一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法
【专利摘要】本发明为一种快速建立酿酒葡萄雷司令遗传转化再生体系的方法，属于葡萄转基因育种【技术领域】。其特征是，利用组织培养诱导葡萄花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株。通过PCR验证和体视荧光显微镜观察报告基因gfp表达与否，快速鉴定转化体，提高葡萄转基因效率。与已有技术相比，使用本发明培养基培育筛选效果好，可以快速进行雷司令转基因葡萄植株的再生，大幅度提高葡萄转基因效率，再生率达到81％，转化周期短，在7个月内即可以获得转基因植株，转化体大幅度增加，转化率可以达到63％。
【专利说明】一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于新植物【技术领域】，具体涉及葡萄转基因育种【技术领域】。
【背景技术】
[0002]培育葡萄新品种、改善果实品质、提高植株抗性是葡萄科研工作者十分关注的问题，但是葡萄基因数量大且多呈杂合状态，遗传背景复杂，利用传统的方法进行杂交育种，培育过程繁琐，周期较长，成本较高，效率较低，通过杂交获得优良品种的方法容易受到亲本材料的限制，杂交过程常常带入不良的经济性状，受到很大程度的制约。组织培养技术、分子生物学和基因工程技术的迅速发展，为葡萄新品种选育和品质改良研究开辟了新的途径。利用转基因手段培育葡萄优良品种，改善葡萄的农艺学性状，同时提高果实产量具有十分广阔的前景和极其重要的现实价值。
[0003]目前葡萄的遗传转化方法主要包括基因枪法和根癌农杆菌介导的Ti质粒法。基因枪法具有一次处理可使许多细胞转化的优点，但是获得单拷贝整合的植株比较困难，转基因植株的遗传特性较复杂，稳定性差，转基因植株的表达困难，易出现沉默现象等。根癌农杆菌介导的方法转化效率较高，可以导入的DNA片段较大，导入基因拷贝数低，表达效果较好，方法和使用的仪器简单，费用较低，是目前转化机理研究最清楚，使用最广泛，技术最成熟的方法。
[0004]以愈伤组织为受体材料进行基因遗传转化研究具有很多优势。第一，已分化的细胞均回复到脱分化的分生细胞水平，易于接受外源基因，转化效率较高；第二，扩繁量大，获得的转化愈伤组织通过继代扩繁培养，能够分化出更多的转化植株；第三，多种组织、器官均可诱导愈伤组织，外植体试材广泛。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服已有技术的不足，利用根癌农杆菌介导的方法，使用葡萄花药诱导胚性愈伤组织进行转化，既结合了农杆菌转化的优点，又克服了其他转化方法周期长，转化体少的缺点，通过本专利所描述的方法，以gfp为报告基因快速得到了酿酒葡萄品种雷司令的转基因苗，提闻了匍萄的转基因育种效率。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:
[0007]转基因的方法:利用组织培养诱导酿酒葡萄品种雷司令花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株，经分子检测及体式荧光显微镜观察，获得转基因葡萄苗。根据该转基因方法，其特征在于共培养前将农杆菌加入到抗性诱导培养基中进行活化，可显著提高转基因效率。0D_ = 1.0的菌液浓度侵染葡萄胚性愈伤组织能获得较高的抗性愈伤率。抗性诱导培养基配方为:5g L—1 +肉浸膏、Ig L—1酵母膏、5g L—1 蛋白胨、5g L—1 蔗糖、4g L-1MgSO4.7H20> 100 μ mo I L4 乙酰丁香酮、50mg I71 卡那霉素、50mg L—1利福平，调节pH为5.2。继代培养20天的胚性愈伤组织转化效率最高。胚性愈伤组织和农杆菌在含有100 μ mol L-1乙酰丁香酮的液体共培养基中侵染处理20分钟，可以顺利脱除愈伤组织上附着的根癌农杆菌，而不影响胚性愈伤组织的生长，液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡口多醇、0.5mg L—1烟酸、150mg L—1肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ molL-1乙酰丁香酮、Img T1NOAAOg L—1甘露糖醇，pH为5.2。农杆菌和愈伤组织共培养温度为28°C，固体共培养基成分为:MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸批P多醇、0.5mg I71烟酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%蔗糖、100μmoL—1乙酰丁香酮、Img PNOA和0.28%脱乙酰吉兰糖胶；共培养三天后使用液体继代培养基清洗，可显著降低愈伤组织褐化程度，提高转化效率，液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡哆醇、0.5mgL4烟酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%鹿糖、100 μ mol I71乙酰丁香酮、Img L-1NOAUg L—1头孢霉素和IOOmg L—1 二硫苏糖醇；选择培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L-1盐酸硫胺素、0.2mg L-1盐酸吡哆醇、0.5mg L-1烟酸、150mgL 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA,0.20mgL 1TDZ,0.5mg L 1NOA,0.0lmg L 1GA3、SOmg L 1 水解酿蛋白、
2.0mg L4甘氨酸、.1Og L—1椰乳、200mg L4头孢霉素、50mg I71卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ;分化培养基配方为MS大量兀素、MS微量兀素、MS铁盐、0.5mg L 1盐酸硫胺素、0.2mg I/1 盐酸批P多醇、0.5mg L4烟酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ, 0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L_1GA3>5mg I/1 的天冬氨酸、2.0mg I/1 甘氨酸、1OgL-1 椰乳、5%蔗糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ;所述生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg I/1盐酸硫胺素、0.8mg I71盐酸批P多醇、0.5mg L—1烟酸、IOOmg L4肌醇、0.5mg L—1 α -萘乙酸钠、0.5mg L-1NOA>50mg I71水解酪蛋白、2.0mg I71甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2。
[0008]进一步的，该方法按照以下步骤进行:
[0009](I)根癌农杆菌活化:含有绿色荧光蛋白基因gfp的根癌农杆菌菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行PCR验证，阳性表达的菌斑加入到抗性诱导培养基中，28°C，250rpm培养至OD6tltl = 1.0,将菌液5000rpm离心10分钟，弃上清，加入液体共培养培养基重悬，用作农杆菌悬浮侵染液，所述抗性诱导培养基配方为:5g L—1牛肉浸膏、lgL—1酵母膏、5g L—1 蛋白胨、5g L—1 蔗糖、4g L-11MgSO4.7Η20、100 μ molL—1 乙酰丁香酮、50mg L—1 卡那霉素、50mg L-1利福平，调节pH为5.2，所述液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg I/1盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸吡哆醇、0.5mg L4烟酸、150mg L4肌醇、50mgL—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L—1奈氧乙酸、90gL-1甘露糖醇，PH为5.2 ;
[0010](2)取继代培养后20天、生长状态良好的葡萄胚性愈伤组织，放入制备好的农杆菌悬浮侵染液，侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干愈伤组织表面菌液，转入固体共培养基中，28°C黑暗条件下倒置培养。三天后使用液体继代培养基清洗，所述固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg I/1盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸吡卩多醇、0.5mg I71烟酸、150mg L4肌醇、50mg L-1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mol L-1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脱乙酰吉兰糖胶；所述液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mgL-1盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸吡卩多醇、0.5mg L4烟酸、150mg L4肌醇、50mg L4水解酪蛋白、IOgL4椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1N0A、lg L4头孢霉素和IOOmg L—1 二硫苏
糖醇；
[0011](3)抗性愈伤组织的筛选:清洗后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上，每10天继代培养一次。所述选择培养基配方为MS大量兀素、MS微量兀素、MS铁盐、0.5mg L 1盐酸硫胺素、0.2mg L4 盐酸吡卩多醇、0.5mg I71 烟酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ, 0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L-1GA3>50mg L-1 水解酪蛋白、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg L-1 椰乳、200mg L-1头孢霉素、50mg L-1卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ；
[0012](4)阳性表达愈伤组织的鉴定:挑去选择培养基上继代培养3-4次仍然存活的愈伤组织于倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察；同时提取RNA，反转录为cDNA进行PCR初步验证；
[0013](5)植株再生:将阳性表达的愈伤组织转入分化培养基继续培养，再生成苗后转入生根培养基中，所述分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg.l-1盐酸硫胺素、0.2mg L4 盐酸吡卩多醇、0.5mg I71 烟酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mgL-1TDZ,0.5mg L-1NOA,0.0lmg L-1GA3>5mg L—1 的天冬氨酸、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg I71 椰乳、5%蔗糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ;所述生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg L-1盐酸硫胺素、0.8mg L-1盐酸批卩多醇、0.5mg L-1烟酸、IOOmg L-1肌醇、0.5mg L-1C1-萘乙酸钠、0.5mg L-1NOA,50mg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ；
[0014](6)转基因苗的鉴定及转基因植株的获得:提取转基因苗的RNA，反转录为cDNA，进行PCR验证；将PCR验证得到的阳性表达葡萄苗放置立体荧光显微镜下观察。
[0015]本发明具有以下有益的技术效果:
[0016]1、利用胚性愈伤组织作为侵染受体，能够大幅度提高葡萄转基因效率。
[0017]2、转化周期大大缩短，本发明可以在7个月内获得转基因植株，转化体大幅度增加，转化率达到63%。建立了较为高效的转基因体系，从而能够将更多的功能基因插入葡萄基因组，为葡萄功能基因组的研究提供技术平台。
[0018]3、利用根癌农杆菌介导葡萄胚性愈伤组织能够快速得到多个转化体，与基因枪法和花粉管介导法相比，减轻了工作量，提高了工作效率。
[0019]4、利用配方为5g L—1牛肉浸膏、IgL—1酵母膏、SgL—1蛋白胨、SgL—1鹿糖、4gL-1MgS04.7Η20>100 μ mo IL-1乙酰丁香酮、50mg L-1卡那霉素、50mg厂1利福平的抗性诱导培养基活化菌液，共培养基中添加lOOymolL—1乙酰丁香酮促进了转化效率的提高；利用配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡哆醇、0.5mgL4烟酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、IOg I71椰乳、5%鹿糖、100 μ mol I71乙酰丁香酮、Img T1NOAAOg L—1甘露糖醇的液体共培养培养基重悬菌液，可以有效地提高农杆菌活性；配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mgL_1盐酸吡哆醇、0.5mgL_1烟酸、ISOmgL4肌醇、SOmgL4水解酪蛋白、IOgL4椰乳、5%鹿糖、100 μ moll/1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脱乙酰吉兰糖胶的固体共培养基进行共培养，3天后采用含有IgL—1头孢霉素和IOOmg L-1 二硫苏糖醇的液体继代培养基清洗愈伤组织可以达到很好的清除农杆菌的效果，而不影响胚性愈伤组织的正常生长，该方法既经济又环保。配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L-1盐酸硫胺素、0.2mg L-1盐酸批哆醇、0.5mgL_1烟酸、150mg L1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.2mgL 1TDZ, 0.5mg L 1NOA, 0.0lmg L 1GA3,5Omg L1水解酪蛋白、2.0mg L4甘氨酸、IOg L4椰乳、ZOOmgI/1头孢霉素、50mg L4卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶的选择培养基可以很好地筛选抗性愈伤组织；分化培养基中较高浓度的盐酸硫胺素和肌醇以及附加的椰乳有利于愈伤组织的分化和胚状体的形成，高浓度(5%)的蔗糖有利于胚状体的发育，微量的赤霉素GA3有利于胚状体的生长；生根培养基与普通MS培养基相比含有较高浓度的盐酸吡哆醇(8% )，有利于根系的生长；本发明采用0.28%脱乙酰吉兰糖胶作为固化剂，与琼脂相比，脱乙酰吉兰糖胶透明度高，透气性好，凝固点低，含Ca、Mg等杂质成分少，有利于培养基中所含营养物质被植物吸收，具有较高的利用价值。使用上述培养基培育筛选效果好，可以快速进行雷司令转基因葡萄植株的再生，再生率达到81 %，转化周期短，转化效果好。
【专利附图】
【附图说明】:[0020]附图1:本发明由花药诱导产生的葡萄胚性愈伤组织；
[0021]附图2:本发明的转基因愈伤组织细胞在激光扫描共聚焦显微镜(LCSM，NikonD-ECLIPSE C I ；Nikon, Tokyo, Japan)下瞬时表达结果；
[0022]附图3:本发明的转基因愈伤组织细胞团在奥林巴斯体视荧光显微镜下观察；
[0023]附图4:本发明的转基因葡萄苗；
[0024]附图5:本发明的转基因苗PCR检测结果；图中，I =Marker (DL2000) ；2阴性对照；3:转化愈伤组织克隆
[0025]附图6:本发明的转基因葡萄叶片在奥林巴斯体视荧光显微镜下观察；
【具体实施方式】:
[0026]1、根癌农杆菌活化:含有绿色荧光蛋白基因(GFP)的根癌农杆菌菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行PCR验证，阳性表达的菌斑加入到抗性诱导培养基中(抗性诱导培养基配方为:5g L—1牛肉浸膏、Ig L—1酵母膏、5g L—1蛋白胨、SgL—1鹿糖、4gL_1MgS04.7Η20> 100 μ mol L4 乙酰丁香酮、50mg L4 卡那霉素、50mg L4 利福平,调节 pH 为
5.2)，28°C，250rpm培养至OD600 = 1.0。将菌液5000rpm离心10分钟，弃上清，加入液体共培养培养基重悬(液体共培养培养基配方为MS大量兀素、MS微量兀素、MS铁盐、0.5mgL_1盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸卩比卩多醇、0.5mg I71烟酸、150mg L4肌醇、50mg I71水解酪蛋白、1Og L—1 椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1 乙酰丁香酮、Img L-1N0A、90g L—1 甘露糖醇,pH 为 5.2),用作侵染液。
[0027]2、取继代培养后20天、生长状态良好的葡萄胚性愈伤组织，放入制备好的农杆菌悬浮侵染液，侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干愈伤组织表明菌液，转入固体共培养基中(固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡哆醇、0.SmgL—1烟酸、150mgL—1肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1NOA和0.28%脱乙酰吉兰糖胶)，28°C黑暗条件下倒置培养。三天后使用附加Ig L—1头孢霉素和IOOmg L-1 二硫苏糖醇的液体继代培养基清洗。[0028]3、抗性材料的筛选:清洗后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上(选择培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡哆醇、0.5mgL 1 烟酸、150mg L 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.20mg L 1TDZ, 0.5mg L 1NOA, 0.0lmg L 1GA3SOmgL4水解酪蛋白、2.0mg L4甘氨酸、IOg L1椰乳、200mg L4头孢霉素、50mg L4卡那霉素、5%蔗糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2)，每10天继代培养一次。
[0029]4、阳性表达愈伤组织的鉴定:挑取选择培养基上继代培养3-4次仍然存活的愈伤组织倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察；同时提取RNA，反转录为cDNA进行PCR初步验证。
[0030]5、植株再生:将胚状体转入分化培养基继续培养(分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L—1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸吡哆醇、0.5mg -1烟酸、150mg L 1 肌醇、1.0mg L 1P-CPA, 0.20mgL 1TDZ, 0.5mgL 1NOA, 0.0lmgL 1GA3JmgL 1 的天冬氛酸、2.0mgL—1甘氨酸、lOgL—1椰乳、5%蔗糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2)，再生成苗后转入生根培养基中(生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg -1盐酸硫胺素、0.8mg L—1盐酸吡卩多醇、0.5mg L—1烟酸、IOOmgL-1肌醇、0.5mg L—1 α -萘乙酸钠、
0.5mg L-1NOAjOmg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2)。
[0031]6、转基因苗的鉴定及转基因植株的获得:提取转基因苗的RNA，反转录为cDNA，进行PCR验证；将PCR验证得到的阳性表达葡萄叶片放置立体荧光显微镜下观察。
[0032]利用上述方法，本发明已经成功将报告基因gfp转入酿酒葡萄雷司令，建立了一种高效的葡萄转基因体系。使用上述培养基培育筛选效果好，可以快速进行雷司令转基因葡萄植株的再生，转化周期短，转化效果好。植株的再生率达到81 %，在7个月内即可以获得转基因植株，转化体大幅度增加，转化率可以达到63%。
[0033]受体材料状态的选择:
[0034]愈伤组织的生长状态对于葡萄高效的转化非常重要。总的来说是生长和细胞分裂旺盛的外植体易于接受外源DNA，因而对根癌农杆菌的侵染最为敏感，容易获得较高的转化效率。选择生长较一致，状态良好淡黄色颗粒状疏松的胚性愈伤组织进行继代培养，当继代培养20天时，愈伤组织的生长速度最快，转化效率也最高(表I)。
[0035]表I继代培养时间对胚性愈伤组织瞬时表达效率的影响
[0036]
【权利要求】
1.一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法，其特征在于:利用组织培养诱导葡萄品种雷司令花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株，经分子检测及体式荧光显微镜观察，获得转基因葡萄苗。
2.根据权利要求1所述的一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法，其特征在于，所述方法按照以下步骤进行: (1)根癌农杆菌活化:含有绿色荧光蛋白基因gfp的根癌农杆菌菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行PCR验证，阳性表达的菌斑加入到抗性诱导培养基中，28°C，.250rpm培养至0D_ = 1.0，将菌液5000rpm离心10分钟，弃上清，加入液体共培养培养基重悬，用作农杆菌悬浮侵染液，所述抗性诱导培养基配方为:5g L—1牛肉浸膏、Ig L—1酵母膏、.5g L—1 蛋白胨、5g L—1 鹿糖、4g I-1MgSO4.7Η20、100 μ molL—1 乙酰丁香酮、50mg L—1 卡那霉素、.50mg 1利福平，调节pH为5.2，所述液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg I/1盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸批卩多醇、0.5mg L4烟酸、150mg L4肌醇、50mgL—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mo I L—1乙酰丁香酮、Img L—1奈氧乙酸、9(-171甘露糖醇，PH为5.2 ; (2)取继代培养后20天、生长状态良好的葡萄胚性愈伤组织，放入制备好的农杆菌悬浮侵染液，侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干愈伤组织表面菌液，转入固体共培养基中，28°C黑暗条件下倒置培养。三天后使用液体继代培养基清洗，所述固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、.0.5mg I71盐酸硫胺素、0.2mg L4盐酸卩比卩多醇、0.5mg L4烟酸、150mg L4肌醇、50mg L4水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%蔗糖、100 μ mo I L-1乙酰丁香酮、Img T1NOA和0.28%脱乙酰吉兰糖胶；所述液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg 1盐酸硫胺素、0.2mg L—1盐酸批P多醇、0.5mg I71烟酸、150mg L4肌醇、50mg L—1水解酪蛋白、IOg L—1椰乳、5%鹿糖、100 μ mol L—1乙酰丁香酮、Img L-1N0A、lg L4头孢霉素和IOOmg L—1 二硫苏糖醇； (3)抗性愈伤组织的筛选:清洗后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上，每10天继代培养一次。所述选择培养基配方为MS大量兀素、MS微量兀素、MS铁盐、0.5mg L 1盐酸硫胺素、0.2mg L—1 盐酸吡哆醇、0.5mg -1 烟酸、150mg L-1 肌醇、1.0mg L-1P-CPA, 0.20mg T1TDZ,.0.5mg L-1NOA, 0.0lmg L-1GA3>50mg L4水解酪蛋白、2.0mg L-1 甘氨酸、IOg 厂1 椰乳、200mg L-1头孢霉素、50mg L-1卡那霉素、5%鹿糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ； (4)阳性表达愈伤组织的鉴定:挑去选择培养基上继代培养3-4次仍然存活的愈伤组织于倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察；同时提取RNA，反转录为cDNA进行PCR初步验证； (5)植株再生:将阳性表达的愈伤组织转入分化培养基继续培养，再生成苗后转入生根培养基中，所述分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg -1盐酸硫胺素、0.2mg L-1 盐酸吡哆醇、0.Smgr1 烟酸、lSOmgL—1 肌醇、1.0mgr1P-CPA70.20mgr1TDZ,.0.5mgL_1N0A,0.0ImgL-1GA3>5mgL_1 的天冬氨酸、2.0mg I71 甘氨酸、IOg I71 椰乳、5%鹿糖和.0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2 ;所述生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg L—1盐酸硫胺素、0.8mg L—1盐酸批P多醇、0.5mg L—1烟酸、IOOmg L—1肌醇、0.5mg.17、-萘乙酸钠、0.5mg L-1NOAjOmg L—1水解酪蛋白、2.0mg L—1甘氨酸、3%葡萄糖和0.28%脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2; (6)转基因苗的鉴定及转基因植株的获得:提取转基因苗的RNA，反转录为cDNA，进行PCR验证；将PCR验证得到的阳性表达葡萄苗放置立体荧光显微镜下观察。
【文档编号】A01H4/00GK103444524SQ201310031683
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年1月8日 优先权日:2013年1月8日
【发明者】赵凤霞, 高相彬, 王正平, 宋学立, 朱景伟 申请人:河南省农业科学院烟草研究所