人源化小鼠的制作方法

人源化小鼠的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种在GSK3抑制剂及MEK抑制剂的存在下对Rag2基因及Jak3基因均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎进行培养而得到的胚胎干细胞及使用所述胚胎干细胞制作的转基因小鼠。
NITE BP-1297
20120323
【专利说明】人源化小鼠

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对从免疫缺陷小鼠采集的胚胎干细胞（ES细胞）及肝脏进行人源 化而得到的小鼠。

【背景技术】
[0002] 肝脏为在代谢、排出、解毒、体液的恒常性的维持等方面担负体内的中心作用的脏 器。已知肝脏为生物体内唯一进行再生的脏器，具有即使切除总重量的约80%也再生至原 本的重量的能力。
[0003] 由于肝脏的功能涉及多方面，因此，在肝脏中表达多个基因，但相应地，在肝脏中 存在多个因表达的基因异常导致的遗传病。
[0004] 因肝疾病等导致肝功能产生异常时，也存在除肝脏移植以外没有有效的治疗方法 的情况。因此，在发病初期的阶段预测人血中代谢产物的必要性升高。为了适当地预测血 中代谢产物及肝功能，需要开发将肝脏人源化的动物。
[0005] 目前，关于人肝脏的模型小鼠的制作，例如Heckel等报告有向白蛋白（Alb)启 动子导入有构建体（Alb-Plau)的转基因小鼠（Tg(Alb-Plau)(非专利文献I =Heckel et al. Cell 62:447-456, 1990))，所述构建体（Alb-Plau)连结尿激酶（urokinase)型的胞浆 素原活化体（Plau)基因而成，然而，该小鼠从出生后到第四天为止因肠管等的出血而死 亡，因此，无法用于实验。与此相对，报告有在Tg(Alb-Plau)中，成功建立了残存个体的系 统，且肝细胞在分化中通过缺损了 Alb-Plau基因的肝细胞使肝脏再生的例子（非专利文 献2:Sandgren et al.Cell66:245-256，1991)。另外，有向金属硫蛋白启动子导入有连结 了 IacZ基因的构建体而成的小鼠、即以作为标记基因的IacZ标记了作为供体的肝细胞的 转基因小鼠（Tg(MT-nLacZ)小鼠）的成体肝细胞移植于Tg(Alb-Plau)并获得成功的例子 (非专利文献 3 :Rhim et al. Science 263:1149_1152，1"4)。
[0006] 进而，有对免疫缺陷小鼠进行人肝细胞移植的例子。例如有对Rag2-/_基因缺损 免疫缺陷小鼠移植肝细胞而进行B型肝炎病毒（HBV)的感染实验的例子（非专利文献4: Dandri et al. H印atology 33:981-988,2001)，或者使Tg(Alb-Plau)和作为免疫缺陷小鼠 的SCID交配，对成为免疫缺陷的SCID小鼠（Tg(Alb-Plau))移植人肝细胞（Tg(Alb-Plau); SCID))而进行C型肝炎病毒的感染实验的例子（非专利文献5 :Mercer et al. Nature Med. 7:927-933, 2001)等。
[0007] 进而，Tateno等使肝脏具有损伤的白蛋白增强子/启动子尿激酶胞浆素原活化体 转基因小鼠（uPA小鼠）和SCID小鼠交配，制作两者的性状均为同型接合体的uPA/SCID转 基因小鼠（非专利文献 6 :Tateno et al. Amer. J. Pathol 165:901-912,2004)。在该报告 中，对人肝细胞向Tg(Alb-Plau ;SCID)的移植法的改良进行了记载，通过Futhan处理排除 源自人肝细胞的补体的影响，即使为高嵌合体也使死亡率降低。
[0008] 进而，也报告有证实了对以缺损了 Rag2基因的免疫缺陷小鼠作为模型的基因 治疗的可能性的研究（非专利文献7 :整形、灾害外科"从分子水平看的整形外科疾病系 列IV体细胞克隆技术和再生医疗" Vol. 45, NO. 11，PAGE. 1040-1041，2002(整形·災害外 科「分子6 ?亡整形外科疾患者；U -文' IV体細胞々口一 >技術i再生医療」 Vol. 45, NO. 11，PAGE. 1040-1041，2002))。
[0009] 但是，在这些模型小鼠中，作为宿主的小鼠的肝脏细胞残留，并不是100%的细胞 被源自人的细胞置换的肝细胞模型。另外，源自人的细胞未必再生，不得不移植源自人的细 胞。进而，若源自小鼠的肝脏细胞残存，则人的肝功能的验证变得不充分。
[0010] 另一方面，为了建立向生殖系列传递的源自NOG小鼠的ES细胞株，也尝试有通过 使用分化信号抑制剂（PD0325901、CHIR99021)来建立ES细胞（非专利文献8 :日本实验 动物学会总会讲演要点集Vol. 58th，Page 210, 20116(日本実験動物学会総会講演要旨集 Vol.58th,Page 210,20116))〇
[0011] 然而，从NOG小鼠难以繁殖的方面考虑，难以得到用于实验的多个小鼠。
[0012] 现有技术文献
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 I :Heckel et al. Cell 62:447-456, 1990
[0015] 非专利文献 2 :Sandgren et al. Cell 66:245-256, 1991
[0016] 非专利文献 3 :Rhim et al. Science 263:1149-1152, 1994
[0017] 非专利文献 4 :Dandri et al. Hepatology 33:981-988, 2001
[0018] 非专利文献 5 :Mercer et al. Nature Med. 7:927-933, 2001
[0019] 非专利文献 6 :Tateno et al. Amer. J. Pathol 165:901-912, 2004
[0020] 非专利文献7 :整形?灾害外科"从分子水平看的整形外科疾病系列IV体细 胞克隆技术和再生医疗"Vol. 45, NO. 11，PAGE. 1040-1041，2002(整形?災害外科「分 子6 ?亡整形外科疾患者；U -文' IV体細胞々口一 >技術i再生医療」 Vol. 45, NO. 11，PAGE. 1040-1041，2002)
[0021] 非专利文献8 :日本实验动物学会总会讲演要点集Vol. 58th，Page210, 2011(日本 実験動物学会総会講演要旨集Vol. 58th，Page 210, 20116)


【发明内容】

[0022] 发明要解决的问题
[0023] 本发明的目的在于提供一种对从免疫缺陷小鼠采集的胚胎干细胞（ES细胞）及肝 脏进行人源化而得到的小鼠。
[0024] 解决问题的方法
[0025] 本发明人为了解决上述课题，进行了潜心研究，结果发现，由Rag2基因及Jak3基 因均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎中可得到能够制作最适于人肝细胞移植的小鼠的胚胎干 细胞，完成了本发明。
[0026] SP，本发明如下所述。
[0027] (1) -种胚胎干细胞，其在GSK3抑制剂及MEK抑制剂的存在下对Rag2基因及Jak3 基因均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎进行培养而得到。
[0028] (2)如⑴所述的胚胎干细胞，其中，保藏编号由NITE BP-1297表示。
[0029] (3)如⑴或⑵所述的胚胎干细胞，其导入有雌激素受体基因及白喉毒素基因。
[0030] (4)如⑶所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的生长激素基因被源自人的生 长激素基因置换。
[0031] (5)如（4)所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的药物代谢酶基因进一步被源 自人的药物代谢酶基因置换。
[0032] (6)如（5)所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的药物代谢酶基因为选自由 Cyp3all、Cyp3al3、Cyp3a25 及 Cyp3a41 构成的组中的至少一种。
[0033] (7) -种小鼠，其使用上述（1)或⑵所述的胚胎干细胞制作。
[0034] (8) -种转基因小鼠，其使用上述（3)?（6)中任一项所述的胚胎干细胞制作。
[0035] (9)如⑶所述的小鼠，其通过抗雌激素剂的给药引起肝细胞损伤。
[0036] (10) -种肝脏人源化的小鼠，其特征在于，向上述（7)所述的小鼠移植源自人的 肝细胞，并且给药抗雌激素剂而除去源自该小鼠的肝细胞。
[0037] (11)如（9)所述的小鼠，其中，源自人的肝细胞源自具有肝脏疾病的患者。
[0038] (12) -种人肝脏疾病模型小鼠，其由上述（10)所述的小鼠构成。
[0039] (13) -种源自免疫缺陷小鼠的胚胎干细胞的制造方法，其特征在于，在GSK3抑制 剂及MEK抑制剂的存在下对Rag2基因及Jak3基因均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎进行培 养。
[0040] (14) 一种肝损伤模型小鼠的制作方法，其特征在于，对上述（8)所述的小鼠给药 抗雌激素剂。
[0041] (15) -种肝脏人源化的小鼠的制作方法，其特征在于，向⑶所述的小鼠移植源 自人的肝细胞，并且给药抗雌激素剂而除去源自小鼠的肝细胞。
[0042] (16)如（15)所述的方法，其中，源自人的肝细胞源自具有肝脏疾病的患者。
[0043] 发明效果
[0044] 根据本发明，可提供一种用于确立最适于人肝细胞移植的小鼠的胚胎干细胞。本 发明的胚胎干细胞可以导入与肝功能有关的各种人类基因，可以建立人源化肝脏模型小 鼠。因此，由本发明的胚胎干细胞建立的小鼠可以用于人肝细胞移植，在能够100%的人源 化方面非常有用。

【专利附图】

【附图说明】
[0045] 图1是表示变异型Iox的图；
[0046] 图2是表示Dre/rox系统的图；
[0047] 图3是用于将人生长激素基因导入ES细胞中的置换载体的构建图；
[0048] 图4是用于将人药物代谢酶基因导入ES细胞中的置换载体的构建图；
[0049] 图5是说明从白喉毒素基因向ES细胞导入到小鼠肝细胞死亡的过程的图；
[0050] 图6是表示将人肝细胞移植于小鼠胚胎的部位的图；
[0051] 图7是表示移植了人肝细胞的小鼠的胚胎的图；
[0052] Sl :表示麻醉药的腹腔内给药的图，S2 :切开腹部并使胎儿向腹腔外露出的图；
[0053] A :要注入细胞的卵黄囊静脉，B :细胞注入部位（黄色的箭头），C :注入蓝色的色 素之后的肝脏（可以看到蓝色）、D :摘除的肝脏（左边为蓝色色素注入后的肝脏，右边为未 注入色素的肝脏）
[0054] 图8是表示由iPS细胞分化诱导的肝细胞的图；
[0055] 图9是表示由iPS细胞分化诱导的肝细胞的图。

【具体实施方式】
[0056] 以下，对本发明详细地进行说明。
[0057] 1.概要
[0058] 本发明为由Rag2基因及Jak3基因均缺损的免疫缺陷小鼠建立的胚胎干细胞，由 该胚胎干细胞确立肝脏人源化的小鼠。
[0059] 在本发明中，通过在GSK3抑制剂及MEK抑制剂的存在下对从免疫缺陷小鼠中采集 的胚胎进行培养，成功建立了 ES细胞。
[0060] 缺损了 Rag2 及 Jak3 的 BALB/c 小鼠（BALB/c ;Rag2-/- ; Jak3-/-:称为"BRJ 小鼠"） 缺损T细胞、B细胞、NK细胞及NKT细胞，为具有BALB/c的遗传背景的免疫缺陷小鼠。对该 小鼠移植人的细胞时，该细胞在小鼠体内生存，因此，所制作的小鼠称为以细胞水平进行了 人源化的小鼠。
[0061] 但是，这样的人源化小鼠由于残存源自作为宿主的小鼠的细胞，因此，并不是全部 脏器置换为源自人的细胞，在进行该脏器的功能分析或研究方面未必为进行了最优化的小 鼠。另外，为了制作最优化小鼠，需要进行各种基因修饰，但无法使用小鼠个体来进行。
[0062] 因此，在本发明中，为了建立具有100%的细胞人源化的肝脏的小鼠，建立最适于 人源化的基因修饰小鼠。该基因修饰小鼠从个体产生的初期以人源化为目标进行了潜心研 究，结果，成功由BRJ小鼠建立了胚胎干细胞（以下称为"ES细胞"）。使用该ES细胞制作 嵌合体小鼠，也成功制作了传递至生殖系列的生殖嵌合体小鼠。接着，为了长期维持肝脏功 能、并且确认安全性，建立具有人正常肝脏的小鼠。进而，为了建立与具有肝脏疾病的人类 患者相同的症状的疾病模型，并且分析病态，建立具有人变异肝脏的小鼠。进而，为了开发 通用性高的新型治疗法，建立对人类疾病最优化的模型小鼠。
[0063] 2. BRJ小鼠的制作
[0064] 所使用的免疫缺陷小鼠为Rag2基因及Jak3基因均被敲除的小鼠，为已确立 的小 鼠(〇no A, Hattori S, Kariya R, Iwanaga S, Taura M, Harada H, Suzu S, Okada S.Comparative study of human hematopoietic cell engraftment into BALB/ c and C57BL/6strain of rag-2/jak3double-deficient mice. J Biomed Biotechnol 2011:539748, 2011)〇
[0065] 该小鼠可以通过Rag2基因缺损小鼠和Jak3基因缺损小鼠的交配来得到。
[0066] Rag(Recombination activating gene) 2基因为如下基因：在未成熟的淋巴细胞 中表达，具有免疫球蛋白基因及T细胞受体的重建所必需的功能，对于T细胞及B细胞的成 熟不可或缺。
[0067] 关于该敲除了 Rag2基因的小鼠的制作方法及该基因的详细情况，记载于Shinkai Y.et al. , Cell. 1992Mar 6 ；68(5) :855-67>Chen J. et al. , Curr Opin Immunol. 1994Apr ； 6(2) :313-9等中有记载，但通常可以通过该领域中众所周知的方法、例如使用靶载体的方 法来制作（Capecchi，E R.，Science，（1989)244, 1288-1292)。该方法利用了小鼠 ES 细胞 中的Rag2基因和靶载体上的基因的同源重组。
[0068] Jak3(Janus kinase 3)为非受体型酪氨酸激酶，为具有在与IL-2、IL-4、IL-7、 IL-9、IL-15及IL-21共通的共同γ链的细胞内区域聚集并将经由共同γ链的信号传递 至细胞内的功能的蛋白质。经由共同Y链、Jak3的信号为NK细胞所必需的信号，因此，若 该通路被损伤，则NK细胞缺损。即，若敲除Jak3基因，则可以使NK活性消失。
[0069] 关于Jak3基因及共同Y链基因的详细情况，记载于Park SY. et al.， Immunity. 1995Dec ；3 (6):771-82>Suzuki K. et al. ,Int Immunol. 2000Feb ； 12 (2):123-32 等，参照这些文献，可得到Jak3基因缺损、NK活性消失的小鼠。
[0070] 需要说明的是，Rag2缺损（-/_)小鼠及Jak3缺损（-/_)小鼠也可以从熊本大学 生命资源研究支援中心获得。通过使这些小鼠和市售的BALB/c小鼠回交，可以分别得到与 Balb/c小鼠具有相同系统的遗传背景的BALB/c Rag2缺损（-/-)小鼠及BALB/c Jak3缺损 (_/_)小鼠。
[0071] Rag2基因及Jak3基因两者缺损的双敲除小鼠的制作中，首先，使BALB/cRag2缺损 小鼠和BALB/c Jak3缺损小鼠交配而得到F1，接着，使Fl彼此交配而得到F2小鼠。然后， 只要从其中选择Rag2缺损（-/_)及Jak3缺损（-/_)的两缺损小鼠（BRJ小鼠）即可。作 为BRJ小鼠的选择方法，可以用PCR法或DNA南方印迹法确认例如Rag2及Jak3这两个基 因的缺损。
[0072] 3. ES细胞的建立
[0073] 本发明的ES细胞可以通过在GSK3抑制剂及MEK抑制剂的存在下对从如上得到的 BRJ小鼠中采集的胚胎进行培养来得到。
[0074] 首先，通过由受精后的BRJ雌小鼠培养受精卵或二细胞期胚胎进行培养来得到， 或者直接得到囊胚。受精通过自然交配、或体外受精法。体外受精通过对使雌小鼠过量排 卵而得到的卵子和从雄小鼠中采集的精子进行培养而进行。
[0075] 接着，将采集的囊胚或内部细胞块在动物细胞的培养用培养基中且在GSK-3抑制 剂及MEK抑制剂的存在下培养约1?3周、优选14-18天。
[0076] GSK_3(糖原合成酶激酶3)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为作用于涉及糖原 的产生或凋亡、干细胞的维持等的许多信号通路的酶。作为GSK-3抑制剂，可以举出： CHIR99021(提供方：和光纯药）、6_溴靛玉红-3-厢（6-Bromoindirubin-3-〇xime ;ΒΙ0)(提 供方：和光纯药）等。GSK-3抑制剂在培养基中的添加量为0. 1?10 μ M(微摩尔），优选为 0. 3?3 μ M。GSK-3抑制剂在培养基中的添加时期没有特别限定，优选从囊胚的培养开始时 进行添加。
[0077] MEK抑制剂为抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAP Kinase Kinase ;ΜΕΚ)活性、抑 制ERK1/ERK2的活化的蛋白激酶抑制剂。作为MEK抑制剂，可以举出例如：PD0325901 (提 供方：和光纯药）、U0126(提供方=Promega)等。PD0325901抑制剂在培养基中的添加量没 有特别限定，例如为3 μ M。
[0078] 培养条件没有特别限定，例如在约37°C、5% CO2的气氛中进行。继代培养可以以 3?4天的间隔、在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)饲养层上或用胶原酶I涂敷了的板上进行。
[0079] 作为培养基，可以举出例如GMEM培养基（Glasgow，s Minimal Essential Medium)、DMEM (杜尔贝科改良伊格尔培养基）、RPMI 1640培养培养基等。培养培养基可以从 KSR(Knockout Serum Replacement)、牛胎儿血清（FBS)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、 β-巯基乙醇、非必需氨基酸、谷氨酸、丙酮酸钠及抗生物质（例如青霉素、链霉素等）等中 选择并适宜添加。
[0080] 培养规定期间后，通过在含有EDTA或胶原酶IV的培养基中进行培养来回收ES细 胞。所回收的ES细胞也可以根据需要在饲养层细胞的存在或非存在下进行培养来进行多 次继代培养。需要说明的是，不含饲养层的条件下的内部细胞块的培养在用MEF驯化的培 养基中进行。
[0081] 所培养的ES细胞通常可以使用这些标记基因鉴定。作为ES细胞的标记基因，可 以举出例如0ct3/4、碱性磷酸酶、Sox2、Nanog、⑶F3、REX1、FGF4等。标记基因或基因产物 的存在利用PCR或蛋白质印迹（western blot)等任意的方法进行检测即可。
[0082] 另外，也可以通过SNP标记的检测确认本发明的ES细胞是否为目标细胞、是否为 BALB/c，通过利用PCR或南方印迹法的分析确认是否为Rag2缺损及Jak3缺损。例如，小鼠 的SNP的数据库发表于http://www. broadinstitute. org/snp/mouse，如果使用该数据库 核对SNP信息，则可以确认为BALB/c，如果Rag2及Jak3基因缺损，则判断为本发明的ES细 胞。
[0083] 如上得到的ES细胞称为"BRJ8"，在2012年3月23日（保藏日）、在独立行政法 人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心（〒292-0818千叶县木更津市上总镰足 2-5-8NITE生物技术本部专利微生物保藏中心）基于布达佩斯条约进行国际保藏。其保藏 编号为 "NITE BP-1297"。
[0084] 上述ES细胞的详细信息如下所述。
[0085] 关于GSK抑制剂及MEK抑制剂的ES细胞的建立法，已发表有论文，但得到的ES细 胞继承原来的系统的遗传性质，分别含有特有的特征。免疫缺陷小鼠存在各种系统，但除 原来的遗传背景之外，分别具有不同的基因变异，因此，每个系统具有固有的特征。例如， 报告的NOG小鼠在NOD系统中具有SCID及受体IL2的common gamma (IL2R- γ )基因的缺 损。NOD小鼠原来缺损补体。SCID的致病基因为Prkdc (DNA依赖性蛋白激酶，催化亚单位； DNA-dependent protein kinase，catalytic subunit)，该基因为免疫球蛋白基因或 T细胞 受体的重建所必需的基因。因此，若该基因中存在变异，则无法形成B淋巴细胞或T淋巴细 胞。另外，IL2R-Y为构成IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15及IL-21等白介素的受体的共通 的分子。因此，若该分子缺损，则无法传递经由这些白介素的信号，无法进行免疫应答。若 进行综合，则除补体、B淋巴细胞、T淋巴细胞的缺损之外，也发现巨噬细胞及树状细胞的功 能降低，免疫缺陷状态进一步变得严重。但是，由于为重度的免疫缺陷，因此，即使正常小鼠 中完全不成问题的机会性感染病原体也根据情况致命，或高比例地发生胸腺瘤。
[0086] 另一方面，已知BRJ小鼠在BALB/c小鼠这样的系统中缺损Rag2及Jak3的基因， 移植后的细胞的生存率良好。Rag2与Prkdc同样地为重建免疫球蛋白基因或T细胞受体所 必需的基因，另外，Jak3为存在于IL2R-γ下游的基因，因此，因这些基因的缺损而成为重 症的免疫缺陷状态。但是，BRJ的饲养及繁殖比较容易。
[0087] 在预实验中，采用现有使用的GMEM-KSR培养基尝试建立了 ES细胞，但仅建立增 殖非常差的株，即使使用该株制作嵌合体小鼠，也只能得到50%左右的嵌合，对种系（germ line)也没有贡献。与此相对，在本发明中，通过在培养基加入为了维持ES的未分化状态 有效的GSK3的抑制剂和MEK的抑制剂，可以建立目标ES细胞。本发明的ES细胞的增殖力 高，嵌合也高。其理由是因为与使用现有方法制作的ES细胞相比，良好地保持未分化状态。 在ES细胞的分化中起作用的重要的信号之一为从FGF4经由FGF受体的ERK/MEK的通路。 即，ERK作为分化的信号起作用。另外，GSK-3通过对β -连环素进行磷酸化来刺激Wnt信 号，从而诱导分化。因此，通过使用作为强力的MEK抑制剂的Η)0325901和GSK3抑制剂这 2个抑制剂（2i)，本发明的ES细胞可以抑制分化而维持多分化能。
[0088] 4.基因修饰
[0089] 为了建立最适于进行人源化的基因修饰小鼠，需要的不是成为成体的小鼠，而是 需要在ES细胞的阶段将内在基因置换为人源型、或将人类基因导入ES细胞之后，由该基因 修饰及/或基因导入ES细胞制作小鼠。
[0090] 因此，在本发明中，为了向ES细胞导入目标基因，或将ES细胞中内在的基因置换 为人类基因，利用作为源自噬菌体的重组系统Cre-IoxP系统、作为源自弧菌属菌的重组系 统VCre-Vlox系统、作为利用了 Cre的同源体的重组系统Dre/rox系统、或对这些重组系统 进行了修饰的系统形成的同源重组。
[0091] IoxP (locus of c r o s s i n g (X-r i n g) o v e r , Pl)为由 34 喊基 (5, -ATAACTTCGTATAGCATACAT TATACGAAGTTAT-3'）构成的序列（序列号 1)，自 5' 末端起 13碱基（称为反向重复序列1)及自3'末端起13碱基的序列（称为反向重复序列2)分别 构成反向重复序列，由"GCATACAT"所示的8碱基的被称为间隔区的序列夹持于上述反向重 复序列1及2(图1)。"反向重复序列"是指以间隔区为边界，一侧的序列与另一侧的序列 在互相相对的方向互补的序列。
[0092] 所谓Cre (causes recombination)是引起基因重组的重组酶（也称为重组酶），以 识别上述重复序列、将间隔区部分的"cataca"作为粘合末端的切断方式切断。
[0093] 但是，在细菌中，在2处IoxP间引起重组，发生插入或削除反应（图1)。如果可以 在哺乳类细胞中引起插入反应，则之后可以插入任意的基因，因此，应用性显著扩大。由于 哺乳类细胞的核较大，因此，具有暂且被削除的IoxP的环状DNA扩散，几乎观察不到插入反 应。
[0094] 因此，本发明人认为，为了引起插入反应，在IoxP序列中导入变异，若暂且将基因 插入于基因组，则所插入的基因不能削除（不会从基因组中脱离），因此，设计多种变异型 1οχΡ(1οχ66、1οχ71、1οχ511、1οχ2272)(图 1)。这些变异型 IoxP 是公知的（TO01/005987 号 公报、日本特开2007-100号公报）。
[0095] 另外，在本发明中，也可以利用被称为Vlox的系统。Vlox为作为源自弧菌属细 菌的重组系统的 VCre_Vlox(Suzuki，E.，Nakayama，M. VCre/VloxP andSCre/CloxP:new site-specific recombination systems for genomeengineering.Nucleic Acid Res. 2011，1-11)，可利用 Vlox43L、Vlox43R、Vlox2272 等（图 I)。
[0096] 以下示出IoxP及变异型IoxP以及Vlox系统的碱基序列（图I)。
[0097] IoxP :ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (序列号 1)
[0098] Iox7I :TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (序列号 2)
[0099] Iox66 :ATAACTTCGTATAGCATAGATTATACGAACGGTA (序列号 3)
[0100] lox511 :ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT (序列号 4)
[0101] loX2272 :ATAACTTCGTATAGGATACTTTATACGAAGTTAT (序列号 5)
[0102] Vlox :TCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGA(序列号 6)
[0103] Vl〇x43L :CGTGATTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAAATTGA(序列号 7)
[0104] Vlox43R :TCAATTTCTGAGAACTGTCATTCTCGGAATACCT (序列号 8)
[0105] Vlox2272 :TCAATTTCTGAGAAGTGTCTTTCTCGGAAATTGA(序列号 9)
[0106] 进而，在本发明中，可以采用Dre/rox系统（图2)。
[0107] Dre为D6-位点特异的DNA重组酶，为识别下述rox位点的序列的酶（Sauer，B. and McDermott，Nucic Acid. Res. 32 :6086_6095,2004)。将利用 了该重组酶及 rox 识别序列的 重组系统称为Dre/rox系统。该系统与Cre-Iox系统密切相关，但识别的DNA特异性不同。
[0108] 以下示出Iox及rox的碱基序列（图2)。
[0109] rox :5'-TAACTTTAAATAATGCCAATTATTTAAAGTTA-3，（序列号 10)
[0110] 3, -ATTGAAATTTATTACGGTTAATAAATTTCAAT-5 ' （序列号 11)
[0111] Iox :5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3 ' （序列号 12)
[0112] 3' -TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA-5'(序列号 13)
[0113] 在本发明中，如上所述，以建立具有人正常肝脏的小鼠为目的，进而，建立肝脏疾 病模型小鼠也作为目的。因此，在本发明中，对ES细胞中进行基因操作以使其可以在小鼠 肝细胞的细胞质中表达毒素而诱导小鼠肝细胞死亡。另外，为了制作具有人正常肝脏的小 鼠，需要移植人肝细胞并使其增殖，因此，在ES细胞中，用人的生长激素基因置换小鼠生长 激素基因。另外，为了分析药物代谢等功能，用人的药物代谢酶基因置换小鼠药物代谢酶基 因。
[0114] 导入了肝细胞死亡的小鼠由于使肝功能消失，因此该小鼠除可用作肝脏损伤模型 之外，还可以通过移植人正常肝细胞，可以得到肝脏人源化的小鼠。
[0115] 图3为用于将小鼠生长激素（GH)基因置换为人类GH基因的同源重组载体的构建 图。
[0116] 另外，图4为用于将作为药物代谢酶基因的Cyp基因置换为人类Cyp基因的同源 重组载体的构建图。
[0117] 从小鼠基因向上述人类基因的置换可以按照W001/005987号公报中记载的基因 捕获法进行。例如，使用如上所述制作的载体进行2阶段的基因捕获。
[0118] 第1阶段为通常的基因捕获法。在该通常的基因捕获中，向ES细胞导入上述捕获 载体，捕获ES细胞内原本存在的内源性基因。由此，ES细胞中的内源性基因被破坏。接着， 将人类基因在质粒（置换载体）上与Iox序列（例如l〇 X66等）的下游连接，进行第2阶 段的基因捕获（图3、4)。
[0119] 在第2阶段的基因捕获中，将与l〇X66的下游连结的人类基因（hGH、hCyp等）导 入ES细胞中。由此，第1阶段中所导入的捕获载体的l 〇X71位点在与第2阶段中导入的载 体的1οχ66之间引起重组，可以导入含有由"（1οχ71/66)-(人类基因）-(IoxP) "构成的盒的 修饰的基因。需要说明的是，可以在人类基因和IoxP之间连结嘌呤霉素抗性基因（puro)。
[0120] 根据该方法，可以用人类基因置换内源性小鼠基因。图3及4表示置换等位基因 的图。
[0121] 在此，在图3及图4中，Exl、Ex2、Ex3及Ex4分别表示小鼠生长激素基因及小鼠 Cyp3al3基因的外显子1?4, pA表示poly A序列，Frt表示FLP的识别位点，PGK-neo表 示连结有PGK启动子的新霉素抗性基因，P-puro表示连结有PGK启动子的嘌呤霉素抗性基 因。
[0122] 5.嵌合体小鼠的制作
[0123] 嵌合体小鼠的制作可以用标准的方法进行。
[0124] 首先，使上述建立的ES细胞、或导入或置换有基因的ES细胞与8细胞期胚胎凝 聚，或注入于囊胚。将如上制作的胚胎称为嵌合体胚胎，通过将该嵌合体胚胎移植在伪妊娠 假亲的子宫内使其生产而制作嵌合体小鼠。
[0125] 例如，嵌合体胚胎的制作中，首先，使利用激素剂实施了过排卵处理的雌小鼠与雄 小鼠交配。然后，在规定天数后从卵管或子宫中回收初期产生胚胎。使ES细胞与回收的胚 胎凝聚或向回收的胚胎凝聚注入ES细胞，制作嵌合体胚胎。
[0126] 在此，"胚胎"是指从个体产生中的从受精到出生阶段的个体，包含2细胞期胚胎、 4细胞期胚胎、8细胞期胚胎、桑椹期胚胎、囊胚等。在使用8细胞期胚胎的情况下，可以在 从受精开始第2. 5天分别从卵管或子宫中回收初期产生胚胎，在使用囊胚的情况下，可以 在从受精开始第3. 5天分别从卵管或子宫中回收初期产生胚胎。
[0127] 作为使用ES细胞和胚胎而制作集合体的方法，可以使用显微注射法、凝聚法等公 知方法。"集合体"是指ES细胞及胚胎在相同空间内聚集而形成的集合体，也是指将ES细 胞注入于胚胎的形态、使胚胎暴露于各个细胞并与ES细胞一同凝聚的形态的任一种。
[0128] 在采用显微注射法的情况下，在回收的胚胎中注入ES细胞而制作细胞的集合体。 另外，在采用凝聚法的情况下，只要将ES细胞撒在除去了透明带的正常胚胎上使其凝聚即 可。
[0129] 另一方面，用于作为假亲的伪妊娠雌小鼠可以通过与使正常性周期的雌小鼠与通 过输精管结扎等阉割的雄小鼠进行交配来得到。对于制作的伪妊娠小鼠，将通过上述的方 法制作的嵌合体胚胎移植于子宫内，然后使其生产，由此可以制作嵌合体小鼠。
[0130] 从这样的嵌合体小鼠中选择源自ES细胞移植胚胎的雄小鼠。选择的雄的嵌合体 小鼠成熟后，使该小鼠与纯系小鼠系统的雌小鼠交配。然后，在诞生的仔小鼠中出现源自ES 细胞的小鼠的被毛色，由此可以确认多能性干细胞被导入于嵌合体小鼠的生殖系列。
[0131] 6.人源化小鼠的制作
[0132] (1)最适用于人源化的基因修饰小鼠的制作
[0133] 使用导入或置换有基因的ES细胞建立的转基因小鼠、即基因修饰小鼠如后所述 为用于建立具有100%人源化的肝脏的小鼠的基本的小鼠。
[0134] 为了避免排斥反应，使用NOJ小鼠的ES细胞或BRJ小鼠的ES细胞。
[0135] (i)N0J(N0D/SCID/Jak3-/_)小鼠：03、1\8、疆、疆1'缺损
[0136] NOJ小鼠的制作中，使NOD小鼠和SCID小鼠交配，向NOD的遗传背景导入SCID基 因变异。进而，通过也与Jak3缺损小鼠交配，得到在NOD的遗传背景中具有SCID及Jak3 基因缺损的小鼠（N0J小鼠）。在该小鼠中，作为补体的C3缺损、另外，T细胞、B细胞、NK细 胞、NKT细胞也缺损。
[0137] (ii)BRJ(BALB/c ;Rag2-/_ ;Jak3-/_)小鼠：T，B，NK，NKT 缺损
[0138] 在本发明中，除上述NOJ小鼠之外，可以使用BRJ小鼠。BRJ小鼠为向BALB/c小鼠 的遗传背景导入了 Rag2及Jak3基因缺损的小鼠，T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞缺损。 与NOJ小鼠相比，容易繁殖，可生产多只小鼠。
[0139] (2)肝脏损伤模型小鼠的制作
[0140] 肝损伤模型小鼠通过抗雌激素剂的给药而表达毒素表达并除去小鼠肝细胞（杀 死），由此可以制作失去肝功能的损伤模型小鼠。
[0141] 为了杀死小鼠肝细胞、另外，为了在小鼠肝细胞的细胞质中表达Dre-ERT2,制作以 下的构建体1及构建体2。所谓Dre-ER T2为Dre重组酶基因与变异型雌激素受体基因连接 的载体，所述变异型雌激素受体基因对雌激素受体基因进行了修饰，使其产生的雌激素受 体不会与哺乳类体内产生的雌激素结合。
[0142] 构建体1 :
[0143] CAG-ATG-rox-EGFP-rox-DT-A
[0144] 构建体2:
[0145] SAP-Dre-ERT2
[0146] 构建体l在紧邻CAG启动子的下游连接了由（i)ATG、（ii)r0X夹持的EGFP及（iii) DT-A (白喉毒素片段 A ;diphtheria toxin fragment A)。
[0147] EGFP的启始密码子与rox上游的ATG以框架相吻合的方式设计。另外，除去DT-A 的启始密码子，以rox上游的ATG与框架相吻合的方式设计。
[0148] 构建体2在紧邻肝细胞特异的血清淀粉样蛋白P成分（serum amyloid P component :SAP)的启动子的下游连接有Dre_ERT2。
[0149] 通过将这些构建体1及2共导入本发明的ES细胞，可以在他莫昔芬（Tamoxifen) 给药后发生位点特异的重组，肝细胞特异性地表达白喉毒素而诱导细胞死亡。
[0150] 即，作为非类固醇性的抗雌激素剂，例如他莫昔芬（Tamoxifen)为通过与雌激素 竞争性地与雌激素受体结合而显示抗雌激素作用，从而具有抗肿瘤活性的物质。若对表达 了 Dre-ERT2的人源化小鼠给药他莫昔芬，则Dre-ERT2通过他莫昔芬转移至核。在2个rox间 发生重组，白喉毒素基因的启动子发挥作用。由此，毒素 DT-A表达，杀死小鼠的肝细胞（图 5)。
[0151] 他莫昔芬的给药次数及给药时期只要可以杀死肝细胞就没有特别限定，例如如下 进行。
[0152] 将他莫昔芬溶解于乙醇，将该溶液用葵花籽油（S5007, Sigma)稀释，将浓度调整 为7mg/ml。使用该溶液，对成体以105mg/kg体重的方式连续4天腹腔内给药。
[0153] (3)肝细胞被置换为人肝细胞的人源化小鼠的制作
[0154] 如上所述，肝细胞被人肝细胞置换的小鼠通过抗雌激素剂的给药而除去小鼠肝细 胞，并且将人肝细胞移植到小鼠中，由此可以得到肝细胞被人肝细胞置换的人源化小鼠。
[0155] 为了长期维持肝脏功能及确认安全性，需要建立具有人正常肝脏的小鼠。
[0156] (i)小鼠生长激素基因被置换为人类基因的ES细胞的制作
[0157] 为了使移植后的人肝细胞可以增殖，将小鼠生长激素基因在ES细胞的阶段置换 为人类基因。
[0158] 具体而言，如上所述，以2个步骤进行ES细胞的基因置换。
[0159] 在第 1 步骤中，使用导入了 SAP-Dre-ERT2 及 CAG-rox-EGFP-rox-DT-A 的 BRJ ES 细胞（BRJ ES:SAP-Dre-ERT2;称为CAG-rox-EGFP-rox-DT-A)进行同源重组，在启始密码子 处破坏小鼠生长激素基因，并且建立在该区域插入了 l〇x71-PGK-ne〇-l〇xP的ES细胞（BRJ ES: :SAP-Dre-ERT2 ;CAG-rox-EGFP-rox-DT-A ;Ghneo)。
[0160] 在第2步骤中，可以使用该ES细胞和置换载体来建立ES细胞（BRJ ES : SAP-Dre-ERT2 ;CAG-rox-EGFP-rox-DT-A ;GhhGH)，其插入有人生长激素基因 cDNA 代替 neo 基因。
[0161] 可以使用如上建立的ES细胞而得到产生人生长激素的小鼠。
[0162] (ii)小鼠肝细胞及未分化肝细胞的除去
[0163] 他莫昔芬的给药次数及给药时期与上述相同。
[0164] (iii)移植的人肝细胞的制作
[0165] 移植的人肝细胞可以由iPS细胞诱导。
[0166] 人肝细胞可以由人iPS细胞、使用支持细胞或细胞外基质有效地确立内胚层及肝 脏分化诱导方法。
[0167] iPS细胞可以通过将编码含有Oct、Sox、Klf、Myc、Nanog、Lin等家族基因的 3?6个转录因子（核初期化因子）的基因导入体细胞来进行诱导（Takahashi，K.，et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2, 3081-9 (2007) :Fusaki N, Ban H, Nishiyama A1Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009 ；85 (8):348-62.)〇
[0168] 作为Oct家族基因，可以举出例如0ct3/4、0ctlA、0ct6等，优选为0ct3/4。
[0169] 作为Sox (SRY相关HMG盒）家族基因，可以举出例如Sox I、Sox2、Sox3、Sox7、Sox 15 等，优选Sox2。
[0170] 作为Klf(Kruppel样因子）家族基因，可以举出例如Klfl、Klf2、Klf4、Klf5等， 优选Klf4。
[0171] 作为Myc家族成员，可以举出：c-Myc、N-Myc、L-Myc等，优选c-Myc。
[0172] Nanog为在囊胚的内部细胞块中最高地表达、在分化细胞中不表达的同源异形盒 蛋白质。
[0173] 作为Lin家族基因，可以举出例如作为未分化人ES细胞的标记的Lin28。
[0174] 更具体而言，作为转录因子，优选0ct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的组合 (Takahashi, Κ· and Yamanaka, S.，Cell 126, 663-676 (2006))，此外，也可以使用 0ct3/4、 Sox2 及 Klf4 的组合、或 0ct3/4、Sox2、Klf4 及 L-Myc 的组合。
[0175] 作为体细胞，可以举出例如皮肤细胞、肝脏细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等。
[0176] 对体细胞的基因导入法可以举出例如脂质转染、电穿孔、显微注射、利用病毒载 体的导入等，没有特别限定。作为病毒载体，可以举出例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、 腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒等。也可以利用市售的载体、例如仙台病毒载体 (DNAVEC)。
[0177] 在使用载体的情况下，也可以以启动子及增强子等调节序列起作用的形式进行连 结以使导入的基因能够表达。作为启动子，有例如CMV启动子、RSV启动子、SV40启动子等。 这些载体可以进一步含有药剂抗性基因（例如嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、氨苄 西林抗性基因、潮霉素抗性基因等）等正向选择标记、负向选择标记（例如白喉毒素 A碎片 基因或胸苷激酶基因等）、核糖体内部进入位点（IRES(internal ribosome entry site))、 终止子、复制起点等。
[0178] 若将体细胞（例如0.5X IO4?5X IO6细胞/IOOmm平皿）在约37°C下、在MEF饲养 层上或不含饲养层的条件下转染含有上述核初期化因子的载体并进行培养，则在约1?4 周后诱导iPS细胞。
[0179] 作为培养基，可以举出例如GMEM培养基（Glasgow，s Minimal Essential Medium)、DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基）、RPMI1640培养基、OPTI-MEMI培养基等。培 养培养基可以从KSR(血清替代品；Knockout Serum Replacement)、牛胎儿血清（FBS)、激 活素-A(activin-A)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、视黄酸、地塞米松、β -巯基乙醇、 非必需氨基酸、谷氨酸、丙酮酸钠及抗生物质（例如青霉素、链霉素等）等中选择并适宜添 加。
[0180] 在培养指定期间后，与ES细胞的培养时同样地，通过在含有EDTA或胶原酶IV的 培养基中进行培养并回收细胞。在不含饲养层的条件下，可以将细胞在基质涂布平板上、在 用MEF驯化后的培养基中进行。
[0181] 通常，从iPS细胞向人肝细胞经过3个阶段进行分化诱导。作为原则，如下所述：
[0182] (a)从多能性干细胞向内胚层系的诱导；
[0183] (b)从内胚层系向未成熟肝细胞的诱导；及
[0184] (C)从未成熟肝细胞向成熟肝细胞的诱导。
[0185] 上述（a)中，激活素-A(activin A)或Wnt信号较为重要，在（b)中，FGF或 BMP较为重要，而且，在（c)中，肝细胞生长素 （Hepatocyte growth factor)、抑癌因子 (Oncostatin)、地塞米松（Dexamethasone)较为重要。
[0186] 但是，上述（b)及（c)的步骤可以适宜替代为DMSO或视黄酸、FGF4或皮质醇 (hydrocortisone)〇
[0187] 人肝细胞的移植时期为胎生第15. 5天、或生后8周前后的成体小鼠。
[0188] 人肝细胞的移植细胞数优选为IO5?IO6个。
[0189] 就人肝细胞的移植途径而言，在胚胎的情况下，从卵黄囊静脉（yolk sacvessel) 注入进行移植（图6、7)。在成体的情况下，注入脾脏内。
[0190] (iv)人肝细胞的增殖
[0191] 使用小鼠生长激素基因置换为人生长激素基因的ES细胞建立的小鼠可以产生人 生长激素。该人生长激素作用于移植的人肝细胞，促进其生长，可以建立具有正常尺寸的人 肝脏的人源化肝脏小鼠。
[0192] 小鼠肝细胞整体（100% )置换为人肝细胞的确认、S卩，对小鼠肝细胞不存在进行 的确认可以通过利用RT-PCR法等分析在小鼠肝脏中表达的基因的表达来进行。
[0193] (4)人源化肝脏小鼠的评价
[0194] 肝脏人源化可以通过单独或适宜组合并检查以下的事项来确认。
[0195] (i)肝功能的检验
[0196] 作为用于检验肝功能的检查项目，可以举出例如以下的项目。检查期间没有特别 限定，优选进行1年以上。
[0197] 蛋白相关：总蛋白、ALB，TTT，ZTT，CRP，Haptoglobin，C3, C4
[0198] 非蛋白性氮成分：总胆红素，直接胆红素
[0199] 糖质：二醇
[0200] 脂质：甘油三酸酯、总胆固醇、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、ApoAI ApoCII
[0201] 酶：乳酸脱氢酶（LDH)、天冬氨酸氨基转移酶（AST(GOT))、丙氨酸氨基转移酶 (ALT(GPT))、Y-谷氨酰转移酶（GGT)、肌酸激酶（CK)、碱性磷酸酶（AP)、淀粉酶（AML)
[0202] 其它：钙、Fe、无机磷酸
[0203] ICG检查：经静脉给药吲哚菁绿（ICG)，经时地测定血中的ICG浓度，检查肝脏的色 素排泄功能。ICG与血中的脂蛋白结合而输送至肝脏，在通过血窦期间被肝细胞摄取，不接 受抱合而排泄至胆汁，因此，可以作为肝脏整体的脏器而不是肝细胞的功能进行分析。
[0204] CT检查：检查肝脏的形态变化。
[0205] (ii)药物代谢
[0206] 使用PCR array法分析以下的药物代谢相关酶
[0207] ?细胞色素 P450 :CYP1 IAl，CYPl IBl，CYPl 1B2，CYP17A1，CYP19A1，CYPlAl，CYP1A2， CYPlBl， CYP21A2, CYP24A1， CYP26A1， CYP26B1， CYP26C1， CYP27A1， CYP27B1， CYP2A13， CYP2R1, CYP2S1, CYP2B6, CYP2C18, CYP2C19, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1， CYP2W1, CYP3A4, CYP3A43, CYP3A5, CYP3A7, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP7A1, CYP7B1, CYP8B1.
[0208] ·乙醇脱氢酶：ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH4, ADH5, ADH6, ADH7, DHRS2， HSD17B10(HADH2).
[0209] ?酯酶：AADAC，CEL，ESD，GZMA，GZMB，UCHLl，UCHL3.
[0210] ?醛脱氢酶：ALDH1A1，ALDH1A2, ALDH1A3, ALDH1B1，ALDH2, ALDH3A1，ALDH3A2， ALDH3B1, ALDH3B2, ALDH4A1, ALDH5A1, ALDH6A1, ALDH7A1, ALDH8A1, ALDH9A1.
[0211] ?含黄素单氧化酶：FM01，FM02, FM03, FM04, FM05.
[0212] ?单胺氧化酶：MA0A，MAOB.
[0213] ?前列腺素内过氧化物合酶：PTGS1，PTGS2.
[0214] ?黄嘌呤脱氢酶：XDH.
[0215] ?二氢嘧啶脱氢酶：DPYD.
[0216] (iii)肝细胞功能的体外检验
[0217] 由于肝细胞源自内胚层，因此，通过调查内胚层系及肝细胞内表达基因的经时表 达、糖原的蓄积、细胞色素酶的表达等，可以检验是否具有人肝脏的功能。
[0218] 在内胚层系及肝细胞内表达基因的经时表达可以用0ct3/4、T、Gsc、Mixll、Foxa2、 Hex、Hnf4a、Hnf6、Afp、Alb、Ttr、a AT等检验。其检验方法例如为一般的RNA印迹法、RT-PCR 法、蛋白质印迹法。
[0219] 肝细胞的分泌能力可以通过ALB、转铁蛋白（transferring)、抗胰蛋白酶 (alphal-antitrypsin)、纤维蛋白原（fibrinogen)的培养液中的浓度测定来检验。其检验 方法例如为一般的蛋白质印迹法或EIA(酶免疫分析；enzyme-immuno assay)法。
[0220] 糖原的蓄积可以通过PAS (过碘酸希夫；periodic acid-Schiff)染色来检验。过 碘酸选择性地氧化葡萄糖残基而生成醛，利用希夫试剂变色为红紫色。
[0221] 细胞色素酶的表达可以通过主要的5个CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19及 CYP2D6的分析来检验。其检验方法例如为一般的RNA印迹法（Northern blotting) RNA印 迹法、RT-PCR法、蛋白质印迹法。
[0222] (5)利用源自人患者的肝细胞置换的肝脏疾病模型小鼠的制作
[0223] 对本发明的小鼠移植源自人患者的肝细胞，并且给药抗雌激素剂而除去源自小鼠 的肝细胞，由此可以得到人肝脏疾病模型小鼠。
[0224] 为了建立与人患者症状相同的疾病模型及分析病态，需要建立具有人变异肝脏的 小鼠。而且，可以用于建立人疾病最适化模型、开发通用性高的新的治疗法。
[0225] 以下，通过实施例对本发明进一步具体地进行说明。但是，本发明并不限定于这些 实施例。需要说明的是，关于来自iPS细胞的肝细胞的诱导、来自家族性淀粉样变多发性神 经病的患者、人丙酸血症的患者的iPS细胞的建立、使用进行了诱导的人肝细胞向小鼠的 移植实验等，已向伦理委员会、动物实验委员会、第2种重组DNA实验安全委员会申请并全 部得到许可。
[0226] 实施例1
[0227] ES细胞的建立
[0228] 在本实施例中，为了确立最适于人肝细胞移植的人源化最适小鼠，由BRJ小鼠胚 胎进行ES细胞株的建立,也确立了小鼠系统。
[0229] (l)BALB/c ;Rag2-/_ ;Jak3-/_(BRJ)小鼠的建立和其ES细胞株的建立
[0230] 使Rag2缺损及Jak3缺损小鼠进行交配，建立双缺损小鼠 BRJ(0no A, et al. J Biomed Biotechnol 2011 ;539748, 2011. doi :10. 1155/2011/5397481))。使用建立的 BRJ 小鼠进行体外受精，得到64个囊胚胚胎，在现有使用的GMEM-KSR培养基（14% KSR，1 % FBS，1000U/ml LIF in GMEM)中进行培养，尝试建立，但只能建立增殖非常差的2系统。
[0231] 使用它们制作嵌合体小鼠，但只能得到50%左右的嵌合，对种系（germline)也没 有贡献。因此，在培养基（GMEM-KSR-2i培养基）中加入为了维持ES的未分化状态有效的 GSK3的抑制剂CHIR99021和MEK的抑制剂PD0325901，再次尝试建立ES。
[0232] 具体而言，通过体外受精采集BRJ的胚胎。将64个囊胚在KSOM培养基上培养 4天直到成为囊胚，向48孔（仅明胶涂层）中每1个孔放入1个胚胎。使用培养基为 KSR-GMEM-2i培养基。作为该培养基组成，在G-MEM(格拉斯哥极限必需培养基；Glasgow minimum essential medium)中含有 IX MEM 非必需氨基酸（nonessential amino acids), Ο.ΙπιΜβ-疏基乙醇（i3-mercaptoethanol)、lmM 丙酮酸钠 （Sodium pyruvate)、l% 胎牛血 清（Fetal bovine serum(FBS) (Hyclone))、14%KnockoutTM SR(KSR)、1100uints/ml 白血病 抑制因子（Leukemia inhibitory factor(LIF))、2y M PD0325901 及 3μ M CHIR99021。培 养期间进行14天，在中途交换2次培养基。从14天后到18天后，从ICM增加了的孔向带 有饲养层细胞的24孔进行传代培养。进而，依次向12孔、6孔、6-cm平皿（dish)进行传代 培养，最终可以建立28系统增殖速度及形态均完全没有问题的ES株。
[0233] (2)使用了 BRJ ES细胞株的嵌合体小鼠制作和BRJ Rag2-/_ ;Jak3-/_小鼠系统 的建立
[0234] 使用可以建立的ES株中的8个细胞系，与通过B6雌和BDFl雄的交配而得到的桑 葚胚胎进行聚合，由此进行嵌合体小鼠制作（表1)。
[0235] 从3个ES系（BRJ-5, BRJ-6及BRJ-8)中得到的100%嵌合体中确认了向生殖系 列的传递（表2)。
[0236] 需要说明的是，得到的ES细胞中，将第8个细胞系称为"BRJ8"，在2012年3月23 日（保藏日）、在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心（〒292-0818 千叶县木更津市上总镰足2-5-8NITE生物技术本部专利微生物保藏中心）基于布达佩斯条 约进行国际保藏。其保藏编号为"NITEBP-1297"。
[0237] 表 1
[0238]

【权利要求】
1. 一种胚胎干细胞，其在GSK3抑制剂及MEK抑制剂的存在下对Rag2基因及Jak3基因 均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎进行培养而得到。
2. 如权利要求1所述的胚胎干细胞，其中，保藏编号由NITEBP-1297表示。
3. 如权利要求1或2所述的胚胎干细胞，其导入有雌激素受体基因及白喉毒素基因。
4. 如权利要求3所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的生长激素基因被源自人的 生长激素基因置换。
5. 如权利要求4所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的药物代谢酶基因进一步被 源自人的药物代谢酶基因置换。
6. 如权利要求5所述的胚胎干细胞，其中，在细胞中内在的药物代谢酶基因为选自由 Cyp3all、Cyp3al3、Cyp3a25 及Cyp3a41 构成的组中的至少一种。
7. -种小鼠，其使用权利要求1或2所述的胚胎干细胞制作。
8. -种转基因小鼠，其使用权利要求3?6中任一项所述的胚胎干细胞制作。
9. 如权利要求8所述的小鼠，其通过抗雌激素剂的给药引起肝细胞损伤。
10. -种肝脏人源化的小鼠，其特征在于，向权利要求8所述的小鼠移植源自人的肝细 胞，并且给药抗雌激素剂而除去源自该小鼠的肝细胞。
11. 如权利要求10所述的小鼠，其中，源自人的肝细胞源自具有肝脏疾病的患者。
12. -种人肝脏疾病模型小鼠，其由权利要求11所述的小鼠构成。
13. -种源自免疫缺陷小鼠的胚胎干细胞的制造方法，其特征在于，在GSK3抑制剂及 MEK抑制剂的存在下对Rag2基因及Jak3基因均缺损的免疫缺陷小鼠的胚胎进行培养。
14. 一种肝损伤模型小鼠的制作方法，其特征在于，对权利要求8所述的小鼠给药抗雌 激素剂。
15. -种肝脏人源化的小鼠的制作方法，其特征在于，向权利要求8所述的小鼠移植源 自人的肝细胞，并且给药抗雌激素剂而除去源自小鼠的肝细胞。
16. 如权利要求15所述的方法，其中，源自人的肝细胞源自具有肝脏疾病的患者。
【文档编号】A01K67/027GK104378975SQ201280071781
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2012年3月27日 优先权日:2012年3月27日
【发明者】山村研一, 荒木喜美, 冈田诚治, 下野明彦 申请人:转基因股份有限公司, 国立大学法人 熊本大学