专利名称：甘蓝型油菜玻璃化再生苗的去玻璃化方法
技术领域：
本发明所述一种甘蓝型油菜玻璃化再生苗的去玻璃化方法，属于生物技术领域。应用本方法可以使甘蓝型油菜组织培养过程中产生的玻璃化再生苗去玻璃化，并再生成正常苗。
背景技术：
油菜属十字花科芸薹属植物，是世界上种植面积较大的四种油料作物之一，也是我国重要的油料作物之一。菜籽油用途广泛，可以用作食用油、生物柴油，也是油漆、软化齐U、表面活性剂等的加工原料；菜籽饼蛋白质含量高达40%，是优质的蛋白饲料来源。由于油菜的经济利用价值高，且与模式植物拟南芥同属，易于转化，因此是转基因研究与应用最活跃作物之一。近二十年间至少有50个基因转化到甘蓝型油菜Ara1S1Sica napus L中。国内外转基因油菜的研究涉及到多种性状，包括抗除草剂、抗虫、抗病、耐逆、雄性不育、及品质改良等。其中抗除草剂是商品化应用最广泛的的性状，抗除草剂油菜在美国、加拿大、澳大利亚均有大规模种植。随着科学技术的发展，相信未来会有更多的转基因油菜新品种在世界油菜生产区得到应用。转基因油菜的成功培育是基因工程技术在农业科研领域中运用的具体成果。而基因工程的应用受制于良好的植物转化再生体系。油菜遗传转化的效率总体而言并不高，主要与转化受体的基因型有关。有的受体易于培养再生，但是不易于被农杆菌侵染转化；反之，有的受体易于被农杆菌侵染转化，但是再生频率低。因此筛选易被农杆菌侵染并易通过组织培养再生成苗的受体，对于基因工程技术的应用显得非常重要。影响油菜再生的因素很多，主要有培养基种类、受体基因型、外植体种类等等。培养基的选 择主要集中在激素方面。不同的激素和激素组合对油菜外植体愈伤组织诱导和芽分化起决定性作用。文献中多报道6-BA与NAA的搭配，愈伤诱导率高且愈伤组织紧密易于不定芽的分化；KT和NAA组合的培养基诱导生成的愈伤一般较疏松，不易于芽的分化。激素组合的浓度对芽的分化有重要影响，一般而言，6-BA与NAA的摩尔浓度比10:I左右，而6-BA与NAA的最适摩尔浓度比视受体基因型的不同略有差异。可以通过试验确定合适的摩尔浓度比。而培养基中其它的成份对油菜不定芽诱导也有一定的影响。有报道培养基中适当浓度的AgN03有利于油菜不定芽的分化，可能与其抑制乙烯活性有关。糖类主要是作为碳源，为植物细胞提供养分的，也是调节培养基的渗透压的有效物质。油菜组织培养中多以蔗糖作为碳源。其它有机物质多为B族维生素如VB1、VB6、烟酸和渗透调节剂如肌醇等。油菜受体的基因型与再生频率密切相关。例如以子叶柄为外植体，相同培养条件下，不同基因型的油菜芽诱导分化的频率相差悬殊，芽再生频率的变化从0到97%。而不同的外植体如幼茎、叶片、子叶、下胚轴、原生质体、花药、小孢子等均可以诱导再生植株。而再生频率与油菜基因型、外植体生理状态及培养基组成(激素、无机盐、有机物以及抑制褐化的PVP和活性碳的使用与否)等因素有关。
利用子叶(柄)和下胚轴外植体进行不定芽诱导再生植株的培养过程中经常发生的问题是再生苗的玻璃化现象。所谓玻璃化苗是指再生的苗呈半透明状，叶片呈浅绿色或黄绿色，叶片肥厚，叶片往往畸形，卷曲或皱缩，叶片脆弱易碎。叶片表明缺少角质层和蜡质层或蜡质层发育不良。从解剖学上看，叶片无功能性气孔，由于保卫细胞的功能性失调不能关闭气孔，玻璃化的叶片不具有栅栏组织，只有海绵组织。由于玻璃化的植株吸收和光合作用功能不健全，因而一般不易再恢复成正常的再生苗。玻璃化苗的分化能力低下，难以继代培养繁殖，更难以移栽成活。玻璃化苗的产生与培养基和培养环境有关，尤其与激素浓度和培养温度有关。再生植株会因玻璃化而死亡。油菜组织培养再生过程中，再生苗的玻璃化现象较为普遍，与基因型、6-BA浓度和培养温度有关。过去文献报道的降低再生苗玻璃化的措施主要是降低6-BA浓度和增加培养固化剂(琼脂或植物凝胶)的浓度。这些措施并不能完全杜绝玻璃化苗的出现，也不能将玻璃化苗逆转成正常苗。而将玻璃化苗逆转为正常苗对于油菜组织培养再生具有重要的意义。可以提闻组织再生的成苗率，提闻工作效率。
发明内容
技术问题
本发明所述一种甘蓝型油菜玻璃化再生苗的去玻璃化方法,应用本技术可以使甘蓝型油菜组织培养过程中产生的玻璃化再生苗去玻璃化，并再生成正常苗。技术方案
O甘蓝型油菜玻璃化不定芽处理:待玻璃化芽分化至2-5叶时，将玻璃化芽或芽丛在超净工作台上，无菌条件下从培养皿(瓶)中取出，放入无任何培养基的无菌培养皿中，用保鲜膜封好培养皿的缝隙，置玻璃化芽或芽丛于光照培养箱中、设置温度5°C，开足光源，使其光强到达最大约100-150 μ mol/s/m2以上，光周期设置16小时光照，8小时暗，处理24-48小时，观察外植体状况，芽或芽丛的叶片有明显失水收缩；
2)处理后的不定芽生长:将经过I)处理后的不定芽于超净工作台上无菌条件下，取出并置入含芽生长培养基的培养瓶中继代培养；芽生长培养基成分:1/2 MS无机盐，B5维生素，3%蔗糖，1%琼脂，无激素的培养基中，ph5.8 ;培养条件:温度25 °C ;光照强度:40-50 μ mol/s/m2 ;光照周期:16h光照，8h黑暗；时间3-7天；原玻璃化芽或芽丛可转为正常芽或芽丛；
3)如果经步骤2)培养处理I周时间后的玻璃化苗没有逆转为正常苗，可再进行一次步骤2)处理，然后再继代培养3-7天，原玻璃化芽或芽丛即转为正常芽或芽丛。有益效果
本发明由于采用了无培养基、低温条件和高光强，所以我们称其为饥饿、低温、强光照处理。经过饥饿、低温、强光照处理的甘蓝型油菜玻璃化再生苗均可以去玻璃化，并在基本培养基上长成正常苗。经过此处理的玻璃化苗可以转为正常苗生长，这其中的内在机理是什么尚不清楚，但是我们发现经过此处理的玻璃化苗均可以转为正常苗生长。这大大提高了油菜组培苗的再生频率。四
图1，玻璃化芽苗图2，玻璃化芽苗经过饥饿、低温、高光处理24小时后。图3，玻璃化芽丛
图4，玻璃化芽丛经过饥饿、低温、高光处理24小时后。五具体实施例方式 I)无菌苗培养:取甘蓝型油菜品种Westar的种子2g于50ml的无菌带盖的离心管中，首先用70%的乙醇液快速清洗I次后，加30ml “84”消毒震荡15min，其间每隔5min更换I次消毒液，共更换 3次；然后在超净工作台上用无菌水清洗种子5次，每次30ml无菌水。灭菌处理后的种子播种在ph5.8，1/2MS无机盐，1%蔗糖，1%琼脂培养基上，于25°C，16h光照，8h黑暗条件下培养4-5天。2)外植物体切分:超净工作台上无菌条件下切分外植体，本实验取带柄子叶和下胚轴切段作为培养的外植体。带柄子叶，子叶保持完整无损伤，留叶柄长度1.5-2mm左右；下胚轴切断长度控制在0.5-1.0mm。3)愈伤组织诱导:切分的外植体分别植入愈伤诱导培养基(MS无机盐、B5有机物、3%蔗糖、含生长素2，4-D lmg/L、1%琼脂、pH5.8。蒸气压力锅中121°C灭菌20min)中。下胚轴外植体平放，子叶柄外植体插入培养基中。于25°C，16h光照，8h黑暗，光强40-50 μ mol/s/m2条件下培养2天。4)不定芽诱导:芽诱导培养基成分如下:MS无机盐、B5有机物、3%鹿糖、5mg/LAgNO3 >40mg/L AdS04、lmg/L MES、200mg/L PVP (40000), 4 μ M 6_ΒΑ、0.4μΜ NAA，1% 琼月旨、pH5.8。蒸气压力锅中121°C灭菌20min。培养基置于15cm的玻璃培养皿中。经3)培养处理的外植体转入芽诱导培养基中进行芽诱导培养。培养条件:于25°C，16h光照，8h黑暗，光强40-50 μ mol/s/m2条件下培养3-6周。其间每隔7天更换I次新鲜培养基。直到不定芽出现。5)经过步骤4)培养的外植体会分化出不定芽，其中部分不定芽是玻璃化状，后期难以再生正常植株，对此类玻璃化的不定芽，可以采取特殊处理，逆转玻璃化成为正常苗。6)玻璃化不定芽处理:待玻璃化芽分化至2-5叶时，将玻璃化芽或芽丛在超净工作台上，无菌条件下从培养皿中取出，放入无任何培养基的无菌培养皿中，用保鲜膜封好培养皿的缝隙，置玻璃化芽或芽丛于光照培养箱中、设置温度5°C，开足光源，使其光强到达最大约100-150 μ mol/s/m2以上，光周期设置16小时光照，8小时暗，处理24-48小时。之后观察外植体状况，可见芽或芽丛的叶片有明显失水收缩。可结束处理。7)处理后的不定芽生长:将经过6)处理后的不定芽于超净工作台上无菌条件下，取出并置入含芽生长培养基的250ml培养瓶中继代培养。芽生长培养基成分:1/2 MS无机盐，B5维生素，3%蔗糖，1%琼脂，无激素的培养基中，ph5.8。并于25°C，16h光照，8h黑暗，光照强度40-50 μ mol/s/m2条件下继代培养。每隔7天更换I次新鲜培养基。约I周时间后原玻璃化芽或芽丛即可转为正常芽或芽丛。如果经6)处理过的玻璃化苗经过7)继代培养没有逆转为正常苗，可以再重复6)处理I次。8)生根培养:转为正常的芽或芽丛可以继续在芽生长的培养基上继代培养，对于芽丛，可以无菌条件下，切分为单个芽继代培养，直至长出根；也可以转移到生根培养基中继代培养诱导生根。生根培养基成分:1/2MS无机盐，1%蔗糖，2mg/L IBA, 1%琼脂，ph5.8。培养条件:温度25°C，光照周期:16h光照，8h黑暗，光照强度40-50 μ mol/s/m2。
9)组培苗入土盆栽:移栽入土之前，将培养瓶打开盖练苗3-4天后，将生根的芽苗从培养瓶中取出，自来水洗净沾附于根部的琼脂后，栽于装满基质的塑料盆中。弱光下生长至新叶出现，其间适当补浇1/2MS无机盐溶液，为组培苗提供营养。成活后可以置自然光下生长。本发明经过饥饿、低温、强光照处理的玻璃化再生苗均可以去玻璃化，并在基本培养基上长成正 常苗。
权利要求
1.I)甘蓝型油菜玻璃化不定芽处理待甘蓝型油菜玻璃化不定芽分化至2-5片叶时，将玻璃化芽或芽丛在超净工作台上，无菌条件下从培养皿(瓶)中取出，放入无任何培养基的无菌培养皿中，用保鲜膜封好培养皿的缝隙，置玻璃化芽或芽丛于光照培养箱中、设置温度5°C，光强达到100-150 μ mol/s/m2以上，光周期设置为16小时光照、8小时暗，处理24-48小时； 2)处理后的不定芽生长将经过I)处理后的不定芽或芽丛于超净工作台上无菌条件下，取出并置入含芽生长培养基的培养瓶中继代培养；芽生长培养基成分1/2 MS无机盐，B5维生素,3%鹿糖，1%琼脂，无激素，ph5. 8 ;培养条件25°C,光照强度40-50 μ mol/s/m2，光照周期16h光照，8h黑暗；时间3-7天；原玻璃化芽或芽丛可转为正常芽或芽丛； 3)如果经步骤2)培养处理I周时间后的玻璃化苗没有逆转为正常苗，再进行一次步骤2)处理，然后继代培养3-7天,原玻璃化芽或芽丛即转为正常芽或芽丛。
全文摘要
本发明所述一种甘蓝型油菜玻璃化再生苗的去玻璃化方法，属于生物技术领域。将组织培养过程中产生的玻璃化再生苗在超净工作台上通过无菌操作切分出来，并转移至无任何培养基的无菌培养瓶中，封口，置含有玻璃化苗的培养瓶于光照培养箱中进行饥饿(无培养基)、低温(5℃)、强光照(100-150μmol/s/m2)处理，然后将处理过的玻璃化苗转移至基本培养基中继代培养，培养条件光照强度50μmol/s/m2，光照周期16小时光照，8小时暗，时间3-7天。应用本技术可以使甘蓝型油菜组织培养过程中产生的玻璃化再生苗去玻璃化，经继代培养再生成正常苗。
文档编号A01H4/00GK103250641SQ201310172910
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者陈松, 彭琦, 周晓婴, 戚存扣, 张洁夫, 浦惠明, 胡茂龙, 龙卫华, 高建芹, 付三雄, 陈锋, 张维 申请人:江苏省农业科学院