一株耐盐侧耳木霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株耐盐侧耳木霉及其应用，属于解磷微生物肥料【技术领域】。该菌株为侧耳木霉（Trichoderma?pleuroticola）HF01，保藏编号为CGMCC?No.8127。本发明还公开了含有上述菌株的微生物菌剂及其制备方法。实验表明，本发明的侧耳木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、耐盐能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，在提高磷肥的利用率，改善土壤结构，提高作物的产量及品质方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】一株耐盐侧耳木霉及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于解磷微生物肥料【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种能够高效解磷的耐盐侧耳木霉菌及其用途，以及采用该侧耳木霉菌制备的微生物菌剂。
【背景技术】
[0002]磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，磷既是植物细胞中遗传物质DNA和能量物质ATP等众多有机化合物的基本构成元素，同时植物的光合作用和体内的生化代谢过程都必须有磷参加，磷在植物的整个生命过程中起着不可替代的作用。磷既是农业生产的重要物质保证，又是不可再生的矿质资源。我国有74%的耕地土壤缺磷，作物对施入的磷肥的当季利用率只有5%~10%，土壤中95%以上的磷与Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐而难以被作物吸收利用。磷是限制植物生长的主要因素之一，因此利用解磷微生物分解土壤中被固定的磷和提高磷肥利用率是达到作物高产、品质优良的重要途径之一。
[0003]极端环境通常包括具有闻温、低温、闻酸、闻喊、闻盐、闻压、和闻福射等条件下的环境。人们将能在这些极端条件下生活的微生物统称为极端微生物。极端微生物是依赖于一种或多种极端物化因子的极端生命形式，极端微生物适应环境的结果使其具有独特的基因类型，从而也赋予其特殊的结构、生理机制及特殊的代谢产物。其存在的机理为更好地认知生命现象、发展生物技术提供了宝贵的知识源泉。适应环境的结果使得极端微生物具有独特的生理机制，可以产生形式多样的代谢产物，并可以突破当前生物【技术领域】中的一些局限，建立新的生物技术手段，将使我们在环境、能源、农业、健康、轻化工等领域的生物技术能力发生革命极端微生物是研究生物进化、生命起源的良好材料，极端环境下微生物资源的研究不仅具有重要的理论和实际意义，而且具有良好的发展前景。
[0004]木霉(Trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科,是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。其本身对植物纤维中的木质素、纤维素和半纤维素具有天然分解能力，多种病害具有防除作用，具有多功能特性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于高效解磷的新的木霉菌株——侧耳木霉HF01。本发明的侧耳木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、耐盐能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种采用该新的侧耳木霉菌株HFOl制备的能够高效解磷的微生物菌剂。
[0007]本发明所提供的菌株为侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)HF01,是从滨海湿地盐溃土壤中分离获得的，已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.8127。其具有以下生物学特性:在PDA琼脂培养基上产生簇。状白色气生菌丝，分生孢子梗形成小疱，汇合为宽的同心轮纹，开始为绿灰色，很快转变为灰绿色，老龄时在PDA上颜色为黑绿色，或者有时在扁平产孢簇边缘具有白色流苏状菌丝，上有亮绿色新生孢子。菌落背面开始基本无色，随着菌龄增长，在PDA上为黑褐色，培养7天后产生大量小型黄色结晶物。分生孢子梗分枝近似金字塔形，越接近基部分枝越长，分枝单生或者向梗的主轴基部对生，接近主轴顶端时一般3~4个分枝排列为轮枝状，初级分枝的再分枝形式类似主轴分枝方式，分生孢子梗及其分枝相对较狭窄并且呈波曲状，主轴基部宽度为5.5μηι,向上逐渐变细,顶端为2.5~3.0 μ m,最顶端的分枝圆柱形,大小为6~14X 2.5~3.3 μ m。瓶梗对生，或者在顶生分枝上3~4个排列为轮枝状，或者分散着生并沿分生孢子梗或者分枝侧面散生，安瓿形或者烧瓶形，顶部突然变细为梗颈，着生分生孢子，其宽度小于lym，大小通常为4.2~9.5X3.0~4.2 μ m，顶生瓶梗细长，长度可达20 μ m。在顶生分枝或者瓶梗侧面，有时于隔膜下方产生短圆柱形间生瓶梗。在老龄培养物中，瓶梗为离散着生。分生孢子亚球形至宽椭圆形，有时为倒卵圆形并且基部尖细，但是不常见，大小为2.6~5.0X 2.4~3.7 μ m(平均为3.7X 2.8 μ m)，显微镜下观察为亮绿色，聚集成团时为黑灰绿色，壁光滑。厚垣孢子通常成串或者成簇，亚球形，直径为4~10 μ m，苍绿色。分生孢子梗的分枝间隔规则，越靠近基部分枝越长，分枝和瓶梗一般排列为部致密的轮枝状。
[0008]本发明侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)菌株HFOl的培养方法或繁殖方法包括:
[0009](I)普通培养保存采用PDA培养基，配方为:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水 IOOOmL ；
[0010](2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为:马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水IOOOmLo
[0011](3)固体培养基配方:固料和无机盐溶液，按质量比1:1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为75:10:15的稻糠、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。
[0012](4)大量发酵培养配方:同(3)中固体培养基配方。
[0013]本发明还提供一种能够高效解磷的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有侧耳木霉菌株 Hi7Ol。
[0014]本发明还提供了上述侧耳木霉菌株HFOl或者微生物菌剂在提高磷肥的利用率，改善土壤结构，提高作物的产量及品质方面的应用。
[0015]本发明所述的微生物菌剂的制备方法包括以下步骤:
[0016]( I)制备所述侧耳木霉菌株HFOl的种子液；
[0017](2)将步骤(I)制备的种子液接种到固体培养基中，28_30°C下恒温培养；
[0018](3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养。
[0019]具体包括以下步骤:
[0020](I)将所述侧耳木霉菌株HFOl的孢子移植到PDB液体培养基中，28°C摇床振荡培养3~5d得到种子液；
[0021](2)将步骤(I)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28°C下振荡培养3~5d ;
[0022](3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1:15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1:6的比例(滤液:大量发酵培养基=1:6)接种至大量发酵培养基，室温28°C、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8~9d。
[0023]其中，步骤(I)中的所述PDB液体培养基为:马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水10OOmT,；
[0024]步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1:1.8 ;所述固料由质量比为75:10:15的稻糠、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水；
[0025]步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
[0026]实验表明，本发明的侧耳木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、耐盐能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。同时该菌株不仅具有高效解磷的作用，还具有木霉本身的加快分解秸杆和防治植物病害的作用。因此在农业生产上具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0028]实施例1
[0029]1、侧耳木霉(T.pleuroticola) HFOl的分离与纯化
[0030]本发明的侧耳木霉(T.pleuroticola) HFOl是从滨海湿地土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为:
[0031](I)木霉菌株的分离:盐溃土样的采集，在全国不同盐溃地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取Ig 土样于IOOmL无菌水中，置于30°C摇床中150rpm震荡lOmin，取100 μ L10—2、10' 10_4稀释液涂布于PDA培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30°C培养2d后挑取PDA上的不同形态的微生物菌落于PDA上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转至PDA试管斜面分别编号保存备用。
[0032](2)耐盐木霉菌株的筛选
[0033]①初筛:采用高盐PDA平板，盐浓度为10%、20%和30%三个盐浓度梯度，分别添加对应含量的氯化钠，将分离获得的纯菌株在PDA斜面上活化2-3代，然后分别点接种于PDA培养基上，置于30°C培养箱中培养7d，将有单个菌形成的菌种圈挑出，进一步通过划线法纯化，直到得到纯菌株。
[0034]②复筛:根据上述耐盐菌初筛的结果，选择耐盐效果较好的菌株，利用高盐摇瓶培养基进行培养，盐浓度为10%、20%和30%三个盐浓度梯度，30°C摇床中振荡培养7d，分光光度计测定OD6tltlnm值，比较其生长量，每样品重复测3次，取平均值，测定该菌株的耐盐能力。[0035]本发明人通过大量筛选工作得到一株能够耐盐的侧耳木霉(T.pleuroticola)HF01。实验证明，具有生长速度快、耐盐能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
[0036]其中，PDA培养基配方:马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。
[0037]2、菌株鉴定
[0038](I)微生物学特性:在PDA琼脂培养基上产生簇状白色气生菌丝，分生孢子梗形成小疱，汇合为宽的同心轮纹，开始为绿灰色，很快转变为灰绿色，老龄时在PDA上颜色为黑绿色，或者有时在扁平产孢簇边缘具有白色流苏状菌丝，上有亮绿色新生孢子。菌落背面开始基本无色，随着菌龄增长，在PDA上为黑褐色，培养7天后产生大量小型黄色结晶物。分生孢子梗分枝近似金字塔形，越接近基部分枝越长，分枝单生或者向梗的主轴基部对生，接近主轴顶端时一般3~4个分枝排列为轮枝状,初级分枝的再分枝形式类似主轴分枝方式,分生孢子梗及其分枝相对较狭窄并且呈波曲状，主轴基部宽度为5.5μπι，向上逐渐变细，顶端为2.5~3.0 μ m，最顶端的分枝圆柱形，大小为6~14 X 2.5~3.3 μ m。瓶梗对生，或者在顶生分枝上3~4个排列为轮枝状，或者分散着生并沿分生孢子梗或者分枝侧面散生，安瓿形或者烧瓶形，顶部突然变细为梗颈，着生分生孢子，其宽度小于I μ m，大小通常为4.2~
9.5 X 3.0~4.2 μ m，顶生瓶梗细长，长度可达20 μ m。在顶生分枝或者瓶梗侧面，有时于隔膜下方产生短圆柱形间生瓶梗。在老龄培养物中，瓶梗为离散着生。分生孢子亚球形至宽椭圆形，有时为倒卵圆形并且基部尖细，但是不常见，大小为2.6~5.0X2.4~3.7 μ m(平均为3.7X2.8 μ m)，显微镜下观察为亮绿色，聚集成团时为黑灰绿色，壁光滑。厚垣孢子通常成串或者成簇，亚球形，直径为4~10 μ m，苍绿色。分生孢子梗的分枝间隔规则，越靠近基部分枝越长，分枝和瓶梗一般排列为部致密的轮枝状。
[0039](2)分子生物学特性
[0040]该菌株的rRNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-1TS2区)如下(SEQ N0.1):
[0041]TCGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTA
[0042]CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGA
[0043]TCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACC
[0044]AAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCC
[0045]CCTCGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG
[0046]CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA
[0047]TCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCC
[0048]GAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTC
[0049]CCTCTGCGGGGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCG
[0050]CAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCA[0051 ] ACTTTCTGAAATGTGACCTCGATCAGGTAGAATCCCGC
[0052]实施例2
[0053]1、侧耳木霉菌发酵过 程
[0054]PDB培养基配方:马铃薯200g (去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
[0055]大量固体发酵培养基配方(质量百分含量):
[0056]固料:由质量比为75:10:15的稻糠、玉米粉和麸皮组成；[0057]无机盐溶液:磷酸二氢钾3.5%，硫酸镁0.04%,硫酸铵4%，剩余为水。
[0058]固液比为1:1.8 (质量比)
[0059]侧耳木霉(T.pleuroticola) HFOl大量固体发酵过程:
[0060]①菌种种子液培养:将侧耳木霉(T.pleuroticola) HFOl从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28°C摇床振荡培养3~5d，此为种子液。
[0061]②固体生产菌种的培养:将种子液按10%的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28°C恒温培养3~5d，中间多次振荡。
[0062]③大量固体发酵:将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28°C和相对湿度85%以上)中发酵培养8~9d，即可得到侧耳木霉原粉，其有效活菌数≤15X108cfu/g。
[0063]实施例3
[0064]高效解磷菌侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola) HFOl棉花小区试验
[0065]试验材料:侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola) HFOl的发酵液(上述步骤①获得的种子液)，具有溶磷的功效，有效活菌数(活孢子)大于2X108cfu/ml。
[0066]试验时间:2012年4月~2012年10月
[0067]试验地点:临清市山东省农科院棉花中心试验站
[0068]供试作物:棉花(鲁棉研28号)
[0069]试验土壤:潮土
[0070]试验设计:以不同稀释度(10倍、20倍、30倍)的侧耳木霉HFOl发酵液拌种棉花作为示范，以基质培养基拌种棉花作为对照(CK)，每个处理三个平行，小区面积20m2，随机分布。
[0071]施肥量与施肥方法:播种前，采用不同稀释度(10倍、20倍、30倍)的侧耳木霉HFOl发酵液和基质培养基拌种，其他措施同当地，统一浇水、间苗、除草等田间管理措施。
[0072]农艺性状及产量调查:于收获前测量株高、果枝始节位、果枝数、株铃数、单铃重。
[0073]表1棉花农艺性状调查表
【权利要求】
1.侧耳木霉(Trichodermapleuroticola)菌株HF01,所述菌株的保藏编号为CGMCCN0.8127。
2.权利要求1所述的侧耳木霉(Trichodermapleuroticola)菌株HFOl在提高磷肥的利用率，改善土壤结构方面的用途。
3.权利要求1所述的侧耳木霉(Trichodermapleuroticola)菌株HFOl在提高作物的产量及品质方面的用途。
4.一种微生物菌剂,含有权利要求1所述的侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)菌株 Hi7Ol。
5.一种制备权利要求4所述的微生物菌剂的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)制备侧耳木霉菌株HFOl的种子液； (2)将步骤(I)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30°C下恒温培养； (3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30°C、相对湿度85%以上的发酵室中进行发酵培养； 所述步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1:1.8 ;所述固料由质量比为75:10:15的稻糠、玉米粉和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水；所述步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是， (1)将侧耳木霉菌株HFOl的孢子移植到PDB液体培养基中，28°C摇床振荡培养3~5d得到种子液；所述PDB液体培养基为:马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水IOOOmL ； (2)将步骤(I)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28°C下振荡培养3~5d ; (3)将步骤(2)培养的培养物加入其质量15倍的无菌水混合，过滤，将滤液按体积比I:6的比例接种至大量发酵培养基，室温28°C、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8~9d。
7.权利要求4所述的微生物菌剂在提高磷肥的利用率，改善土壤结构方面的用途。
8.权利要求4所述的微生物菌剂在提高作物的产量及品质方面的用途。
【文档编号】A01P3/00GK103468591SQ201310442613
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】牛赡光, 刘幸红, 王清海, 段春华, 郑香军, 周峰, 田龙军 申请人:山东省林业科学研究院