专利名称：千层金再生体系建立的方法
技术领域：
本发明所属的技术领域为生物技术领域，进一步，本发明涉及一种千层金再生体系的建立方法。
背景技术：
千层金(Melaleuca bracteata),桃金娘科白千层属常绿乔木。其主干直立,嫩枝红色，枝条密集且细长柔软，金黄或鹅黄色叶片密集分布于锥形树冠，树形十分优美，且分枝性能好，耐修剪，生长速度快，广泛用于庭院景观、小区绿化、道路美化等。千层金除极富观赏价值外，还有极高的经济价值，枝叶均为插花的上好材料，叶片芳香宜人，其芳香油是最珍贵的天然化妆品香料之一，同时也是一种优良的天然抗菌剂，广泛用于医药、化妆品、日用化工等行业。千层金是目前世界上最流行且视觉效果最好的彩叶芳香乔木新品种，其市场前景十分广阔。目前千层金多采用扦插或嫁接等传统无性繁殖的方法生产种苗，且国内外关于千层金的报道较少，迄今尚未见到关于建立千层金离体叶片再生体系及转基因技术相关研究报道。
发明内容
本发明提供了一种千层金再生体系建立的方法，为通过千层金离体叶片建立千层金高效遗传转化体系奠定基础，同时也为今后选育千层金优良品种提供技术参考。一种千层金再生体系建立的方法，包括下列步骤:(I)将外植体千层金无菌苗幼嫩叶片从叶柄处切下，接种到含有激素的MS愈伤组织诱导培养基中，培养12-15 天；(2)再在含有激素的MS愈伤组织继代培养基中培养25-30天；(3)将愈伤组织接种至含有激素的MS分化培养基上进行分化培养；(4)待不定芽长至2_3cm时，将其切下，接种至MS基础培养基里进行壮苗培养；(5)待不定芽长至4-5cm时，将其接种至含有激素的MS生根培养基上进行生根培养;(6)待不定牙根系长出后,将其炼苗移栽。所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05
0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05
0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.05 0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培养基中的激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲、0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.05 0.lmg/L的萘乙酸；所述生根培养基中的激素为0.1 1.0mg/L的吲哚丁酸。其中ILMS培养基的组成为:硝酸钾(KNO3) 1900mg,硝酸铵(NH4NO3) 1650mg,氯化钙(CaCl2.2H20)440mg,硫酸镁(MgSO4.7H20)370mg,磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg,硫酸锰(MnSO4.4H20) 22.3mg，硫酸锌(ZnSO4.7H20) 8.6mg，硼酸(H2BO3) 6.2mg，碘化钾(ΚΙ) 0.83mg，钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg,硫酸亚铁(FeSO4.7H20) 27.8mg,硫酸铜(CuSO4.5H20) 0.025mg,氯化钴(COCl2.6H20) 0.025mg,肌醇IOOmg,烟酸0.5mg,盐酸硫胺素(维BI) 0.1mg,盐酸卩比卩多素(维B6) 0.5mg,甘氨酸2mg, pH值5.80。优选:所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸；所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培养基中的激素为0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.2mg/L的萘乙酸；所述生根培养基中的激素为0.2mg/L的吲哚丁酸。所述外植体在进行愈伤组织诱导之前，划出横向或纵向深至表皮的伤口。所述不定芽的炼苗时间为3 5天，移栽所用基质为营养土。所述植物组织培养各个阶段，培养条件均为光照强度为20001χ，每日光照16小时，培养温度(26 ± 2) °C。本发明采用幼嫩叶片作为外植体，在合适的生长素及细胞分裂素浓度下，采用MS培养基培养，其伤口处皮层可分化形成芽原始体并直接再生不定芽并通过分生细胞器官直接发生途径进行不定芽诱导，诱导情况见“图1 ”，具有诱导率高，稳定性高，变异低，移栽成活率高的优点。本发明采用千层金无菌苗幼嫩叶片为外植体，间接诱导不定芽发生，完善了千层金不定芽诱导再生体系。通过上述研究，建立了高效的千层金离体叶片再生体系，为建立千层金高效遗传转化体系奠定基础，同时也为今后选育千层金优良品种提供技术参考。
图1.千层金愈伤组织诱导，“a图 ”为诱导10天左右的愈伤组织，“b图”为诱导30天左右的愈伤组织，图2.通过分生细胞器官直接发生途径对千层金愈伤组织进行不定芽诱导情况，“a图”为出现分化的愈伤组织，“b图”为分化出的不定芽，图3.千层金不定芽的壮芽及生根培养，“a图”为不定芽壮芽培养，“b图”为不定芽生根培养，图4.不定芽移栽。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。培养基及培养条件:愈伤组织诱导培养基中含有0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸，及30g/L的蔗糖，7g/L的琼脂；
继代培养基里含有0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸,及30g/L的鹿糖，7g/L的琼脂；分化培养基中含有0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.05mg/L的萘乙酸，及30g/L的蔗糖，7g/L的琼脂；生根培养基中含有0.2mg/L的吲哚丁酸，及30g/L的蔗糖，6g/L的琼脂。实验中培养基均为MS培养基。培养的各个阶段，培养条件均为光照强度为20001χ，每日光照16小时，培养温度(26±2)°C。其中ILMS培养基的组成为:硝酸钾(KNO3) 1900mg，硝酸铵(NH4NO3) 1650mg，氯化钙(CaCl2.2H20)440mg，硫酸镁(MgSO4.7H20) 370mg，磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg，硫酸锰(MnSO4.4H20) 22.3mg，硫酸锌(ZnSO4.7H20) 8.6mg，硼酸(H2BO3) 6.2mg，碘化钾(ΚΙ) 0.83mg，钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 0.25mg,乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37.25mg,硫酸亚铁(FeSO4.7H20) 27.8mg,硫酸铜(CuSO4.5H20) 0.025mg,氯化钴(COCl2.6H20) 0.025mg,肌醇IOOmg,烟酸0.5mg,盐酸硫胺素(维BI) 0.1mg,盐酸卩比卩多素(维B6) 0.5mg,甘氨酸2mg, pH值
5.80。I千层金再生体系的建立1.1外植体的获得:取千层金无菌苗，从叶柄处切下幼嫩叶片，横向或纵向划出深至表皮的伤口。1.2愈伤组织诱导:将128个外植体接种至含有0.0lmg/L的噻重氮苯基脲、
0.lmg/L的萘乙酸的MS培养基内，进行愈伤组织诱导。见图11.3愈伤组织继代培养:培养15天以后，将愈伤组织接种至含有0.0lmg/L的噻重氮苯基脲、0.lmg/L的萘乙酸的MS培养基中进行继代培养。继代培养15天后统计愈伤组织诱导情况，共有96个外植体诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率为75.0%，其中愈伤组织诱导率=愈伤组织个数/接种外植体数X 100%。1.4分化培养:将78个长势良好的愈伤组织接种至含有0.02mg/L的噻重氮苯基脲、0.05mg/L的萘乙酸的分化培养基中进行分化培养，40天后统计愈伤组织分化情况，共有45个愈伤组织分化出不定芽，分化率为57.7%，其中分化率=分化愈伤组织数/接种愈伤组织数X 100%。见图2。1.5不定芽壮芽及生根培养:将长至3cm左右的不定芽切下，共50个，接种至MS基础培养基上进行壮芽生长；待其长至5cm左右时接种至含有0.2mg/L的吲哚丁酸的生根培养基中进行生根培养，30天后统计生根情况，共有33个生根，生根率为66.0%，其中生根率=生根不定芽数/接种不定芽数X 100%。见图3。1.6不定芽炼苗及移栽:将33个长出根系的植株开盖炼苗3 5天后移栽，28天后统计成活率可达75.7%，其中成活率=成活植株数/移栽总数X 100%。见图4。
权利要求
1.一种千层金再生体系建立的方法，包括下列步骤: (1)将外植体千层金无菌苗幼嫩叶片从叶柄处切下，接种到含有激素的MS愈伤组织诱导培养基中，培养12-15天； (2)再在含有激素的MS愈伤组织继代培养基中培养25-30天； (3)将愈伤组织接种至含有激素的MS分化培养基上进行分化培养； (4)待不定芽长至2-3cm时，将其切下，接种至MS培养基里进行壮苗培养； (5)待不定芽长至4-5cm时，将其接种至含有激素的MS生根培养基上进行生根培养； (6)待不定牙根系长出后，将其炼苗移栽。
所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述分化培养基中的 激素为0.01 0.03mg/L的噻重氮苯基脲和0.05 0.lmg/L的萘乙酸，或者0.5 1.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和0.05 0.lmg/L的萘乙酸； 所述生根培养基中的激素为0.1 1.0mg/L的吲哚丁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中ILMS培养基中包含:硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg,氯化|丐440mg,硫酸镁370mg,磷酸二氢钾170mg,硫酸猛22.3mg,硫酸锌8.6mg,硼酸6.2mg,碘化钾0.83mg,钥酸钠0.25mg,乙二胺四乙酸二钠37.25mg,硫酸亚铁27.8mg,硫酸铜0.025mg,氯化钴0.025mg,肌醇IOOmg,烟酸0.5mg,盐酸硫胺素0.1mg,盐酸卩比卩多素0.5mg,甘氨酸 2mg, pH 值 5.80。
3.根据权利要求1所述的方法，所述愈伤组织诱导培养基中的激素为0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲和0.lmg/L的萘乙酸；所述愈伤组织继代培养基中的激素为0.0 lmg/L的噻重氮苯基脲和0.lmg/L的萘乙酸；所述分化培养基中的激素为0.02mg/L的噻重氮苯基脲和0.2mg/L的萘乙酸；所述生根培养基中的激素为0.2mg/L的吲哚丁酸。
4.根据权利要求1所述的方法，所述外植体在进行愈伤组织诱导之前，划出横向或纵向深至表皮的伤口。
5.根据权利要求1所述的方法，所述不定芽的炼苗时间为3 5天，移栽所用基质为营养土。
6.根据权利要求1所述的方法，所述培养的条件均为光照强度为20001x，每日光照16小时，培养温度24 — 28°C。
全文摘要
本发明涉及“千层金再生体系建立的方法”，属于生物技术领域。本发明采用幼嫩叶片作为外植体，在合适的生长素及细胞分裂素浓度下，采用MS培养基培养，其伤口处皮层可分化形原始体并直接再生不定芽，并经过壮苗，生根培养，最后炼苗，移栽，得到再生植株。本发明采用千层金无菌苗幼嫩叶片为外植体，间接诱导不定芽发生，完善了千层金不定芽诱导再生体系。通过上述研究，建立了高效的千层金离体叶片再生体系，为建立千层金高效遗传转化体系奠定基础，同时也为今后选育千层金优良品种提供技术参考。
文档编号A01H4/00GK103222426SQ20131016249
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者赵德刚, 兰丽 申请人:贵州大学