一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法
【专利摘要】本发明提供的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，包括以下步骤：精液低温冷藏储存：将采集到的黄金鲈鱼的精液与储存液混匀，得精子储藏液，2-6℃冷藏储存；精液超低温冷冻贮藏：将精子储藏液与冷冻保护剂混匀，分次降温，再置于液氮中贮藏。本发明提供的黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法工艺简单、成本低廉，能有效延长黄金鲈鱼精子的体外存活时间，保护了精子的完整性，显著提高了黄金鲈鱼精子的生存指数，保持其受精活力。
【专利说明】一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物繁殖【技术领域】，具体涉及一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法。
【背景技术】
[0002]黄金自卢鱼(Perea fIavescens),分布较广，是分布在北美五大湖的一种营养价值很高的淡水鱼类，曾经是 北美历史上最大的渔业产业。近年来，由于过度捕捞、水体污染等原因，黄金鲈鱼捕捞量锐减，造成了野生捕捞量远远不能满足市场的需求量。为弥补这种缺失，黄金鲈鱼的人工养殖产业迅猛发展，然而，和其他养殖鱼类相比，黄金鲈鱼生长速度较慢，雌雄鱼生长差异显著，发育不同步，并且性成熟过早(一龄成熟)，多数雄鱼很难达到商品规格，极大地限制了黄金鲈养殖产业的发展。
[0003]通过遗传改良措施，提高其生长性能，成为黄金鲈产业发展的重要措施之一。然而，由于黄金鲈具有雌雄鱼个体差异较大，性腺发育不同步等生理缺陷，往往难于同时得到成熟的精子和成熟的卵子，无法进行人工授精，使得遗传选育和杂交组合难以实施。因此，必须开展对黄金鲈鱼的精子贮藏研究，以便于进行人工繁殖，进而实施遗传选育和改良，对物种资源加以开发利用。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的目的在于提供一种能够有效延长黄金鲈鱼精子的体外存活时间的超低温冷冻贮藏方法。
[0005]技术方案:本发明提供的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，包括以下步骤:
[0006](I)精液低温冷藏储存:将采集到的黄金鲈鱼的精液与储存液混匀，得精子储藏液，2-6 °C冷藏储存；
[0007](2)精液超低温冷冻贮藏:将精子储藏液与冷冻保护剂混匀，分次降温，依次为:在-15°C环境中静置l_3min，在-15°C环境中静置l_3min，在_40°C环境中静置l_3min，在_80°C环境中静置l_3min，在-110°C环境中静置l_3min，在_160°C环境中静置4_6min ；再置于液氮中贮藏。
[0008]其中，步骤(1)中，黄金鲈鱼的精液与储存液的体积比为1: (10-20)，冷藏储存时间为3-24h。
[0009]其中，步骤(1)中，储存液配方为:
[0010]NaCIB.0Og/丨,；
KCl0.40g/1.;
?:--Ι:1,.2!!4)0.16β/L；
MgSO^THlOO, 20g/L；
Na^fIPOl0.06g/L；
KHsFOiCl 06g/L；
NaHCO30.35 g/L；
C6IL2Ofi (glucoso)1.00g/L?
[0011]其中，步骤(2)中，精子储藏液与冷冻保护剂的体积比为1: (1-5)。
[0012]其中，步骤(2)中，冷冻保护剂为甲醇、二甲亚砜或甘油。
`[0013]有益效果:本发明提供的黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法工艺简单、成本低廉，能有效延长黄金鲈鱼精子的体外存活时间，保护了精子的完整性，显著提高了黄金鲈鱼精子的生存指数，保持其受精活力；从而从根本上解决了黄金鲈雄鱼精液少、雌雄鱼发育不同步等技术问，使其可用于黄金鲈鱼亲本的人工授精题，实现黄金鲈鱼的人工授精，进而实施遗传选育，实现黄金鲈鱼的遗传选育和人工杂交组合技术的产业化。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为采用本发明贮藏方法超低温冷冻黄金鲈鱼的精液解冻后，检测精子活力的显微图谱(目镜IOX物镜20)。
【具体实施方式】
[0015]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0016]实施例1
[0017]黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，包括以下步骤:
[0018]1、精液采集
[0019]抓取雄鱼放入干毛巾中，吸干体表水后，用手指挤压其腹部两侧，待精液流出后，用经75%酒精消毒的胶头滴管吸取精液；
[0020]精子能动性检测:取2μ L精液，加入20μ L去离子水混匀置于载玻片上，盖上玻片，用光学显微镜检测，只有能向前运动的精子被认为有活力(静止在同一地方运动的则视为无活力)，以百分比来计算其能动性，测得精子能动性为85.33%。
[0021]2、精液冷冻储存:
[0022]( I)冷冻储存液
[0023]配方:
[0024]NaCl8.0O g/?.；
KCl0.40 g/L；
CaC 1L>*21 tf)0.16 g/L;
MgSO1.7Ii,00.20 g/L；
NaJlPO10.06 g/L；
Kll1PO10,06 g/1.；
Na!ICO,0.35 g/L；
CbISA (glucose)LOO g/L,,
[0025]其制备方法，包括以下步骤:
[0026]a.将600mL去离子水和一个磁力搅拌子放入I升烧杯中；
[0027]b.加入配方量的组份，并用磁力搅拌器搅拌，直至溶解；
[0028]c.用渗透压摩尔测定仪测定其摩尔浓度(单位:m0smol/kg);
[0029]d.用去离子水稀释至配方浓度，溶液渗透压浓度为300m0smol/kg ;
[0030]e.贴上标签 ，置于4°C冰箱保存；
[0031]f.若以上冷冻储存液超过一个星期不使用，需用0.22 μ m滤膜过滤后再使用。
[0032](3)低温储存
[0033]将采集到的精液置于干净的容器中，加入相对于精液体积15倍的储存液中，4°C保藏；24h后，测得精子能动性为78.02%。
[0034](4)超低温冷冻贮藏
[0035]将精子储存液分别以1:2(精液:甲醇)的比例稀释后各取lml，置于2ml EP管中，做好标记(并事先在小瓶上系好线)，放于液氮罐的小提桶口。在小提桶沿液氮罐(IOL) 口分几步下降，分段降温。每步大约降3cm，其间停留2分钟(每步相应的温度分别为-15°C，-40°C, -80°C, _110°C，用低温温度计测得)，最后降至约_160°C (约在液氮面以上4cm处)再停留5分钟，然后投入液氮中保存。
[0036](5)解冻并复苏:
[0037]按-40°C 7分钟，-30°C 14分钟，_20°C 21分钟进行复苏，分别在0、15、30min检测
其能动性。
[0038]解冻后，精子活力的显微图谱见图1，载玻片中有活力的精子；精子能动性检测结果见表1。
[0039]表1解冻后的精子能动性检测结果
[0040]
I活力精子I精子总数I能动性％~
Omin~ 75TTl67.57
ISmin 549954.55
30min 57TTi50[0041]检测结果表明，此方法获得的解冻后的精子活力较大，能动性比例较高。因此，本发明的方法可以作为长期贮藏黄金鲈鱼精子的有效方法。
[0042]实施例2
[0043]黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，包括以下步骤:
[0044]1、精液采集
[0045]抓取雄鱼放入干毛巾中，吸干体表水后，用手指挤压其腹部两侧，待精液流出后，用经75%酒精消毒的胶头滴管吸取精液；
[0046]精子能动性检测:取2μ L精液，加入20μ L去离子水混匀置于载玻片上，盖上玻片，用光学显微镜检测，只有能向前运动的精子被认为有活力(静止在同一地方运动的则视为无活力)，以百分比来计算其能动性，测得精子能动性为70.21%。
[0047]2、精液冷冻储存:
[0048]( I)冷冻储存液
[0049]配方:
[0050]
腻18.00 g/L；
KCl0.40 g/L；
CaCI,.211,00.16 g/L；
MgSO4* TH2O0.20 g/L；
Na2HPO40.0S g/L;
KII1PO10.06 g/L；
Nali(X)i0.35 g/L?
Celii2Oe (glucose)1.00 g/U
[0051]
[0052]其制备方法，包括以下步骤:
[0053]a.将600mL去离子水和一个磁力搅拌子放入I升烧杯中；
[0054]b.加入配方量的组份，并用磁力搅拌器搅拌，直至溶解；
[0055]c.用渗透压摩尔测 定仪测定其摩尔浓度(单位:m0smol/kg);
[0056]d.用去离子水稀释至配方浓度，溶液渗透压浓度为300m0smol/kg ;
[0057]e.贴上标签，置于4°C冰箱保存；
[0058]f.若以上冷冻储存液超过一个星期不使用，需用0.22 μ m滤膜过滤后再使用。
[0059](3)低温储存
[0060]将采集到的精液置于干净的容器中，加入相对于精液体积10倍的储存液中，6°C保藏；12h后，测得精子能动性为63.97%。
[0061](4)超低温冷冻贮藏
[0062]将精子储存液分别以1:2(精液:二甲亚砜)的比例稀释后各取lml，置于2ml EP管中，做好标记(并事先在小瓶上系好线)，放于液氮罐的小提桶口。在小提桶沿液氮罐(IOL) 口分几步下降，分段降温。每步大约降3cm，其间停留3分钟(每步相应的温度分别为-15°C，-40°C, -80°C, _110°C，用低温温度计测得)，最后降至约_160°C (约在液氮面以上4cm处)再停留4分钟，然后投入液氮中保存。
[0063](5)解冻并复苏:
[0064]按-40°C 7分钟，-30°C 14分钟，_20°C 21分钟进行复苏，分别在0、15、30min检测
其能动性。
[0065]精子能动性检测结果见表2。
[0066]表2解冻后的精子能动性检测结果
[0067]
【权利要求】
1.一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)精液低温冷藏储存:将采集到的黄金鲈鱼的精液与储存液混匀，得精子储藏液，2-6 °C冷藏储存； (2)精液超低温冷冻贮藏:将精子储藏液与冷冻保护剂混匀，分次降温，依次为:在_15°C环境中静置l_3min，在-15°C环境中静置l_3min，在_40°C环境中静置l_3min，在_80°C环境中静置l_3min，在-110°C环境中静置l_3min，在_160°C环境中静置4_6min ；再置于液氮中贮藏。
2.权利要求1所述的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，其特征在于:步骤(1)中，黄金鲈鱼的精液与储存液的体积比为1: (10-20)，冷藏储存时间为3-24h。
3.权利要求1所述的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，其特征在于:步骤(1)中，储存液配方为:NaCI8.00 g/LjKCIO, ,10 g/l.; CaCl3'2113O0.16 g/L; igSa,*?H200.20 g/L；Na2HP0.,0.06 g/L;KH2Pft10.06 g/L；NaHCO30.35 g/L; C6Hi2Oti (glycosc)LOO g/L?
4.权利要求1所述的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，其特征在于:步骤(2)中，精子储藏液与冷冻保护剂的体积比为1: (1-5)。
5.权利要求1所述的一种黄金鲈鱼的精子超低温冷冻贮藏方法，其特征在于:步骤(2)中，冷冻保护剂为甲醇、二甲亚砜或甘油。
【文档编号】A01N1/02GK103563886SQ201310479333
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】叶旭红, 邱崇文, 林先贵, 刘青华 申请人:苏州依科曼生物农业科技有限公司