专利名称：一种杂合抗菌肽LFB_Mel及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种杂合抗菌肽基因转化大肠杆菌及其制备方法和应用。
背景技术：
抗生素的广泛使用以及抗菌素的滥用导致病菌对抗菌素产生耐药性，因此，寻找和开发新型抗菌素是一个热点课题。阳离子抗菌肽存在于多种生物体中，在宿主天然免疫中具有抗格革兰氏阳性菌和阴性菌、真菌和原虫等广谱作用。这类抗菌多肽含有较多的碱性氨基酸(在生理条件下带有正电荷)和较多的疏水性氨基酸，由于独特的抗菌机理，细菌不易对其产生耐药性，很有希望作为有临床使用价值的抗菌素。目前已有近10个阳离子抗菌肽类似物进入临床或临床前的试验阶段。阳离子抗菌肽的抗菌机理为肽的阳离子部分与细菌细胞膜(磷脂膜)的阴离子发生静电作用，由疏水氨基酸形成的疏水部位与细菌细胞膜的脂链产生疏水作用，从而起到抑菌作用。大部分阳离子抗菌肽除具有抗菌活性外，还具有溶血副作用，目前该领域的研究热点或待解决的问题主要有:抗菌机理的研究；高抗菌活性、低溶血活性的抗菌肽的设计合成，发现的阳离子抗菌肽或其合成类似物的抗菌活性比传统抗菌素的抗菌活性低，因此用量较大；合成链长尽量短的抗菌肽，可以减小肽的抗原性和降低肽的合成成本。蜂毒肽是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由20个氨基酸组成，一级结构为:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2,蜂毒肽能够形成两亲性的α -螺旋结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端(KRKR)，是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。蜂毒肽对钙调素具有很高的亲和作用，根据我们提出的钙调素可结合多肽结合部位的模型，预测并通过实验证明，蜂毒肽与钙调素的结合部位为12-26片段，并发现此片段仍保留一定的抗菌活性，但溶血活性消失。 牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin,简写为Lfcin B)是经胃蛋白酶从牛乳铁蛋白(bLF)N-端(17 41)水解的25个氨基酸残基，分子量约为3.1kd0 Lfcin是bLF的抗菌活性中心，对bLF抗菌活性起重要的作用(Kanget al, 1996)。而Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳铁蛋白400倍，能在胃肠道中发挥更重要的作用。在水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性的特征，能调节免疫作用，具有广谱抗菌作用，不干扰肠道有益菌等特性。其对许多G+和G_均有抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不作用于双歧杆菌等对人体有益细菌、同时还能刺激细胞的生长、参与免疫调节。由于其特殊的功能作用，作为饲料添加剂以食品防腐剂的开发研究，已经受到国内外研究机构和制造商的重视，成为研究热点。根据抗菌肽牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)与富含甘氨酸的蜂毒肽(Melittin)的核心功能序列，将Lfcin B (1-25)和Magainin (12-26) 二者连接起来,设计一种新型杂合抗菌肽LFB-Mel，该抗菌肽分子N端形成亲水脂的两个反向β折叠结构，中间形成双亲性的α螺旋结构，C端的连续四个碱性氨基酸使得抗菌肽分子带有正电荷，能够与带负电荷的细胞膜结合，杂合抗菌肽摒弃了蜂毒肽的溶血活性，其抗菌活性和稳定性均优于单一抗菌肽分子。琼脂空穴扩散法测得杂合抗菌肽LFB-Mel对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌四种细菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibition concentration,MIC)分别为1、2、2和3μ8.ιΛ-1，在抑菌浓度范围内未表现出溶血活性。获得了一种具有较高抗菌活性且安全无毒的新型抗菌肽，为研究开发理想的新型抗菌肽分子提供了新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的杂合抗菌肽LFB-Mel和编码该蛋白的基因序列。本发明的另一个目的在于提供该抗菌肽制品的生产方法。本发明的进一步目的在于提供该抗菌肽的抗菌活性检测。抗菌肽由于自身的优良特性显示出在食品储存、饲料安全和医药产业中广泛的应用前景。抗菌肽一般不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全产品。在动物消化道中具有良好稳定性，同时具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌甚至能够杀真菌、原虫且不产生耐药性菌株等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。此外，抗菌肽还具有良好的热稳定性，特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，因此不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。抗菌肽做为新一代的绿色饲料添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效地解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。
图1是PCR分段引物互补合成法合成杂合抗菌肽基因LFB-Mel的流程图。图2是电泳检测PCR互补合成的合成杂合抗菌肽基因图。图3是质粒载体pET_32a的物理图谱。图4是pET32a_Lfcin B Mel重组质粒载体的特异引物PCR鉴定，图中:M为DNAMarker DL2000 ;1和2为鉴定的转化子扩增产物。图5是重组转化子的通用引物PCR鉴定，M为DNA Marker DL2000 ;1和2为鉴定
的转化子。图6是SDS-PAGE检测杂合抗菌肽的诱导表达，I为Protein Marker，2为空载体对照，3为目的基因诱导表达的产物。图7是融合蛋白pre-LFB Mel的Ni2+Chelating Sepharose亲和层析分步洗脱图，I为Ni2+亲和层吸住的穿过峰，2为IOOmM imidazole洗脱的样品，3为250mMimidazole洗脱的样品。图8是杂合抗菌肽的SP强阳离子柱亲和层析分离纯化曲线图，SP阳离子交换柱梯度
NaC洗脱得到的三个蛋白峰。图9是Tris/Tricine SDS-PAGE检测分离纯化得到的杂合抗菌肽，其分子量为
4.9KDa,I为蛋白质分子量Marker, 2为穿过峰,3为第一个蛋白峰,4为第二个蛋白峰,5为
第三个蛋白峰。
图10是杂合抗菌肽LFB-Mel对金黄色葡萄球菌的抗菌实验结果，图中:1为阳性对照Amp, 500ug/ml ；2为阴性对照，溶解抗菌肽的缓冲溶液；3为lmg/ml的杂合抗菌肽；4为500ug/ml的杂合抗菌肽。
具体实施例方式实施例1杂合抗菌肽基因LFB-Mel的重组表达载体的构建和诱导表达1.抗菌肽基因LFB-Mel的合成:对抗菌肽基因LFB-Mel进行优化设计，分别合成Primerl、Primer2和Primer3三段引物，采用设计互补引物进行分段互补PCR合成与扩增的方法，直接由PCR合成基因LFB-Mel。合成抗菌肽基因LFB-Mel流程图如图1所示。合成后的引物用ddH20稀释成ΙΟμπιοΙ/L溶液，-20°C保存。引物序列如下(阴影部分为NcoI酶切位点，下划线部分为XhoI酶切位点):杂合抗菌肽LFB-Me I基因Primerl:CATG CCATGGTTT AAGTGT AGA AGATGG CAATGGAGA ATG AAGAAGTTGGGT GCTCCAPrimer2:MG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GGTTTG CCA GCTTTG APrimer3:CCGCTCGAG_TCATTGTTGTCTCTTTCTCTTGATCC
AAGAAATCAAAGCTGG单基因的分段互补PCR合成第I阶段PCR反应(St印I):PCR反应体系
权利要求
1.一种杂合抗菌肽LFB_Mel，其特征是一种杂合抗菌肽基因Lfcin B_Mel转化E.coliRosetta(DE3)而制得的工程菌。
2.根据权利要求1所述的杂合抗菌肽LFB_Mel，其特征在于所述的载体是pET_32a等原核表达载体。
3.根据权利要求1所述的杂合抗菌肽LFB_Mel，其特征在于所述的基因是杂合抗菌肽基因 Lfcin B_Mel，其核苷酸序列如下:TTT AAGTGTAGA AGA TGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGGTTTGCCA GCT TTG ATTTCT TGG ATC AAG AGA AAG AGACAACAA。
4.根据权利要求2所述基因编码蛋白LFB_Mel，其特征在于，其氨基酸序列为:FKCRRWQffRMKKLGAPSITCVRRAFGLPALISffIKRKRQQ。
5.根据权利要求1所述的抗菌肽LFB_Mel制品，其特征在于，制备方法包括如下步骤: (1)将抗菌肽基因LfcinB_Mel经PCR引物分段互补合成法合成基因序列； (2)将抗菌肽基因LfcinB_Mel克隆到表达载体pET_32a，得到重组表达载体pET32a-Lfcin B_Mel ；(3)将重组表达载体pET32a_LfcinB_Mel转化表达宿主菌Ε.coli Rosetta(DE3)； (4)将工程菌大量培养，添加IPTG至终浓度为0.5mM, 28°C诱导表达10小时，分离纯化融合蛋白； (5)将融合蛋白经肠激酶 酶切后，分离纯化得杂合抗菌肽LFB_Mel，检测其抗菌活性和MIC 值。
6.根据权利要求5所述的抗菌肽LFB_Mel制品，其特征在于所叙述的抗菌肽的抗菌活性和抗菌谱。
全文摘要
本发明涉及一种杂合抗菌肽LFB_Mel及其制备方法，所述抗菌肽和编码该蛋白的基因Lfcin B_Mel，其DNA序列如序列表中1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中2所示，本发明采用PCR引物分段互补合成法合成杂合抗菌肽基因Lfcin B_Mel，将其DNA序列转化于大肠杆菌中，形成抗菌肽基因工程菌，将工程菌进行大量诱导表达和分离纯化，获得杂合抗菌肽。本发明的有益效果为该杂合抗菌肽对Gram+菌、Gram-菌及真菌等均有明显的抑制作用，该杂合抗菌肽显示出了作为畜禽饲料添加剂应用于畜禽养殖业的良好应用前景。
文档编号C12N15/63GK103204938SQ201210149898
公开日2013年7月17日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者李本涛, 李帅伟 申请人:广州格拉姆生物科技有限公司