一种创建甘蓝型油菜突变体的方法
【专利摘要】本发明是一种创建甘蓝型油菜突变体的方法，包括如下步骤：有性杂交、幼胚抢救、快繁继代、染色体加倍和变异筛选。本发明的方法与物理辐射诱变、化学诱变及航空诱变育种方法相比，该技术属于环境友好型，对实验操作人员也不会造成身体损伤，该技术准入门槛低，普通的实验室都能够完成，成本低廉。
【专利说明】一种创建甘蓝型油菜突变体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物育种【技术领域】，具体是指一种创建甘蓝型油菜突变体的方法。
【背景技术】
[0002]甘蓝型油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是十字花科植物遗传研究的典型材料。诱变可以产生丰富的突变体，现已广泛应用于植物遗传育种和生物学研究。诱变技术也较早地应用在油菜育种中，空间搭载通过辐射、化学诱变、空间搭载等方法，已经获得了生育期、长角果长、丰产、高油、花形态、抗除草剂、抗病、叶片黄化等不同类型的变异种质资源，丰富了基因库，并应用于品种选育之中。但至今尚未发现直接利用白菜型油菜和甘蓝种间杂交创建甘蓝型油菜新变异的报道。
[0003]现有的诱变技术方案主要包括3种类型，分别是物理辐射诱变、化学诱变和航空诱变。物理辐射诱变、化学诱变和航空诱变技术现被广泛应用于农作物育种，使用诱变技术能使作物产生有益变异，从而获得与育种目标相符的性状，据FA0/IAEA (加06)的突变品种数据库(MVD)统计，目前在线登记突变品种2541个，其中油料作物63个，油菜占25个，突变品种的问世和突变基因的扩散促进了各国的农业生产和经济发展。
[0004]辐射诱变和化学诱变虽然能够创建突变体，但是所用的物理射线和化学诱变剂对环境以及人体会造成较严重的损伤，在使用中对实验条件和操作技术要求非常严格，普通实验室很难具备理化诱变条件，一般的实验人员也不具备理化诱变技术，因此，这一技术在普及上有难度。同样，空间搭载存在着成本高、门槛高等难题，导致一般实验室也很难应用。
【发明内容】
[0005]本发明的的目的就 是为了解决上述现有技术中的不足之处，提供一种新型创建甘蓝型油菜突变体的方法。
[0006]本发明所述一种新型创建甘蓝型油菜突变体的方法，其方法包括如下步骤:
[0007](I)有性杂交
[0008]以白菜型油菜和甘蓝为父母本，分别进行正反交，于每蕾开花前1-3天进行剥蕾去雄，去雄后立即授粉一次，次日重复授粉一次；
[0009](2)幼胚抢救
[0010]授粉10天后，每天剥开角果在体式显微镜下观察胚珠发育状态和幼胚发育进程，找准幼胚凋亡临界期，于幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液灭菌15分钟，再用无菌水清洗三次后将角果放于无菌滤纸上剥出幼胚种于固体培养基，培养基成分为MS基本培养基 +1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA ；
[0011](3)快繁继代
[0012]在MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培养基进行快繁，将一颗杂种苗增殖为3个以上的拷贝，为了防止长期连续培养导致杂种苗玻璃化和老化，进行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA两种培养基交替培养继代；[0013](4)染色体加倍
[0014]幼嫩的小苗转入添加有100mg/L秋水仙素的MS培养基中培养12天左右，具体时间视苗子的长势而定，一般来说当幼苗的顶端明显变粗时即可停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗；
[0015](5)变异筛选
[0016]从创建的异源四倍体(新型的甘蓝型油菜AACC)第一代开始，观察并记录叶型、叶色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果长度、籽粒大小、初花期、终花期、成熟期、花粉育性、自交亲和性等性状不同世代变异情况，同时利用AFLP分子标记检测新型甘蓝型油菜基因组水平变异情况，分子水平检测到的变异一方面可以与形态上可见变异相互印证，另一方面可以通过分子检测发现更多的中性突变；AFLP分子标记按照Sagha1-Maroof等的CTAB法提取样品DNA，参照Vos等报道的方法进行AFLP分析，首先利用5U EcoR I和2U Mse I限制性内切酶(反应体积为25μ L)在37 °C水浴酶切DNA，酶切片段两端连接人工接头E-F:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E-R:5’-AATTGGT
[0017]ACGCAGTC-3’、M-F:5' -GACGATGA GTCCTG AG-3’ 和 M-R:5’-TACTCAGGACTC
[0018]ATC-3’，用预扩增引物扩增连接产物，将预扩产物稀释后利用选择性扩增引物进行扩增，选扩产物变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显影，筛选出新型甘蓝油菜。
[0019]本发明首 次提出利用基因组异源多倍化的齿轮效应创建新型甘蓝型油菜。本发明所用的技术是利用白菜型油菜和甘蓝型油菜种间杂交，使两个不同来源的基因组异源多倍化后，发生了多倍化齿轮效应，即随着世代的发展，遗传变异越来越广泛，在后代配合着形态学以及DNA水平的变异筛选，会筛选到一系列的突变体。异源多倍化的齿轮效应的定义是将白菜型油菜(AA)和甘蓝(CC)的不同基因组异源多倍化为甘蓝型油菜(AACC)，其后代基因组不稳定性随着世代的发展而加剧。
[0020]从创建的异源四倍体(新型的甘蓝型油菜AACC)第一代开始，观察并记录叶型、叶色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果长度、籽粒大小、初花期、终花期、成熟期、花粉育性、自交亲和性等性状不同世代变异情况。同时利用AFLP分子标记检测新型甘蓝型油菜基因组水平变异情况。分子水平检测到的变异一方面可以与形态上可见变异相互印证，另一方面可以通过分子检测发现更多的中性突变。中性突变的定义是生物的进化主要由中性突变决定的，这些中性突变经自然选择保留下来，再经隔离形成新物种，某些突变不影响生物的正常代谢过程。
[0021]本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果:
[0022]该方法与物理辐射诱变、化学诱变及航空诱变相比，该技术属于环境友好型，对实验操作人员也不会造成身体损伤，同时，该技术准入门槛低，普通的实验室都能够完成，此外成本更为低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是AFLP技术检测花色突变材料自交后代DNA变化图。
【具体实施方式】
[0024]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
【发明内容】
所实现的技术均属于本发明的范围。
[0025]实施例1
[0026]试验材料
[0027]A基因组供体是白菜型油菜“青海大黄油菜”，C基因组供体是甘蓝类亚种“中迟花芥兰”，均由青海省农林科学院提供。利用大黄油菜和中迟花芥兰杂交后合成的新型甘蓝型油菜自交世代被用于形态、育性、自交亲和、籽粒性状及分子水平遗传变异分析。
[0028]试验方法
[0029](I)有性杂交
[0030]以大黄油菜为母本，以中迟芥蓝为父本进行有性杂交，于每蕾开花前1-3天进行剥蕾去雄，一般上午去雄，下午授粉，第二天上午重复授粉一次；
[0031](2)幼胚抢救
[0032]授粉10天后，每天剥开角果观察胚珠发育状态，幼胚发育进程，大黄油菜和中迟芥蓝杂交组合授粉后20d之前未出现肉眼可见胚，而授粉25d之后绝大多数胚珠已经凋亡，褐色珠被内包裹一微小死亡幼胚，说明肉眼可见幼胚出现时间与胚珠凋亡时间相隔较短，最佳取胚时间为授粉后20-25d;幼胚在母体内可发育到的最后阶段是鱼雷型胚期，该时期胚珠内胚乳消失殆尽，仅剩珠被包裹着鱼雷形胚，将鱼雷形幼胚取出分别接种于MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA的培养基上，接种于MS培养基上2_3d所有幼胚开始褐化、凋亡，而接种于分化培养基上的幼胚逐渐形成愈伤，然后在愈伤组织上分化出杂种苗，通过胚抢救获得10株人工甘蓝型油菜单倍体苗；
[0033](3)快繁
[0034]在MS+L 5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培养基进行快繁，将一颗单倍体杂种苗增殖为3个以上的拷贝。为了防止长期连续培养导致杂种苗玻璃化或老化，进行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA两种培养基交替培养继代；
[0035](4)人工染色体加倍
[0036]幼嫩的小苗转入添加有100mg/L秋水仙素的MS培养基中培养12天左右，具体时间视苗子的长势而定，一般来说当幼苗的顶端明显变粗时即可停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗；于初花期取幼小花蕾固定于卡诺固定液，挑取花药用lmol/L盐酸溶液在60°C水浴中水解3分钟，水洗后用卡宝品红染液染色压片，在显微镜下进行减数分裂观察；
[0037](5)变异材料筛选
[0038]从人工合成甘蓝型油菜第一代开始，对其植株形态、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期等性状进行观察；出现变异的植株套袋自交，获得稳定突变材料；利用AFLP分子标记检测人工合成甘蓝型油菜形态变异植株基因组变异情况。按照Sagha1-Maroof等的CTAB法提取样品DNA。参照Vos等报道的方法进行AFLP分析，首先利用5U EcoR I和2U MseI限制性内切酶，反应体积为25 μ L，在37°C水浴酶切DNA，酶切片段两端连接人工接头，E-F:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E_R: 5’-AATTGGTACGCAGTC-3’ 和 M-F: 5’-GACGATGA GTCCTGAG-3’、M-R: 5’ -TACTCAGGACTCATC-3’，用预扩增引物扩增连接产物，将预扩产物稀释后利用选择性扩增引物进行扩增。选扩产物变性，聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显影，标记如下:
[0039](A)获得大粒材料[0040]在人工甘蓝型油菜自交后代获得大粒甘蓝型油菜资源，其中获得千粒重> 6g的资源2份，其千粒重显著高于甘蓝型油菜主栽品种青油14号和青杂2号，见表1，表1如下:
[0041]表1获得的大粒材料
[0042]
【权利要求】
1.一种创建甘蓝型油菜突变体的方法，其特征在于包括如下步骤: a.有性杂父 以白菜型油菜和甘蓝为父母本，分别进行正反交，于每蕾开花前1-3天进行剥蕾去雄，去雄后授粉一次，次日重复授粉一次； b.幼胚抢救 授粉10天后，每天剥开角果在体式显微镜下观察胚珠发育状态和幼胚发育进程，找准幼胚凋亡临界期；在幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液灭菌15分钟，再用无菌水清洗三次后将角果放于无菌滤纸上剥出幼胚种于固体培养基，所述的固体培养基为成分为MS基本培养基 +1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA ； c.快繁继代 在上述步骤a中的固体培养基中进行快繁，将一颗杂种苗增殖为3个以上的拷贝，进行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA两种培养基交替培养继代； d.染色体加倍 将小苗转入添加有100mg/L秋水仙素的MS培养基中培养，当幼苗的顶端明显变粗时停止处理，将处理的幼苗连同愈伤组织一同转入新鲜的快繁培养基中直到从愈伤组织中分化出新苗； e.变异筛选 从创建的异源四倍体新型的甘蓝型油菜第一代开始，对其植株形态、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期观察，找出变异植株；用AFLP分子标记检测新型甘蓝型油菜基因组水平变异情况；利用5U EcoR I和2U Mse I限制性内切酶在37°C水浴酶切DNA，酶切片段两端连接人工接头 E-F: 5’ -CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E-R: 5’ -AATTGGTACGCAGTC-3’ 和M-F: 5’ -GACGATGA GTCCTG AG-3’、M-R: 5’ -TACTCAGGACTCATC-3’，用预扩增引物扩增连接产物，将预扩产物稀释后利用选择性扩增引物进行扩增，筛选出新型甘蓝油菜突变体。
【文档编号】A01H4/00GK103461102SQ201310408329
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】赵志刚, 富贵, 徐亮, 星晓蓉, 唐国永, 杜德志 申请人:青海省农林科学院