专利名称：一株荧光假单胞菌及其对辣椒疫霉病的防治方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，具体是涉及生物防治植物病害的技术应用，主要一株植物内生的荧光假单胞菌及对辣椒疫霉病的防治方法，属于农作物防病控病技术领域。
背景技术：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)所引起的一种周期短，蔓延快、整个生育期各部位均可发病的毁灭性土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，除了引起大面积死秧外，还可造成叶片枯萎、果实腐烂、茎杆出现坏死斑，以及整株萎蔫死亡等多种症状。该病于1918年首次在美国新墨西哥洲发现，现已在世界各辣椒产区普遍发生。近年来，在我国的新疆、内蒙古、辽宁、北京、江苏、陕西等二十几个省市均有发生的报道，已成为我国辣椒生产上普遍发生的严重病害。多年来，国内外不断加强对辣椒疫病的防治工作，包括化学药剂的使用，抗病品种的选育，农业措施防治，生物防治。但是，辣椒疫霉属于异宗配合疫霉种，不同交配型的菌株相互诱导产生的卵孢子具有很强的抗逆能力；同时在有性生殖过程中可能发生基因重组，使该病原菌获得更强的生存能力、致病力以及更为广泛的寄主范围。而杀菌剂都属于特异性位点抑制剂，对病原菌的作用位点单一，只对病原菌的单一代谢环节起作用，所以连年多次的使用易使辣椒疫霉菌易对杀菌剂易产生抗药性，还会造成环境污染及果实的农药残留。同时辣椒抗疫病种质的抗性是由多基因控制的数量性状，其转育难度极大，且多为中抗或耐病品种，很少有高抗品种，更谈不上有免疫品种。农业措施防治如轮作、嫁接、套种、浅灌控水等可控制辣椒疫病的发生发展，但由于土地的限制以及经济利益的原因都不能从根本上消除辣椒疫病的发生。生物防治不会产生以上问题，而且有利于环境保护、维护生态平衡、保护物种多样性、有利于人类健康等优势，因此已成为近年来植物病害防治的研究热点。一株优秀的生防菌株发挥作用的第一步就是要在寄主植物根围或其它生境建立起一定的种群密度，这其中涉及到该生防菌与所施环境中土著种群以及一些病原微生物之间的相互竞争、抑制关系。在植物根围生境中使用的生防菌株要考虑到施用后能否在植物根围建立稳定种群从而通过各种不同方式行使生物防治的作用。而植物内生细菌作为植物微生态系统的组成成员，由于其定殖于植物组织内部与表生细菌相比具有更加良好的生态环境，避开了外界的不利环境如温度、渗透势、紫外线等；另外，内生细菌对寄主植物有促生、防病、内生固氮等多方面的有益生物学作用。对于植物内生细菌与植物和谐联合作用的研究，其核心的问题在于明确其侵染定殖规律，这对于相关菌剂的开发与应用是至关重要的。近年来，国内关于植物病害生防菌株的定殖研究报道有:何红等(2004)报道了辣椒疫霉生防菌枯草芽孢杆菌BS-1和BS -2定殖在辣椒和白菜的根、茎、叶内。周洪友等(2004)分离的番茄青枯病生防菌荧光假单胞菌CPFlO和2P24可定殖在番茄幼苗根部，且接菌20d后在根表和根内仍维持较高定殖量(IO5Cfu.cm-1以上)。王美琴等(2011)采用浸种和叶片涂抹2种方法测定了内生枯草芽孢杆菌Thhyl在在番茄内的定殖力，结果表明生防菌株Thhyl能进入番茄体内，但不同接种方法菌株在植物体内的定殖能力(数量)有差异，用叶片涂抹的方法数量为2532cfu.g_\浸种方法为75.3cfu.g'黎志坤等(2010)采用DGGE的方法通过样品中的优势细菌直观反映出细菌YPP-9能良好的定殖与番茄根际。Thomas等(2012)研究发现Cupriavidus pinatubonensis JMP134能利用拟南芥和洋槐根系分泌物而定殖在其根部的表皮和皮层，在根部的定殖量随接入量的增加而增大。文才艺等(2011)采用利福平和链霉素标记生防菌EBS05并用灌根和浸种法测定其在小麦体内的定殖力，结果表明EBS05在小麦根内具有较强的定殖能力袁且能从根部向茎、叶部转移，其定殖量与菌株的接种浓度呈正相关，当接种浓度为IO8CFRmr1时，EBS05能在根、茎内有效定殖，并持续向叶内转移。岳海涛等(2007 )等利用扫描电镜观察植物根际解盐促生细菌菌株Rs-5、Rs-35在无菌棉花根部的定殖情况，结果显示，这两株菌在棉花根部定殖具有宏观不均匀性，在根面的部分区域能够大量定殖，且在根部的扩展方式主要是根尖的被动携带。郝变青等(2010)采用绿色荧光蛋白基因标记技术研究了植物促生菌B96-1I在盆栽黄瓜植株上的分布。研究表明:B96-1I可在黄瓜的根、茎和叶上定殖，根部定殖的数量(7.2X IO4Cfu.g—1)显著高于茎部和叶部定殖的数量；黄瓜植株体内定殖的数量多于体表定殖的数量。这些研究报道了植物内生细菌在植物体内的定殖时间、定殖部位、定殖量和定殖机制、定殖动态以及采用标记方法和检测方法等，但对于如何保持内生细菌在植物体内的定殖数量没有相关报道，特别是没有查阅到利用重复接种技术来保持植物内生细菌定殖数量的报道。有关植物病害生防菌株的定殖的专利资料有:200710022993.2:主要研究了生防菌可以通过注射法或浇灌法定殖在植物体内；200510016938.3:测定出生防菌株可以在多种植物体内定殖；200710022993.2:将多种有益微生物制成混合菌剂，并在每半个月喷施一次，整个生长季节喷纸5-6次就可以有效防治葡萄白腐病菌等病害；CN200810207402.3:主要是研究如何加快荷叶离褶伞菌丝定殖的方法，包括配制栽培种培养基质、装袋、接种、培养、搔菌、催蕾与发育、采收步骤。但是查阅大量的公开资料都没有关于维持单个植物内生细菌在植物体内定殖数量的方法是采用每隔一段时间人工接种以通过保持内生细菌定殖数量的方式来有效防治辣椒疫霉病的方法。植物内生细菌要想控制植物病害，必须在植物体内保持一定的数量并且要能在植物整个生长周期都能定殖在植物体内才行。当前植物病害田间防治效果很不理想，大部分原因就是生防菌不能在植物体内始终保持有效防病定殖量。本专利获得的一株荧 光假单胞RP15，它能定殖在辣椒根部，并且通过重复接种，比如每15 20d接一次，它就能在辣椒根部一直保持防治辣椒疫病的有效定殖量，从而确保辣椒在整个生长周期都能避免辣椒疫霉病的危害。
发明内容
为了减少辣椒疫病对辣椒生产的影响，本发明提供了一株能防治辣椒疫病的荧光假单胞菌，以及用该菌株生产的菌剂。本发明所说的荧光假单胞菌，其代号为RP15，是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，它的保藏编号为CGMCC N0.7061。该菌株分离自辣椒根内，经反复人工接种测定在辣椒根部大量定殖，定殖的数量在接种5d后达到5.0X IO5Cfu.g—1以上，保持该数量时间是20d左右，在同一个辣椒植株生育期内每隔15 20d接种该菌株能始终保持5.0 X IO5Cfu.g—1以上的定殖数量。在温室内通过盆栽辣椒苗的方法测定荧光假单胞菌RP15在辣椒根部的定殖量达到5.0X IO5Cfu.g—1以上时大量接种辣椒疫霉病菌能100%的防治辣椒疫霉病菌的侵染。本发明公开了上述荧光假单胞菌RP15在防治辣椒疫霉病中的应用。具体的应用方法是将荧光假单胞菌RP15通过人工接种方法在辣椒根内定殖，定殖数量达到
5.0XlO5Cfu.g_1 以上。本发明还公开了一种防治辣椒疫霉病的方法，该方法是将上述的荧光假单胞菌RP15人工接种辣椒后保持5.0X IO5Cfu.g—1以上的定殖数量达到20d以上。在进行人工接种时，可以是在辣椒生长的任何时期，用棍在距辣椒苗3 8cm的距离扎一个深度5 IOcm的孔，孔内立即注入0.5 2ml的荧光假单胞菌RP15菌剂。上述接种方法中根据辣椒苗的生长时期和大小选择:小苗选择直径偏小的木棍和铁棍，扎孔距小苗偏近，扎孔深度要浅，接种量偏少；大苗或生长期长的辣椒植株选择直径偏大的木棍和铁棍，扎孔距苗偏远，扎孔深度要深，接种量偏大。上述方法中的荧光假单胞菌RP15菌剂，是采用下述方法制备:选用常规发酵方法繁殖菌体，去除发酵液，留下菌体用生理盐水悬浮制成的菌悬液，含菌量用血球计数版计数达到I X IO5 5.0 X IO5个^g-1SRPlS的菌剂。该菌剂在O 5°C保存，保存时间在3 6个月，使用前用血球计数版计数。本发明进一步公开了荧光假单胞菌RP15及其该菌制备的菌剂和利用重复接种技术在生物防治辣椒疫霉病上的应用。一个应用本 发明菌株防治辣椒疫霉病的具体操作如下:(I)荧光假单胞菌RP15菌剂的制备:选用常规发酵方法繁殖菌体，去除发酵液，留下菌体用生理盐水悬浮制成的菌悬液，含菌量用血球计数版计数达到IX IO5 5.0X IO5个.g—1为RP15的菌剂，该菌剂在O 5°C保存，保存时间在3 6个月，使用前用血球计数版计数。(2)荧光假单胞菌RP15菌剂接种辣椒的步骤和方法:辣椒生长的任何时期采用木棍或者铁棍(直径0.5-2.0cm)在距辣椒苗3-8cm的距离扎一个深度5-lOcm的孔，孔内立即注入0.5-2ml的荧光假单胞菌RP15的菌剂。小苗选择直径偏小的木棍和铁棍，扎孔距小苗偏近，扎孔深度要浅，接种量偏少；大苗或生长期长的辣椒植株选择直径偏大的木棍和铁棍，扎孔距苗偏远，扎孔深度要深，接种量偏大。(3)荧光假单胞菌RP15在辣椒根内定殖数量的检测:采用抗利福平标记法测定菌株RP15在辣椒根内的定殖力。在牛肉膏蛋白胨培养基(约50°C时)加入利福平，使利福平浓度10 μ g.mL—1，制成含利福平的平板。将RP15转入此培养基中培养，28°C培养2 4d，挑取单菌落，再接入同一浓度的培养基，继代I次后转入浓度为20 μ g.πιΓ1的利福平平板上培养。以类似的方法，逐步提高利福平浓度依次为40、60、80、100、120、150、200、250、300 μ g.mL—1，直至筛选出在含有300μ g.mL—1的利福平平板上能稳定生长、菌落形态及对辣椒根内定殖能力保持不变的菌株。将标记菌株接种于装有含300μ g.mL—1利福平的牛肉膏蛋白胨液体培养基三角瓶中，28°C、150r.mirT1振荡培养48h。把发酵液装入离心管中，离心收集菌体稀释成IO5AiL-1的菌悬液，将菌悬液采用(2)的方法接种盆栽苗，每株苗接种菌悬液lml，每盆4株苗。分别在接种5，10，15，20，25，30d后取辣椒根部进行表面消毒，采用稀释涂布法分别涂布于含300 u g.mL-1利福平的牛肉膏蛋白胨平板，每梯度3个重复，于28°C培养72h后分别计数单菌落，统计数量。接种后菌株RP15逐渐进入辣椒苗的根中，第5d在辣椒根部的定殖量达到5.0X IO5Cfu.g_\到第15d定殖量达到最大值8.0X IO5Cfu.g_S 25d下降到 5.0XlO5Cfu.g'30d 下降至Ij 3.0XlO5Cfu.g'(4)重复接种技术维持定殖数量的方法:将(3)标记的荧光假单胞菌RP15菌株制成IO5个.mL-1的菌悬液，接种辣椒苗。在第一次接种20d后，再对同一处理的辣椒苗采用同样方法接入相同浓度和相同体积菌悬液，第二次接种后20d采用相同方法进行第三次接种，分别在第一次接种后5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80d后，采用稀释涂布法测定荧光假单胞菌RP15在辣椒根部的定殖动态。结果表明，每20d接种辣椒苗一次，连续重复接种三次，得出RP15在三次接种后均能稳定定殖在辣椒盆栽苗根部，且在第二次和第三次接种后能重新完成一个新的定殖周期，并与第一次的定殖消长趋势相同都在接种后第15d定殖量达到最高，分别为:7.9 X IO5Cfu.g—1、9.0X IO5Cfu.g-1 和 9.9X 105cfu.g-1 ;第三次接种后的第25d时的定殖量5.6 X IO5Cfu.g—1。(5)辣椒疫霉病囷抱子悬液的制备:将辣椒疫霉囷种(来源于中国农业囷种保减中心ACCC36278)挖菌块接种到玉米粉培养基上，置28°C光照培养箱培养7d至辣椒疫霉长满平板，并产生大量的分生孢子囊，用无菌水洗下分生孢子囊，配制成每视野3 5个分生孢子囊的溶液，震荡后制成分生孢子悬浮液。
(6)接种荧光假单胞菌RP15后对辣椒疫霉病防治方法:采用(I)的方法制成菌悬液，含菌量用血球计数版计数达到IX IO5 5.0X IO5个.mr1，采用(2)的方法接种荧光假单胞菌RP15，接种第5d采用(4)的方法制备辣椒疫霉病菌孢子悬液。辣椒苗浇足清水后，将辣椒疫霉菌孢子悬液浇灌到辣椒根部，每株浇灌2 4ml，25-28°C培养，用大塑料袋罩住辣椒苗保湿。分别设生理盐水代替RP15菌剂接种后浇罐病原菌的对照和不接病原菌的空白对照。在浇灌辣椒疫霉病菌第IOd调查辣椒苗的发病情况，计算发病率和防治效果。发病率(%) =(发病株数/总株数)X100;防治效果(%) =[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]X 100。结果接种荧光假单胞菌RP15的处理防效都达到100%，而接生理盐水对照发病率在90%以上。同样，在接种荧光假单胞菌RP15第10d、第15d、第20d、第25d浇灌辣椒疫霉病菌孢子悬液的处理防效均都达到100%。在接种荧光假单胞菌RP15第30d浇灌辣椒疫霉病菌孢子悬液的处理防效下降能达到60% 80%的防效。由此证明荧光假单胞菌RP15在接种辣椒后有效防治辣椒疫霉病的时间是接种后第5d到25d之间。(7)重复接种技术的实施对辣椒疫霉病的防治:(4)中表明每隔20d接种一次荧光假单胞菌RP15的菌剂持续保持在辣椒根部的定殖数量是5.0X IO5Cfu.g'在自然条件下辣椒疫霉菌的侵染时期是不确定的，荧光假单胞菌RP15重复接种能始终在辣椒根部保持一定的数量。采用(4)的方法接种荧光假单胞菌RP15的辣椒苗在第一次接种后第10d、30d、50d采用(6)的方法浇灌辣椒疫霉病菌测定这些处理的辣椒苗防治疫霉病的效果均在
100% o(8)荧光假单胞菌RP15菌剂在田间防治辣椒疫霉病的使用方法:荧光假单胞菌RP15使用方法正确能有效保护辣椒全生育期内辣椒疫霉病菌的危害，生产上辣椒的栽培分为育苗和田间种植两个时期。育苗时期采用分苗时沾根的方法接种，因为辣椒分苗时从育苗盘中拔出的小苗须根均受到一定的伤害，这时把小苗的根部沾上荧光假单胞菌RP15的菌剂会立即完成接种的过程，接种后把小苗移栽到育苗盆中或者田间。过20d辣椒小苗完全缓苗或者生长良好，这时采用(2)的方法接种。每20d接种一次，RP15就可以一直定殖在辣椒根部，并且在辣椒整个生育期能维持有效的防治辣椒疫病的危害。
具体实施例方式实施例1: RP15菌株的获得从田间采集健康的辣椒植株，用自来水洗净表面并晾干，分别取植物的根、茎、叶进行表面消毒后研碎，稀释涂布牛肉膏蛋白胨培养基上，置28°C培养箱中培养3 7d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，纯化后保存。采用平板对峙培养法筛选拮抗辣椒疫霉菌的菌株。首先将辣椒疫霉菌在胡萝卜培养基上培养，待辣椒疫霉菌长满平板后用打孔器在平板边缘打取菌块，放在另一个无菌的胡萝卜平板中央，在距离菌块2.5cm处放置形同直径的内生细菌菌饼，每皿4个，每处理重复3次，置于25°C培养箱黑暗培养，每天观察，记录对辣椒疫霉菌有拮抗作用的菌株。从植物体内共分离出172株内生细菌，采用平板对峙培养法对这172株内生菌进行筛选，共筛选出6株对辣椒疫霉菌有拮抗作用的内生细菌。其中抑菌圈直径大于Icm的有两株，其中命名为RP15的菌株的抑菌圈直径最大为2.02cm。实施例2:RP15菌株的鉴定、保藏形态特征及生理 生化测定按常规方法进行。将筛选获得的生防菌株RP15在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上28 °C培养24h后进行染色观察，48h后观察菌落形态；生理生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版进行，综合以上各项指标进行初步鉴定。采用菌落PCR法提取生防菌株RP15的DNA和进行16S rDNA序列扩增。扩增采用细菌通用引物 27F (5 ' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，SEQ ID N0.1)和 1492R(5' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3' , SEQ ID N0.2)。扩增产物回收纯化后送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST，确定菌株的分类地位。菌株RP15的菌落圆形光滑状，边缘不整齐，湿润，易挑取，不透明，浅黄色，在LB液体培养基中呈混浊，不形成菌膜。对三个菌株进行形态特征和生理生化测定，结果如表1，从表I中我们得出该菌符合荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens )特性。RP15的16S rDNA部分序列长度为1.5kb左右，将序列检测后提交GenBank。在NCBI数据库上进行Blast比对，发现该菌的16SrDNA序列与荧光假单胞菌的16SrDNA较为相似，序列同源性达到99%。综合以上结果得出RP15为突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens )。表I植物内生细菌RP15的形态特征和生理生化特性
权利要求
1.一株突光假单胞菌{Pseudomonas fluorescens ) RP15,它的保藏编号为CGMCCN0.7061。
2.权利要求1所述的荧光假单胞菌RP15在防治辣椒疫霉病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将荧光假单胞菌RP15通过人工接种方法在辣椒根内定殖，定殖数量达到5.0X IO5Cfu.g—1以上。
4.一种防治辣椒疫霉病的方法，其特征在于将权利要求1所述的荧光假单胞菌RP15人工接种辣椒后保持5. 0X IO5Cfu.g—1以上的定殖数量达到20d以上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述接种辣椒的方法是在辣椒生长的任何时期，用棍在距辣椒苗3 8cm的距离扎一个深度5 IOcm的孔，孔内立即注入0.5 2ml的荧光假单胞菌RP15菌剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光假单胞菌RP15菌剂是通过下述方法制备:选用常规发酵方法繁殖菌体，去除发酵液，留下菌体用生理盐水悬浮制成的菌悬液，含菌量用血球计数版计数达到IX IO5 5.0X IO5个.g—1为RP15的菌剂。
全文摘要
本发明公开了一株荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)其代号为RP15，保藏编号为CGMCC No.7061。该菌株能通过人工接种方法在辣椒根内大量的定殖，定殖数量达到5.0×105cfu.g-1以上时能100%的防治辣椒疫霉病菌的侵染，每一次人工接种后保持5.0×105cfu.g-1以上的定殖数量达到20d以上，每隔20d接种一次能使辣椒植株根内持续保持该菌体数量。该菌株制成的菌剂可以在辣椒疫霉病发生的季节采用每隔15～20d接种的重复接种技术来防治辣椒疫霉病的发生。该菌株制成的菌剂和防治辣椒疫霉病的方法适用于由疫霉菌引起的辣椒疫霉病的生物防治。
文档编号A01G13/00GK103146609SQ201310075560
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者闫淑珍, 付思娅, 陈双林 申请人:南京师范大学