专利名称：畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵多种植物饲料蛋白的生产方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种属于美国FDA公布的42种可直接喂饲的益生菌种。益生菌是一类有益于人体健康的活性微生物食品原料，目前常用的益生菌有嗜酸乳杆菌和双歧杆菌两大类，与干酪乳杆菌一起被称为"健康三益菌"。嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的焦点。自1908年Metchnikoff发现乳杆菌能够抑制肠道中的有害菌后，各国学者陆续发现几乎乳酸菌的每个属种的每个种，甚至每一株那能产生乳酸菌素。这些乳酸菌素成为天然肽类防腐剂的一大来源。干酪乳杆菌能够抑制和杀死食品中的许多腐败菌及致病菌，并且不影响食物性状，甚至能够改善食品特性，因此将其作为发酵剂添加到食品中能使产品更加优质，且对食品储藏过程中的防腐保鲜也起到积极作用。本研究发现，干酪乳杆菌干酪亚种ATCC334基因组含有2个串联抗菌肽基因簇(Lac705beta和Lac705alpha)和I个单独基因(Lactobacillus curvatus plasmid pRC18),嗜酸乳杆菌 CGMCCl.03342 含有I个抗菌肽基因(acd A)，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑制作用，能显著延长鲜奶的保质期。猪、鸡等畜禽易发生消化道疾病，如断奶仔猪腹泻、传染性胃肠炎、鸡肠炎、沙门氏菌病等，严重影响生产性能，甚至造成死亡。目前，抗生素治疗越来越受到限制，发展绿色天然抗菌活性物质己成为预防和治疗猪、鸡等畜禽消化道疾病的趋势。乳源乳酸菌抗菌肽具有杀灭胃肠道病原菌，平衡胃肠道菌群，促进消化吸收等功效。目前，国内现有抗菌肽产品在畜牧业应用越来越广，但现有产品还存在发酵菌种不明确，发酵工艺不稳定等技术问题。筛选有效的产抗菌肽菌种，·对产抗菌肽的微生物代谢进行调控，建立适合的发酵工艺，是抗菌肽生产中需解决的重要技术问题。嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种具有较强的产酸、产香、产粘和拮抗致病菌等能力，通过优化嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种增殖和发酵效果以及低温干燥，可以去除柏类蛋白中的脲酶、胰蛋白酶抑制因子、植酸、酚类等抗营养因子，提高抗菌肽活性和限制性必需氨基酸含量，降低蛋白质的分子质量，改善适口性并提高消化吸收效率。目前嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种尚很少用于饲料抗菌保健产品生产，其发酵产品对于畜禽消化道疾病防治(制)具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明目的是为了解决现有畜禽用抗菌肽添加剂生产菌种不明确和抗菌肽活性偏低的问题，而提供畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法。本发明畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法按下列步骤实现:一、将冻存的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种用MRS培养基活化，然后按体积百分含量1% 5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中，在35 40° C下发酵35 37h,得到嗜酸乳杆菌增殖培养液,按体积百分含量1% 5%的接种量将干酪乳杆菌干酪亚种接种于增殖培养基B中，在35 40° C下发酵35 37h，得到干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液；其中每升增殖培养基A由25 30g蔗糖、35 40g牛肉膏、5 6gNaCl、10 15gTween_80和余量的蒸懼水制成，pH为5.0;每升增殖培养基B由9 IOg鹿糖、25 30g大豆蛋白胨、6 7gNaCl、9 10gTween-80和余量的蒸懼水制成,pH为6.0;二、将步骤一得到的嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10% 20%的接种量接种到种子培养基中，在35 40° C下发酵35 37h，得到嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液，其中每升种子培养基由200 250g干物质，15 20g尿素，35 40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质曲质量比为2.0 3.0:1的豆柏和玉米蛋白粉组成；三、分别将步骤二得到的嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量5% 20%的接种量接种到发酵培养基中，花35 40° C下发酵45 50h，得到嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物，其中每升发酵培养基由450 500g的混合粉木和蒸馏水制成，混合粉末由质量比为13:3:3:4的豆柏粉、棉柏粉、菜柏粉和玉米粉组成；四、将嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物分别在30 40° C下干燥至含水量12% 15%，然后粉碎至35 45目，按质量比1:1将发酵产物混合，得到畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂。本发明畜禽用乳源乳酸菌抗菌肤添加剂以柏类蛋白和玉米粉为原料，通过嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种分别进行生物发酵，添加剂生产菌种明确，显著提高抗菌肽活性和限制性必需氨基酸含量，降低了柏类蛋白中的脲酶、胰蛋白酶抑制因子、植酸、酚类等抗营养因子含量，并提高小分 子质量可溶性蛋白含量。将本发明得到的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂按0.1 Ig/猪鸡公斤体重/天的含量与饲料混合后进行喂饲，起到防治畜禽消化道疾病，提高畜禽生产性能和产品品质。向4° C原奶中加入抗菌肽添加剂24h后，原奶中菌体数逐渐下降，说明抗菌肽添加剂在原奶中发挥抑菌作用，使得原奶中存在的细菌停止繁殖，甚至死亡。本发明主要应用于畜禽消化道疾病的防治。
图1是实施例一得到的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂对4° C原奶细菌总数的抑制效果，■表示原奶空白对照， 表示干酪乳杆菌干酪亚种对4° C原奶细菌总数的抑制，▲表示嗜酸乳杆菌菌种对4° C原奶细菌总数的抑制；图2是实施例一得到的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂对25° C原奶细菌总数的抑制效果，■表示原奶空白对照， 表示干酪乳杆菌干酪亚种对25。C原奶细菌总数的抑制，▲表示嗜酸乳杆菌菌种对25。C原奶细菌总数的抑制。
具体实施例方式具体实施方式
一:本实施方式畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法按下列步骤实现:一、将冻存的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种用MRS培养基活化，然后按体积百分含量1% 5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中，在35 40° C下发酵35 37h,得到嗜酸乳杆菌增殖培养液,按体积百分含量1% 5%的接种量将干酪乳杆菌干酪亚种接种于增殖培养基B中，花35 40° C下发酵35 37h，得到干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液；其中每升增殖培养基A由25 30g蔗糖、35 40g牛肉膏、5 6gNaCl、10 15gTween_80和余量的蒸懼水制成，pH为5.0;每升增殖培养基B由9 IOg鹿糖、25 30g大豆蛋白胨、6 7gNaCl、9 10gTween-80和余量的蒸懼水制成,pH为6.0;二、将步骤一得到的嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10% 20%的接种量接种到种子培养基中，在35 40° C下发酵35 37h，得到嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液，其中每升种于培养基由200 250g干物质，15 20g尿素，35 40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质由质量比为2.8 3.0:1的豆柏和玉米蛋白粉组成；三、分别将步骤二得到的嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量5% 20%的接种量接种到发酵培养基中，在35 40° C下发酵45 50h，得到嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物，其中每升发酵培养基由450 500g的混合粉末和蒸馏水制成，混合粉末由质量比为13:3:3:4的豆柏粉、棉柏粉、菜柏粉和玉米粉组成；四、将嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物分别在30 40 ° C下干燥至含水量12% 15%，然后粉碎至35 45目，按质量比1:1将发酵产物混合，得到畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂。本实施方式嗜酸乳杆菌菌种(Lacrobacillusacidophilus)NCFM,保藏编号为CGMCC1.03342;干酿乳杆 菌干酿亚种(Lactobacillus casei subs, casei),保藏编号为ATCC334。所用的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种可通过购买得到。本实施方式以柏类蛋白和玉米粉等为原料，通过嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌干酪亚种分别迸行生物发酵，显著提高抗菌肽活性和限制性必需氨基酸含量，显著降低柏类蛋白中的脲酶、胰蛋白酶抑制因子、植酸、酚类等抗营养因子含量，并提高小分子质量可溶性蛋白含量。
具体实施方式
二:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一按体积百分含量5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三:本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一每升增殖培养基A由30g鹿糖、40g牛肉膏、5gNaCl、15gTween-80和余量的蒸懼水制成，pH为5.0。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四:本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一每升增殖培养基B由IOg蔗糖、30g大豆蛋白胨、7gNaCl、10gTween-80和余量的蒸馏水制成，pH为6.0。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五:本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤二嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10%的接种量接种到种子培养基中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六:本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤二每升种子培养基由200g干物质，20g尿素，40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质由质量比为3.0:1的豆柏和玉米蛋白粉组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七:本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二豆柏和玉米蛋白粉的粒度为40目。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八:本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤三嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量10%的接种量接种到发酵培养基中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至七之一相同。实施例一:本实施例畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法按下列步骤实现: 一、将冻存的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种用MRS培养基活化，然后按体积百分含量5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中，在37° C下发酵36h，得到嗜酸乳杆菌增殖培养液，按体积百分含量5%的接种量将干酪乳杆菌干酪亚种接种于增殖培养基B中，在37° C下发酵36h，得到干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液；其中每升增殖培养基A由30g鹿糖、40g牛肉膏、5gNaCl、15g Tween-80和余量的蒸懼水制成,pH为5.0;每升增殖培养基B由IOg鹿糖、30g大豆蛋白胨、7gNaCl、10g Tween-80和余量的蒸懼水制成，pH 为 6.0;二、将步骤一得到的嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10%的接种量接种到种子培养基中，在37° C下发酵36h，得到嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液，其中每升种子培养基由200g干物质，20g尿素，40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质由质量比为3.0:1的豆柏和玉米蛋白粉组成；三、分别将步骤二得到的嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量10%的接种量接种到发酵培养基中，在37° C下发酵48h，得到嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物，其中每升发酵培养基由500g的混合粉末和蒸馏水制成，混合粉末由质量比为13:3:3:4的豆柏粉、棉柏粉、菜柏粉和玉米粉组成；四、将嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物分别在30° C下干燥至含水量14%，然后粉碎至40目，按质量比1:1将发酵产物混合，得到畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂。本实施例得到的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂对4° C原奶细菌总数的抑制效果如图1所示,对25° C原奶细菌总数的抑制效果如图2所示。通过图1可知添加畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的实验组较对照组细菌数增加缓慢，在畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂加入后O 24h，原奶中菌体数逐渐升高，说明原奶中细菌进行大量繁殖；加入抗菌肽24h后，原奶中菌体数逐渐下降，说明抗菌肽在原奶中发挥抑菌作用，使得原奶中存在的细菌停止繁殖，甚至死亡，当加入72h后干酪乳杆菌产的抗菌肌控制原奶菌数在15X104cfu/ml以下，嗜酸乳杆菌产的抗菌肽控制原奶菌数在30X 104cfu/ml以下，而对照组在36h之后细菌总数超标，并进入生长平台期，显示出良好的抗菌肽活性。通过图2可知在25 ° C的条件下，空白组原奶菌数增长极为迅速。添加抗菌肽组较对照组细菌数增加相对缓慢，并且在24h之后细菌数开始下降，产生了对细菌的抑杀作用，可见本实施例畜禽用乳源乳酸菌 抗菌肽添加剂在25。C下对牛奶保鲜也可起明显作用。
权利要求
1.畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法按下列步骤实现 一、将冻存的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种用MRS培养基活化，然后按体积百分含量1% 5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中，在35 40°C下发酵35 37h，得到嗜酸乳杆菌增殖培养液，按体积百分含量1% 5%的接种量将干酪乳杆菌干酪亚种接种于增殖培养基B中，在35 40°C下发酵35 37h，得到干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液；其中每升增殖培养基A由25 30g蔗糖、35 40g牛肉膏、5 6g NaCl、10 15g Tween-80和余量的蒸懼水制成，pH为5. O ;每升增殖培养基B由9 IOg鹿糖、25 30g大豆蛋白胨、6 7g NaCl>9 IOg Tween-80和余量的蒸懼水制成，pH为6. O ; 二、将步骤一得到的嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10% 20%的接种量接种到种子培养基中，在35 40°C下发酵35 37h，得到嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液，其中每升种子培养基由200 250g干物质，15 20g尿素，35 40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质由质量比为2. 8 3. O: I的豆柏和玉米蛋白粉组成； 三、分别将步骤二得到的嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量5% 20%的接种量接种到发酵培养基中，在35 40°C下发酵45 50h，得到嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物，其中每升发酵培养基由450 500g的混合粉末和蒸馏水制成，混合粉末由质量比为13 3 3 4的豆柏粉、棉柏粉、菜柏粉和玉米粉组成； 四、将嗜酸乳杆菌发酵产物和干酪乳杆菌干酪亚种发酵产物分别在30 40°C下干燥至含水量12% 15%，然后粉碎至35 45目，按质量比I :1将发酵产物混合，得到畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂。
2.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤一按体积百分含量5%的接种量将嗜酸乳杆菌菌种接种于增殖培养基A中。
3.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤一每升增殖培养基A由30g鹿糖、40g牛肉膏、5g NaCl、15g Tween-80和余量的蒸懼水制成，pH 为 5. O。
4.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤一每升增殖培养基B由IOg鹿糖、30g大豆蛋白胨、7g NaCUlOg Tween-80和余量的蒸懼水制成，pH为6.0。
5.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤二嗜酸乳杆菌增殖培养液和干酪乳杆菌干酪亚种增殖培养液分别按体积百分含量10%的接种量接种到种子培养基中。
6.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤二每升种子培养基由200g干物质，20g尿素，40g金黄色葡萄球菌热灭活菌液和余量的蒸馏水制成，干物质由质量比为3. 0:1的豆柏和玉米蛋白粉组成。
7.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤二豆柏和玉米蛋白粉的粒度为40目。
8.根据权利要求I所述的畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，其特征在于步骤三嗜酸乳杆菌种子培养液和干酪乳杆菌干酪亚种种子培养液按体积百分含量10%的接种量接 种到发酵培养基中。
全文摘要
畜禽用乳源乳酸菌抗菌肽添加剂的生产方法，它涉及一种发酵多种植物饲料蛋白的生产方法。它要解决现有畜禽用抗菌肽添加剂生产菌种不明确和抗菌肽活性偏低的问题。生产方法一、冻存的嗜酸乳杆菌菌种和干酪乳杆菌干酪亚种用MRS培养基活化，然后分别接种于增殖培养基中，得到增殖培养液；二、增殖培养液接种到种子培养基中，在35～40℃下发酵得到种子培养液；三、种子培养液再接种到发酵培养基中发酵得到发酵产物；四、发酵产物干燥脱水，粉碎后混合得到乳酸菌抗菌肽添加剂。本发明得到的抗菌肽添加剂菌种明确，抗菌肽活性较高。主要应用于畜禽消化道疾病的防治。
文档编号A23K1/00GK103250867SQ20131017228
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月10日 优先权日2013年5月10日
发明者高学军, 于微, 李庆章, 刘营, 霍楠, 仇友文, 袁肖寒, 张明辉, 郝敬友 申请人:东北农业大学