渍去除或阻止污垢 再沉积相关的"纺织品护理益处"也是重要的。这类纺织品护理益处的实例是阻止或减少 染料从一种纺织品转移至另一种纺织品或相同纺织品的另一个部分(一种又称作染料转移 抑制或抗回染的作用）、去除来自纺织品表面的突出或破损纤维以降低起球趋势或除去已 经存在的毛球或绒毛(一种又称作抗起球的作用)、改善纺织品柔软度、纺织品的颜色澄清 和去除在纺织品的纤维中夹带的颗粒状污垢。酶促漂白作用是另外的酶去污益处，其中催 化活性通常用来催化漂白组分如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂泊种类的形成。
[0076] 变体：术语"变体"意指具有蛋白酶活性的、包含改变（即在一个或多个(例如，若 干）位置处的取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意思指占据一个位置的氨基酸被一 个不同的氨基酸替代；缺失意思指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入意思指邻近于 并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如若干个）氨基酸例如1-5个 氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID N0:2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少 50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的蛋白酶活性。
[0077] 非常高严谨度条件：术语"非常高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3%SDS、200毫克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0078] 非常低等严谨度条件：术语"非常低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷 酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3%SDS、200毫克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2%SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0079] 洗涤性能：术语"洗涤性能"用于指在例如洗涤或硬表面清洁过程中从待清洁物体 上除去污迹的能力。
[0080] 白度：术语"白度"在此被定义为一个宽的术语，它在不同领域和对于不同的用户 具有不同的意思。白度损失可例如归因于变灰色、黄化、或光增亮剂/着色剂的去除。变灰 色和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染印的着色或染料转移。 白度可包括来以下清单中的一种或若干问题：着色剂或染料影响、不完全去污(例如身体污 垢、皮脂等)、再沉积(该物体的变灰色、黄化或其他褪色）（去除的污垢与弄脏的或未弄脏的 其他部分纺织品发生联系)、纺织品在应用期间的化学变化以及颜色的澄清或增亮。
[0081] 发明详细说明
[0082] 具有蛋白酶活性的多肽
[0083] 在一个实施例中，本发明涉及一种与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少82%、至少 83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一 致性的分离的多肽，该分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，该多肽与SEQ ID N0:2的 成熟多肽具有不超过 20 个(例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 或 19 个）氨基酸的差异。
[0084] 本发明的多肽优选地包含SEQ ID N0:2或其等位基因变体的氨基酸序列或由其组 成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或 由其组成。在另一个方面，该多肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸189到374或由其组成。
[0085] 在另一个实施例中，本发明涉及在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条 件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编 码的一种具有蛋白酶活性的分离多肽：SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列，或其全长补体 (Sambrook (萨姆布鲁克）等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克 隆实验指南)，第二版，Cold Spring Harbor (冷泉港)，纽约）。
[0086] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID N0:2的多肽或其片段可根据本 领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有蛋白 酶活性的多肽的DNA。具体地说，可以使用这类探针，遵循DNA印迹程序，与感兴趣细胞的 基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别并分离出其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整 个序列，但是长度应该至少为15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选 地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷 酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800 个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于 检测相应的基因(例如，用 3午、311、355、生物素、或抗生物素蛋白）。本发明涵盖此类探针。
[0087] 可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编 码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖 或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到 并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO: 1或其子序列杂交 的克隆或DNA，将该载体材料用于DNA印迹中。
[0088] 出于本发明的目的，杂交指该多核苷酸在非常低至非常高严谨度条件下与跟以下 各项相对应的一个标记的核酸探针杂交：（i) SEQ ID NO: 1 ; (ii) SEQ ID NO: 1的成熟多肽编 码序列；（iii)其全长补体；或者（iv)其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子 可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
[0089] 在一个方面，该核酸探针是SEQ ID N01的核苷酸101至1405、核苷酸188至1222、 核苷酸665至1222、或核苷酸800至1200。在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID N0:2 的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO: 1。
[0090] 在另一个实施例中，本发明涉及一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多 肽是由与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至 少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性的多核苷酸所编码。
[0091] 在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干个）位置处包含取代、缺 失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQ ID N0:2的 成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的个数不超过20,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、或19。这些氨基酸变化可以具有微小性质，S卩，不会显著地影响 蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较 小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的较小连接子 肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸序列（tract)、抗 原表位或结合结构域。
[0092] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性 氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、 异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸(甘氨酸、丙氨 酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。总体上不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知 的，并且例如由H. Neurath (诺伊拉特)和R. L. Hill (希尔），1979,描述于The Proteins (蛋 白质）中，Academic Press (学术出版社)，纽约。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/ Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0093] 可替代地，氨基酸改变本质是多肽的物理化学特性的改变。举例来说，氨基酸变化 可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。
[0094] 可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫 描诱变（Cunningham (坎宁安）和 Wells (威尔斯)，1989, Science (科学）244:1081-1085)。 在后一种技术中，将单个丙氨酸突变在分子中的每个残基处引入，并且对所产生的突变体 分子测试蛋白酶活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基酸残基。还参见Hilton(希尔顿） 等人，1996, J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，271:4699-4708。活性位点或其他生物学相互 作用也可以通过对结构进行物理学分析来进行确定，如通过以下技术例如核磁共振、结晶 学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变向结合。参见例如de Vos (德 福斯）等人，1992, Science (科学）255:306-312 ;Smith (史密斯）等人，1992, J. Mol. Biol. (分子生物学杂志）224:899-904 ;Wlodaver (沃勒达尔）等人，1992, FEBS Lett.(欧洲生物 化学学会联盟通讯)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。在本发 明的多肽中，通过与10R蛋白酶的氨基酸序列比对，形成催化三联体的必需氨基酸已被识 别为对应于SEQ ID N0:2中的His-220、Asp-244和Ser-324的氨基酸。
[0095] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和 /或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如Reidhaar-Olson (瑞达尔-奥尔逊）和 Sauer (索尔），1988, Science (科学，241:53-57 ;Bowie (鲍威)和 Sauer (索尔），1989，？1"〇。· Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院院刊），86:2152-2156 ;TO95/17413 或 TO95/22625 所披露 的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman (洛曼）等人，1991， Biochemistry (生物化学)30:10832-10837 ;美国专利号 5, 223, 409 ;TO92/06204)以及区域 定向诱变（Derbyshire (德贝夏）等人，1986，Gene (基因）46:145 ;Ner (内尔）等人，1988， DNA7:127)。
[0096] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克 隆的、诱变的多肽的活性（Ness (内斯)等人，1999, Nature Biotechnology (自然生物技术） 17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标 准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0097] 多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N末端或C 末端。
[0098] 多肽还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽 的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融 合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这 样使得它们在框内并且融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。 还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽（Cooper (库珀）等人， 1993, EMB0J.(欧洲分子生物学学会杂志）12:2575-2583 ;Dawson (道森)等人，1994, Science (科学）266:776-779)。
[0099] 融合多肽可以进一步包括两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后， 该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于以下各项中披露 的位点：Martin (马丁）等人，2003, J.Ind. Microbiol. Biotechnol.(工业微生物学与生物 技术杂志·）3:568-576 ;Svetina (斯韦蒂纳）等人，2000, J.Biotechnol.(生物技术期刊） 76:245-251 ;Rasmussen(拉斯马森)_Wilson(威尔逊)等人，1997, Appl. Environ. Microbiol. (应用与环境微生物学)63:3488-3493 ;Ward (华德）等人，1995, Biotechnology (生物技术） 13:498-503 ;以及 Contreras (孔特拉斯)等人，1991，Biotechnology (生物技术)9:378-381 ; Eaton (伊顿）等人，1986，Biochemistry (生物化学）25:505-512 ;Collins (柯林斯)-Racie (莱斯）等人，1995, Biotechnology (生物技术）13:982-987 ;Carter (卡特）等人，1989, Pro teins:Structure, Function, and Genetics (蛋白质：结构、功能和遗传学）6:240-248 ;以 及 Stevens (史蒂文斯），2003, Drug Discovery World (世界药物发现）4:35-48。 实施例
[0100] 在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸 气稳定性、pH特性如酸稳定性等。
[0101] 本发明的一个实施例是与蛋白酶10R相比具有在37°c和60°C之间，如在37°C和 50°C，或在37°C、50°C或在60°C下改善的蛋白酶活性的分离的多肽。
[0102] 酸度/碱度特件
[0103] 在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了关于pH的有益的特性，如酸稳 定性等。该蛋白酶在一个低的pH下的稳定性是有益的，因为该蛋白酶可以在穿越胃之后在 肠中具有活性。该蛋白酶在一个高的pH下的稳定性对于清洁和洗涤是有益的，因为洗涤剂 组合物常常具有一个碱性pH。在本发明的的一个实施例中，该蛋白酶在pH3下2小时之后 保持了 >90%的活性，如使用实例4中所述的方法确定的。在本发明的的另一个实施例中， 该蛋白酶在PH9下2小时之后保持了 >90%的活性，如使用实例4中所述的方法确定的。
[0104] 本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白 酶是S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了出人意料的pH特性，尤其是pH 稳定性特性，这使它们成为用于在动物饲料和/或洗涤剂中使用的感兴趣的候选物。
[0105] 洗涤件能
[0106] 在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的洗涤性能。与不含任何 蛋白酶的洗涤剂相比，来自澳大利亚糖丝菌的S1蛋白酶更有效于去除污渍。来自澳大利亚 糖丝菌的S1蛋白酶甚至在20°C也有效于去除血渍和蛋渍。
[0107] 饲料应用
[0108] 本发明的蛋白酶在一个宽的pH4-ll的范围内对Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA是有 活性的并在PH6-11的范围内尤其展现了高活性，在一个宽的生理学pH范围（从pH3-7)内 对一种饲料相关大豆粉-玉米粉底物是有活性的并在经受低至2的pH2小时之后保持了多 于80%的活性。因此本发明的来自澳大利亚糖丝菌的S1蛋白酶适合于多种饲料应用。
[0109] 具有蛋白酶活性的多肽的来源
[0110] 可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。为了本发明的目 标，结合给定来源，如在此使用，术语"获得自"应指由该来源或由其中已经插入来自该来源 的多核苷酸的株系产生多核苷酸编码的多肽。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌 到细胞外。
[0111] 该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，例如具有蛋白酶 活性的芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、海洋芽胞杆 菌属、葡萄球菌属、链球菌属、糖丝菌属或链霉菌属多肽，或革兰氏阴性菌多肽例如弯曲杆 菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟菌属、假单胞菌属、沙门菌 属、或脲原体属多肽。
[0112] 在一方面，该多肽是来自放线菌纲的一种细菌的一种蛋白酶，如来自放线菌目，或 来自假诺卡氏菌亚目，或来自假诺卡氏菌科，或来自糖丝菌属。在另一个方面，该多肽是澳 大利亚糖丝菌多肽。
[0113] 公众在许多培养物保藏中心易于可获得这些种类的菌株，如美国典型培养物保 藏中心（ATCC)、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)及美国农业研究菌种保藏中心南方地区研究中心（NRRL)。
[0114] 该多肽可以使用以上提到的探针鉴别并且从其他来源获得，包括从自然界(例如 土壤、堆肥、水等）分离的微生物或直接地从天然材料(例如土壤、堆肥、水等）获得的DNA样 品。用于直接地从天然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中众所周知的。然后， 可通过类似地对另一种微生物的基因组DNA或cDNA库，或混合的DNA样品进行筛选来获得 编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用该一个或多个探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可 以通过利用本领域的普通技术人员已知的技术对该多核苷酸进行分离或克隆(参看例如， Sambrook (萨姆布鲁克）等，1989,同上文)。
[0115] 多核苷酸
[0116] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如此处所述。
[0117] 用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或 cDNA，或其组合进行分离。从基因组DNA克隆多核苷酸可以例如通过使用熟知的聚合酶链 式反应（PCR)或表达文库的抗体筛选来实现，以检测具有共享的结构特征的克隆DNA片段。 参见例如 Innis (英尼斯）等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application (PCR: 方法和应用的指导)，Academic Press (学术出版社)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例 如连接酶链式反应（LCR)、连接激活转录（LAT)和基于多核苷酸的扩增（NASBA)。这些多核 苷酸可以克隆自糖丝菌属株系或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编 码区的等位基因变体的或物种变体。
[0118] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是 必需的。术语"基本上类似于"该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽在一些工 程化方式方面可以不同于从其天然来源分离的多肽，例如在具体活性、热稳定性、最佳pH、 等方面不同的变体。可以如下构建这些变体：在呈现为在SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序 列(例如其子序列）的多核苷酸的基础上，和/或通过引入不导致多肽的氨基酸序列变化的 核苷酸取代，但是其对应于旨在用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用，或通过引入可 以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford (福特） 等人，1991，Protein Expression and Purification (蛋白表达与纯化）2:95-107。
[0119] 核酸构建体
[0120] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制 序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合 适的宿主细胞中的表达。
[0121] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载 体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术 是本领域熟知的。
[0122] 该控制序列可以是一个启动子，S卩，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核 苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表 达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及 杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获 得。
[0123] 在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得 自以下各项的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（ amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉 酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因 (amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金 芽孢杆菌crylllA基因 （Agaisse (诶盖斯）和Lereclus (乐瑞克鲁斯)，1994，Molecular Microbiology (分子微生物学）13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子 化8〇11(埃贡)等人，1988,66116(基因)69 :301-315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因（(1&84)、和原 核β-内酰胺酶基因 （Villa (维拉）_Kamaroff (卡玛诺夫）等人，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊）75:3727-3731)，连同tac启动子（DeBoer (德波尔）等 人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊)80:21-25)。另外的启动子描述 于"Useful proteins fromrecombinant bacteria (来自重组细菌的有用蛋白），'，Gilbert (吉尔伯特)等人，1980, Scientific American (科学美国人），242:74_94 ;以及 Sambrook (萨 姆布鲁克）等人，1989,同上。串联启动子的实例披露在W099/43835中。
[0124] 在丝状真菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实 例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉 酸稳定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉 碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶-样蛋白酶（W096/00787)、镶 片镰孢菌淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(W000/56900)、镶片镰孢 菌Quinn (奎恩）（W000/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉 β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖 内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶 IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β -木 糖苷酶，连同NA2_tpi启动子(来自曲霉属中性α -淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻 译前导子已经用来自一种曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换；非限制性实例 包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自构巢 曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换）；及其突变的、截短的、和杂交的 启动子。
[0125] 在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、 酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶（ADH1、ADH2/ GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶（ΤΡΙ)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸 甘油酸激酶。罗马诺斯（Romanos)等人，1992, Yeast (酵母）8:423-488描述了酵母宿主细 胞的其他有用的启动子。
[0126] 该控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操 作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可 以用于本发明中。
[0127] 优选的用于细菌宿主细胞的终止子是由克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)碱 性蛋白酶（aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（amyL)及大肠杆菌核糖体RNA (rrnB)的基因 获得。
[0128] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀 菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0129] 酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿 酒酵母细胞色素 c (CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos (罗马诺斯）等 人，1992,同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
[0130] 该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定区，它 增加该基因的表达。
[0131] 适用的mRNA稳定区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌crylllA基因 (W094/25612)和枯草芽抱杆菌 SP82 基因 （Hue (化）等人，1995，Journal of Bacteriology (细菌学杂志）177:3465-3471)。
[0132] 该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区 域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'末端。在宿主细胞中起作用的 任何前导子都可以使用。
[0133] 丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀 粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
[0134] 酵母宿主细胞的合适的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α -因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油 醛-3-磷酸去氢酶（ADH2/GAP )。
[0135] 控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3'末端并 且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。在宿 主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。
[0136] 优选的用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列是从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合 酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样 蛋白酶的基因获得。
[0137] Guo (郭）&Sherman (谢尔曼)，1995, Mol. Cellular Biol.(分子与细胞生物学杂 志）15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列。
[0138] 控制序列还可以是编码连接至多肽的N末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的 分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5'端可以固有地包含在翻译读码 框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列 的5'端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信 号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地 替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，指导所表达的多肽进入宿主细 胞的分泌路径中的任何信号肽编码序列都可以使用。
[0139] 细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编 码序列：芽孢杆菌NCIB11837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌 β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、nprS、 nprM)、以及枯草芽抱杆菌 prsAjimonen(西蒙纳)和 Pal va(帕尔瓦)，1993, Microbio logical Reviews (微生物学评论）57:109-137描述了另外的信号肽。
[0140] 丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽 编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素 酶、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0141] 酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母α -因子和 酿酒酵母转化酶。Romanos (罗马诺斯）等人，1992,同上，描述了其他有用的信号肽编码序 列。
[0142] 控制序列还可以是编码位于多肽的N末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽 被称为前体酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原（zymogen))。多肽 原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成 一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶 (aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W095/33836)、米黑根毛霉天 冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
[0143] 在信号肽和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列是紧挨着多肽的Ν末端定 位，并且该信号肽序列是紧挨着该前肽序列的Ν末端定位。
[0144] 还可以希望添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调控多肽的表 达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括 调控化合物的存在。在原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母 中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许 基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸 还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸 将与调节序列可操作地连接。
[0145] 表达载体
[0146] 本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生一个重组表达载体，这一重组 表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这类位点处插入或取代编码 该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核 酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，该编码序列是位于该载 体中，由此使该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0147] 重组表达载体可以是可以便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的 任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿 主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0148] 该载体可以是一种自主复制载体，S卩，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复 制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包 含用于确保自我复制任何工具。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主 细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外， 可以使用单一载体或质粒、或两种或更多种载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待 引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
[0149] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一种 或多种选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗 性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0150] 细菌的选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生 素抗性(如氨比西林（ampici 11 in)、氯霉素（chloramphenicol)、卡那霉素（kanamycin)、新 霉素（neomycin)、大观霉素（spectinomycin)或四环素抗性）的标记。用于酵母宿主细胞 的适合的标记包括但不局限于ADE2、HI S3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状 真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰 基转移酶)、bar (草丁膦乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC (硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC (邻氨基苯甲酸合成酶)、 连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水 链霉菌bar基因。
[0151] 该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不 依赖该基因组而自主复制的一种或多种元件。
[0152] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或 者该载体的任何其他元件通过同源或非同源重组整合到该基因组中。可替代地，该载体可 以包含指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中一个或多个染色体中的一个或多个 精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应 包含足够数量的核酸，例如100至10, 〇〇〇个碱基对、400至10, 000个碱基对、以及800至 10, 000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可 能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些 整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载 体整合到该宿主细胞的基因组内。
[0153] 对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行 自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因 子。术语"复制起点"或"质粒复制因子"是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0154] 细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC 19、 PACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及 ρΑΜβ 1的复制起点。
[0155] 用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米（2micron)的复制起点、 ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0156] 在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI (Gems (格姆斯）等人， 1991，Gene (基因）98:61-67 ;Cullen (卡伦）等人，1987, Nucleic Acids Res.(核酸研究） 15:9163-9175 ;W000/24883)。根据W000/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和 包含该基因的质粒或载体的构建。
[0157] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多 核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选 择性试剂存在下培养细胞可以选择包含可扩增的选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞， 并且由此是该多核苷酸的另外的拷贝。
[0158] 用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通 技术人员来说是熟知的(参见，例如Sambrook (萨拉布鲁克）等人，1989,同上)。
[0159] 宿主细胞
[0160] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产 生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持 作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早先所述。术语"宿主细胞"涵盖由 于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程 度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0161] 宿主细胞可以是在重组产生本发明多肽中有用的任何细胞，例如原核生物或真核 生物。
[0162] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括， 但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆 菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠 杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原 体属。
[0163] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀 粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿 烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0164] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不局限于似马链球菌、化脓链 球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
[0165] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、阿维 链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、以及变铅青链霉菌细胞。
[0166] 可以例如通过原生质体转化(参见，例如Chang (昌）和Cohen (科恩)，1979, Mol. Gen. Genet.(现代分子生物学）168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如Young (杨） 和 Spizizen (斯皮宰曾），1961，J.Bacteriol.(细菌学杂志）81:823-829,或 Dubnau (杜卜那）和Davidoff-Abelson (大卫杜夫-艾柏尔森)，1971，J. Mol. Biol.(分子生 物学杂志）56:209-221)、电穿孔(参见，例如Shigekawa (斯格卡娃）和Dower (道尔）， 1988，Biotechniques (生物技术）6:742-751)或通过接合(参见，例如Koehler (克勒）和 Thorne (索恩)，J.Bacteriol.(细菌学杂志）169:5271-5278)实现向芽孢杆菌属细胞中引 入0嫩。通过原生质体转化(参见例如，他仙1^11(哈那汗)，1983，1^〇1.8丨〇1.(分子生物学 杂志）166:557-580)或电穿孔（参见例如，Dower (道尔）等人，1988，Nucleic Acids Res. (核酸研究）16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化/ 电穿孔(参见例如，宫（Gong)等人，2004, Folia Microbiol.(微生物学报）（Praha (布拉 格））49:399-405)、接合（参见，例如，Mazodier (马佐迪耶）等人，1989, J. Bacteriol.(细菌 学杂志）171:3583-3585)、或转导（参见，例如，Burke (博科）等人，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊）98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌属细胞中。 通过电穿孔(参见例如，Choi (崔）等人，2006，J.Microbiol.Methods (微生物学方法杂志） 64:391_397)或接合(参见例如，？;[116(10(皮内多）和31116七8(斯梅茨)，2005,4。。1』11￥；[1'011. Microbiol.(应用与环境微生物学）71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌属细胞中。 通过天然感受态(参见例如，Perry (佩里）和Kuramitsu (仓光)，1981，Infect.Immun.(感 染与免疫）32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，0 &?(卡特）和允11。1^(朱力克)， 1991，Microbios (微生物)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley (巴克利）等人，1999， Appl. Environ. Microbiol.(应用与环境微生物学）65:3800-3804)或者接合(参见，例如， Clewell (克拉维尔），1981，Microbiol. Rev.(微生物学评论）45:409-436)可以实现将DNA 引入到链球菌属细胞中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞 中。
[0167] 该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0168] 该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌门（Ascomycota)、 担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门（Chytridiomycota)和接合菌门（Zygomycota)以及卵 菌门（Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思（Hawksworth)等人定义，引自： Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第 8 版，1995,国际 CAB，大学出版社 (University Press)，剑桥（Cambridge)，英国）。
[0169] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，"酵母"包括产子囊孢子酵母（内 孢霉目）、产担子酵母，以及属于半知菌（芽生菌）的酵母。由于酵母的分类未来可能改 变，故出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast (酵母生物学与 活性）（Skinner (斯金纳），Passmore (帕斯莫）及Davenport (达文波特）编辑，Soc.App. Bacteriol. Symposium (应用细菌学学会)，第9辑，1980)中所描述进行定义。
[0170] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、酵 母菌属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属细胞，例如产乳糖酶酵母、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母（Saccharomyces douglasii)、克鲁 费酵母（Saccharomyces kluyveri )、诺地酶母（Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或 亚罗解脂酵母（Yarrowia lipolytica)细胞。
[0171] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括所有丝状形式的细分真菌门 和卵菌门（如由Hawksworth (霍克斯沃思）等人，1995,同上所定义)。丝状真菌的特征一般 在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖构成的菌丝体壁。营 养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒 酵母）的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。
[0172] 丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属 (Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球酵母属、Filibasidium、镰刀菌 属、腐质霉属、大毁壳属、毛霉菌属、蚀丝霉属、新美鞭菌属（Neocallimastix)、脉孢菌属、拟 青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子 囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
[0173] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟錯菌、卡内基拟錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 浅黄拟錯孔菌、潘诺希塔拟錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟錯菌 (Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟 錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、虫拟錯 菌、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠状金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、 女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖 鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异 孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢 镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛 霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳 霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0174] 可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁 再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于 EP238023，Yelton(约尔顿）等人，1984，Proc·Natl·Acad·Sci·USA(美国国家科学院院刊） 81:1470-1474，以及 Christensen (克里斯滕森)等人，1988, Bio/Technology (生物 / 技术） 6:1419-1422 中。Malardier (马拉迪耶）等人，1989, Gene (基因）78:147-156 和 W096/00787 描述了用于转化镰刀菌属物种的合适方法。可以使用Becker (贝克尔)和Guarente (瓜伦 特）在 Abelson，J.N.(阿贝尔森）和 Simon，M.I.(西蒙）编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(对酵母遗传学和分子生物学的指导），Methods in Enzymology(酶 学方法)，194卷，ppl82-187，Academic Press，Inc.(学院出版社有限公司），纽约；Ito (伊 藤)等人，1983, J. Bacteriol.(细菌学杂志）153:163 ;以及 Hinnen (希南)等人，1978，？1"〇(：· Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊）75:1920中描述的程序来转化酵母。
[0175] 生产方法
[0176] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条件下 培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且（b)回收该多肽。在一个优选的方面， 该细胞是一种糖丝菌细胞。在一个更优选的方面，该细胞是一种澳大利亚糖丝菌细胞。
[0177] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条件下 培养本发明的重组宿主细胞；并且（b)回收该多肽。
[0178] 这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养 基中培养的。举例来说，可以通过摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中于适合培养基中 并且在允许该多肽表达和/或分离的条件下进行的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、 进料分批或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养 培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得， 或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中）来制备。如果多肽分泌到 培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进 行回收。
[0179] 可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包 括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。举例来说，可以使用一种 酶测定来确定该多肽的活性。
[0180] 可以使用本领域已知的方法来回收多肽。举例来说，该多肽可以通过常规程序，包 括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
[0181] 可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程 序包括但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以 及大小排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、 SDS-PAGE、或者提取(参见，例如 Protein Purification (蛋白纯化)，Janson (詹森)和 Ryden (赖登）编辑，VCH Publisher (VCH 出版社)，纽约，1989)。
[0182] 在一个替代性方面，该多肽未被回收，而是使用表达该多肽的本发明宿主细胞作 为该多肽来源。
[0183] 植物
[0184] 本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物 包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生多肽或结构域。该多肽或结构 域可从植物或植物部分回收。可替代地，可以像这样使用含有该多肽或结构域的植物或植 物部分，以改善食品或饲料的质量，例如改善营养价值，适口性和流变特性，或破坏抗营养 因子。
[0185] 转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物）或单子叶的（单子叶植物)。单子叶 植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属）；饲草例如羊茅属（Festuca)、黑麦草属 (Lolium);温带草例如剪股颖属（Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、 和玉蜀黍(玉米)。
[0186] 双子叶植物的实例是烟草，豆类，例如羽扇豆，马铃薯，甜菜，豌豆，菜豆和大豆， 以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物拟南芥。
[0187] 植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎连同包含这些部分 的单个组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶 绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物 细胞，无论组织来源，也被认为是植物部分。同样，植物部分，例如分离以促进本发明的利用 的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
[0188] 还包括在本发明的范围内的是这类植物、植物部分、和植物细胞的后代。
[0189] 可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简 而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶 绿体基因组中并且将所得修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因植物或植物细胞来构建植 物或植物细胞。
[0190] 表达构建体方便的是核酸构建体，它包含编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。此 夕卜，该表达构建体可以包含一种适用于对已经整合入该表达构建体的植物细胞进行鉴别的 可选择标记，及将该构建体引入所讨论的植物中必需的DNA序列(后者取决于打算使用的 DNA引入方法)。
[0191] 调节序列（如启动子和终止子序列及可任选地信号或转运序列）的选择是例如基 于何时、在何处并且如何表达所希望的多肽或结构域来决定。例如编码多肽或结构域的 基因的表达可以是组成型的或可诱导的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基 因产物可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。例如，由Tague (塔格）等人， 1988, Plant Physiology (植物生理学）86:506描述的调节序列。
[0192] 对于组成型表达，可以使用35S_CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌动蛋白1启动子 (Franck (弗兰克）等人，1980, Cell (细胞）21:285-294 ;Christensen (克里斯滕森）等人， 1992，Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）18:675-689 ;Zhang (张)等人，1991，Plant Cell (植物细胞）3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库 组织(例如种子、马铃薯块莖、和果实）（Edwards (爱德华兹)和Coruzzi (科鲁兹)，1990, Ann. Rev. Genet.(遗传学年鉴）24:275-303)，或来自代谢库组织(例如分生组织）（Ito (伊藤） 等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）24:863-878)，种子特异性启动子，例如来 自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白启动子（mi (吴）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学)39:885-889),来自豆球蛋白Μ的蚕豆启动子和来自蚕豆的 未知的种子蛋白基因 （Conrad (康拉德）等人，1998, J. Plant Physiol.(植物生理学杂志） 152:708-711 )，来自种子油体蛋白的启动子（Chen (陈)等人，1998, Plant CellPhysiol.(植 物与细胞生理学）39:935-941)，来自欧洲油菜的贮藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任 何其他种子特异性启动子，例如，如在W091 /14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性 启动子，例如来自水稻或番爺的rbcs启动子（Kyozuka (京冢）等人，1993, Plant Physiol. (植物生理学)），102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子（Mitra (密特 拉）和Higgins (希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）26:85-93)，来自水 稻的31(^基因启动子（1(&8&73(加贺）等人，1995,〇1.6611.661^^.(分子和普通遗传学） 248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子（Xu (徐)等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干 旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质，例如乙醇，雌激素，植物激素例 如乙烯、脱落酸、和赤霉酸、以及重金属来诱导。
[0193] 还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如， 启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含 子。例如Xu (徐)等人，1993,同上，披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强 表达。
[0194] 该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那 些。
[0195] 可以根据本领域已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技 术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电 穿孔（Gasser (加塞尔）等人，1990, Science (科学）244:1293 ;Potrykus (波特里库斯)， 1"0，13;[0/16(3111101087(生物/技术）8:535;311；[1]^1]1〇1:〇(岛本）等人，1 989，似1：1^6(自然） 338:274)。
[0196] 根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(有关评述， 参看 Hooykas (霍伊卡）和 Schilperoort (斯查拍特），l"2，Plant Mol.Biol.(植物 分子生物学）19:15-38)和用于转化单子叶植物的方法，尽管其他转化方法也可以用于 这些植物。用于产生转基因单子叶植物的一个方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子 轰击(用转化DNA包被的微观金或钨颗粒）（Christou (克里斯托)，1992，Plant J.(植 物杂志）2:275-281; Shimamoto (岛本)，1994, Curr. Opin. Biotechnol.(生物技术新见） 5:158-162; Vasil (瓦西尔）等人，1992, Bio/Technology (生物 / 技术）10:667-674)。如 Omirulleh(奥米如列）等人，1993, Plant Molecular Biology(植物分子生物学)21:415-428 中所述，单子叶植物转化的替代方法基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号 6, 395, 966和7, 151，204 (两者都通过引用以其全文结合于此）中所描述的那些。
[0197] 在转化之后，根据本领域中众所周知的方法对并入了该表达构建体的转化体进 行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的 T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间 或在后代中选择性清除选择基因。
[0198] 除了用本发明的构建体直接转化具体的植物基因型之外，可以通过将具有构建体 的植物与缺乏构建体的第二植物杂交来制成转基因植物。例如，可以通过杂交，而不需要直 接转化给定品种的植物，将编码多肽或结构域的构建体引入到具体的那一植物品种中。因 此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此 类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉 授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7, 151，204中。
[0199] 可以通过回交转换过程产生植物。例如，植物包括被称为回交转换的基因型、系、 近交、或杂交的植物。
[0200] 遗传标记可以用于协助将本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另 一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，其中它可以用于避免由 表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以提供关于具体杂交的个体后代中的精英种质的 相对程度的数据。例如，当具有希望的性状(否则会具有非农艺学上希望的遗传背景）的植 物与精英亲本杂交时，遗传标记可以用于选择不仅拥有感兴趣的性状、而且还具有较大比 例的希望的种质的后代。以此方式，将一个或多个性状渗入具体的遗传背景所需的世代数 被最小化。
[0201] 本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括（a)在有益于产 生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含了 编码该多肽或结构域的多核苷酸；并且（b)回收该多肽或结构域。
[0202] 信号肽和前肽
[0203] 本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID N0:2的 氨基酸1到29或由其组成。本发明还涉及一种编码前肽的分离的多核苷酸，该前肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸30到188或由其组成。本发明还涉及一种编码信号肽和前肽的分离的多 核苷酸，该信号肽和前肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1到188或由其组成。这些多核苷酸可 以进一步包含编码蛋白质的基因，该蛋白质与信号肽和/或前肽可操作地连接。该蛋白质 优选地对于该信号肽和/或前肽来说是外来的。在一个方面，编码该信号肽的多核苷酸是 SEQ ID NO: 1的核苷酸101到187。在另一个方面，编码该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO: 1 的核苷酸188到664。在另一个方面，编码该信号肽和该前肽的多核苷酸是SEQ ID NO: 1的 核苷酸101到664。
[0204] 本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
[0205] 洗涤剂组合物
[0206] 在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包含与一种或多 种另外的清洁组合物组分组合的本发明的酶。因而，在一个实施例中，本发明涉及一种包括 一种分离的多肽的洗涤剂组合物，该分离的多肽与SEQ IDN0:2的成熟多肽具有至少60%、 至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至 少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至 少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至 少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性，其具有蛋白酶活性。
[0207] 另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示 例性、非限制性组分。对于织物护理，组分的选择以包括考虑待清洁的织物的类型、脏污类 型和/或程度、在进行清洁时的温度、和洗涤剂产物的配方。尽管根据一种具体的功能性对 以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人 员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。
[0208] 本发明的酶
[0209] 在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗 涤剂组合物中：每升的洗涤液体〇. 001_200mg的蛋白，例如0. 005-100mg的蛋白，优选是 0. 01-50mg的蛋白，更优选是0. 05-20mg的蛋白，甚至更优选是0. l-10mg的蛋白。
[0210] 可以使用常规稳定剂稳定本发明的清洁剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳 定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族 硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如W092/19709和 W092/19708中所述配置该组合物，或根据本发明的变体可使用如在W02005/105826和 W02009/118375中所述的肽醛类或酮类来稳定。
[0211] 本发明的多肽还可以结合到W097/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用 将其结合在此。
[0212] 表面活性剂
[0213] 洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离 子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例 中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的 混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0. 1%至60%的水平存在，例如约1% 至约40%、或约3%至约20%、或约3%至约10%。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表 面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性 齐U。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
[0214] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%，例如从约5%至 约30%(包括从约5%至约15%)、或从约20%至约25%的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性 剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐（LAS)，LAS的异构体， 支链烷基苯磺酸盐（BABS)，苯基链烷磺酸盐，α -烯烃磺酸盐(A0S)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺 酸盐，链烷-2, 3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐（AS)(例如 十二烷基硫酸钠（SDS))，脂肪醇硫酸盐（FAS)，伯醇硫酸盐（PAS)，醇醚硫酸盐（AES或AE0S 或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐（SAS)，石蜡烃磺酸盐 (PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α -磺酸基脂肪酸甲酯（a -SFMe或SES)(包括甲酯 磺酸盐（MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸（DTSA)，氨基酸的脂 肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸的二酯和单酯或皂，及其组合。
[0215] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的阳离子表面活 性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺（ADMEAQ)、溴化十六烷 基三甲基铵（CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵（DSDMAC)、烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化 合物、烷氧基化的季铵（AQA )、及其组合。
[0216] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0. 2%至约40%的非离子型 表面活性剂，例如从约0. 5%至约30%，特别是从约1%至约20%、从约3%至约10%，例如从 约3%至约5%、或从约8%至约12%。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基 化物（AE或ΑΕ0)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇（PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例 如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烧基醋)，烧基酌乙氧基化物（APE)，壬基酌·乙氧基 化物（NPE)，烷基多糖苷（APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺（FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺 (FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺（EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺（PFAM)，多 羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺，GA，或脂肪酸葡糖酰 胺，FAGA)，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
[0217] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的半极性表面活 性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺（A0)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰 油基烷基）-N，N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基）-N，N-双（2-羟乙基）胺氧化物、脂肪 酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。
[0218] 当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1%至约40%的兼性离子表面 活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、和磺基甜菜 碱，及其组合。
[0219] 助水溶剂
[0220] 助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非 极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性 剂已知的所谓两亲特性)，然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如 Hodgdon(霍奇登)和 Kaler(卡勒）的综述（2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science (胶体&界面科学新见)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓 度就会发生如对表面活性剂以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相而言所发 现的自聚集。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集的大小随着浓度增加 而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面 活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品 至技术应用跨行业地使用助水溶剂。洗涤剂组合物中助水溶剂的使用允许例如更浓的表面 活性剂配制品（如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中）而不引起不希望的现象，例如 相分离或高黏度。
[0221] 洗涤剂可以包含按重量计0-5%，例如约0. 5%至约5%、或约3%至约5%的助水溶剂。 可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例 包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠（STS)、二甲苯磺酸钠（SXS)、枯烯磺酸钠（SCS)、伞花烃磺酸 钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
[0222] 助洗剂和共助洗剂
[0223] 洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65%，例如约5%至约50%的洗涤剂助洗剂 或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40%_65%，特别是 50%-65%。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成与Ca和Mg的水溶性复合物的螯合试剂。 可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂 的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠 （STP或STPP)、碳 酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自Hoechst (赫斯特公司） 的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇（MEA)、二乙醇胺（DEA，也称为亚胺基二乙醇）和三 乙醇胺（TEA，也称为2, 2'，2"-次氮基三乙醇、以及羧甲基菊粉（CMI)、及其组合。
[0224] 洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65%，例如约5%至约40%的洗涤剂共助洗 齐U、或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或与一种助洗剂组合，例如沸石助 洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚（丙烯酸） (PAA)或共聚（丙烯酸/马来酸）（PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合 齐U，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。另外的具体实 例包括2, 2'，2"-次氮基三乙酸（NTA)、亚乙基二胺四乙酸（EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA)、亚氨二琥珀酸（IDS)、乙二胺-Ν，Ν' -二琥珀酸（EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸（MGDA)、 谷氨酸-N，N-二乙酸（GLDA)、亚乙基二胺四（亚甲基膦酸KHEDP)、亚乙基二胺四（亚甲基 膦酸）（EDTMPA)、二亚乙基三胺五（亚甲基-膦酸）（DTPMPA)、N-(2-羟乙基）亚氨基二 乙酸（EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸（ASMA)、天冬氨酸-N，N-二乙酸（ASDA)、天冬氨酸-N-单 丙酸（ASMP)、亚氨二琥珀酸（IDA)、N-(2-磺甲基）天冬氨酸（SMAS)、N-(2-磺乙基）天冬 氨酸（SEAS)、N-(2-磺甲基）谷氨酸（SMGL)、N-(2-磺乙基）谷氨酸（SEGL)、N-甲基亚氨 基二乙酸（MIDA)，α -丙氨酸-N，N-二乙酸（a -ALDA)、丝氨酸-N，N-二乙酸（SEDA)、异 丝氨酸-N，N-二乙酸（ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸（PHDA)、邻氨基苯甲酸-N，N-二乙 酸（ANDA)、对氨基苯磺酸-N，N-二乙酸（SLDA)、氨基乙磺酸-N，N-二乙酸（TUDA)和磺甲 基-N，N-二乙酸（SMDA)、N-(2-羟乙基）-亚乙基二胺-N，N'，N' -三乙酸盐（HEDTA)、二乙 醇甘氨酸（DEG)、二亚乙基三胺五（亚甲基膦酸）（DTPMP)、氨基三（亚甲基膦酸）（ATMP)、 及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂在例如W009/102854、US5977053中描 述。
[0225] 漂白系统
[0226] 洗涤剂可以含有按重量计0-10%，如大约1%至大约5%的漂白系统。可以利用本 领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催 化剂，光漂白剂（photobleach)，漂白活化剂，过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)，预成 型的过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过 白陡酸（perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾（Oxone(R))，及其混合 物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如无机盐， 包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单-或四-水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、 过硅酸盐的钠盐，与形成漂白活化剂的过酸组合。术语漂白活化剂在此指一种与过氧化物 漂白剂(像过氧化氢）反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。 有待于在此使用的合适的漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些，合适的 实例是四乙酰乙二胺（TAED)、4-[ (3, 5, 5-三甲基己酰基）氧基]苯磺酸钠（IS0N0BS)、双过 氧化十二酸、4-(十二酰基氧基）苯磺酸盐（L0BS)、4-(癸酰基氧基）苯磺酸盐、4-(癸酰基 氧基）苯甲酸盐（D0BS)、4-(壬酰氧基）苯磺酸盐（N0BS)，和/或W098/17767中披露的那 些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中，并且在那个家族中特别优选的是 乙酰柠檬酸三乙酯（ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像Triacin (特雷森))具有以下优点，它 是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在 存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗 衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、亚胺、或砜型 的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(邻苯二甲酰亚胺基）过氧己酸（PAP)。漂白 系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该 组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
[0227]
【权利要求】
1. 一种具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自由以下各项组成的组： (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少82%、至少83%、至少84%、 至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至 少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列 一致性； (b) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ IDNO:l的成熟多 肽编码序列具有至少82 %、至少83 %、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性； (c) 在一个或多个（例如几个）位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQID NO: 2的成 熟多肽的变体；以及 (d) 具有蛋白酶活性的（a)、（b)或（c)的多肽的一种片段。
2. 如权利要求1所述的多肽，包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:2的成熟多肽或由其组 成。
3. 如权利要求2所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸189至374。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变 体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入。
5. -种组合物，该组合物包含权利要求1-4中任一项所述的多肽。
6. 如权利要求5所述的组合物，该组合物是一种洗涤剂组合物，如用于衣物或自动餐 具洗涤的组合物。
7. 如权利要求6所述的组合物，进一步包含一种或多种选自以下的另外的酶：蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原 胶酶、过氧化物酶、齒代过氧合酶（haloperoxygenase)、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或任何其 混合物。
8. 如权利要求6或7所述的组合物，该组合物包含选自表面活性剂、助洗剂等的一种或 多种组分。
9. 一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-4中任一项所述的多肽。
10. -种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求9所述的 多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控 制序列。
11. 一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求9所述的多核苷酸，该多核苷 酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
12. -种产生如权利要求1-4中任一项所述的多肽的方法，该方法包括： (a) 培养一种细胞，该细胞以其野生型形式在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽； 并且 (b) 回收该多肽。
13. -种产生具有蛋白酶活性的多肽的方法，该方法包括： (a) 在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求11所述的宿主细胞；并且 (b) 回收该多肽。
14. 一种用于提高一种动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加至少一种如 权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶。
15. -种动物饲料添加剂，包含 a. 至少一种如权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶；以及 b. 至少一种脂溶性维生素，和/或 c. 至少一种水溶性维生素，和/或 d. 至少一种痕量矿物质。
16. 如权利要求15所述的动物饲料添加剂，进一步包含淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖 酶、半乳聚糖酶、α -半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、和/或β -葡聚糖酶。
17. -种动物饲料，具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种如权利要求1-4中 任一项所述的蛋白酶。
18. -种用于处理蛋白质的方法，包括以下步骤：将至少一种如权利要求1-4中任一项 所述的蛋白酶添加至至少一种蛋白质或蛋白质来源。
19. 如权利要求18所述的方法，其中大豆被包括在该至少一种蛋白质来源中。
20. 至少一种如权利要求1-4中任一项所述的蛋白酶在洗涤剂中的用途。
21. -种动物饲料组合物，包含权利要求1-4中任一项所述的多肽。
22. 如权利要求11所述的动物饲料组合物，进一步包含一种或多种淀粉酶、肌醇六磷 酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β-葡聚糖酶、或其任何混 合物。
【文档编号】A23K1/165GK104204200SQ201280045806
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2012年9月21日 优先权日:2011年9月22日
【发明者】J.W.塔姆斯, T.霍夫, M.格杰曼森, P.R.奥斯特加德, R.P.奥林斯基, K.庞托皮丹, C.斯乔霍尔姆 申请人:诺维信公司