一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及饲料【技术领域】，具体涉及一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法。本发明的目的是提供一种具有强效抑菌效果的复合植物提取物饲料添加剂，解决了抗生素等其他合成药物添加到饲料中存在毒副作用等诸多弊端，取得了良好的效果。本发明的技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂，包括柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花精油。本发明有益效果：本发明复合植物提取物饲料添加剂借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂，具有良好的体外抑菌活性，具有高效、安全无毒，长期使用无残留的特点。
【专利说明】一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及饲料【技术领域】，具体涉及一种复合植物提取物饲料添加剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]植物提取物饲料由一系列的植物生物活性成分及其衍生物构成，长期以来就被当作香料、防腐剂与药材使用。植物提取物类饲料添加剂被认为为“安全、高效、稳定、可控”的饲料添加剂，逐渐成为绿色环保安全动物食品生产和饲料工业充满活力的新的经济增长点。
[0003]水生动物与陆生动物所处环境各异，水的粘度为空气的800倍，具良好的保温性能，但透气性差。养殖水体中残饵粪便堆积，各类微生物物集聚，其中许多的致病菌混生。水生动物免疫缺少时最易导致病害的发生，而水产动物摄食行为不可避免的与病原微生物发生直面接触，诱发疾病的除了病毒、细菌、真菌及寄生虫外，营养不良、水质恶化等皆为致病诱因。
[0004]精油作为饲料添加剂可提高动物的免疫机能。部分植物复合提取物据抗氧化活性，例如麝香草精油及其主要成分一百里香酚和甲基异丙基苯-2，3-二醇，可有效清除自由基(如氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和维生素E)。据推测，植物源添加剂和鱼类免疫功能的正常发挥有较好的协同作用，可有效促进消化酶的活性提高，脂质代谢和脂肪的消化吸收。
[0005]植物提取物因其香味可影响养殖动物的采食习惯、促进唾液和消化液分泌从而提高采食量而最初用于饲料中。长期使用，植物提取物中的化学活性物质还可抗菌杀菌、抗氧化，保证动物肠道健康、提高自身免疫机能。与抗生素促生长剂不同，植物提取物被认定为安全、高效、稳定、可控的饲料添加剂。
[0006]植物提取物饲料添加剂的抗微生物活性已有较多研究和报道。该特性使其在化妆品和食品工业上已得到广泛认可和应用。众多研究报道发现，植物提取物(如肉桂属、麝香草属和止痢草/牛至植物提取物等)具有广泛的体外抗微生物活，并发现其抗微生物活性是基于植物精油的作用。在抗菌方面，芸香料灌木、肉桂/ 丁香、大蒜、止痢草/牛至和芥菜提取物抗菌能力最强，但除止痢草/牛至提取物添加剂开发成功外，其它提取物的开发还尚需时曰。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种具有强效抑菌效果的复合植物提取物饲料添加剂，解决了抗生素等其他合成药物添加到饲料中存在毒副作用等诸多弊端，取得了良好的效果。
[0008]本发明的技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂，由柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花精油混合而成。
[0009]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂由以下重量份比的原料组成:[0010]松针粉150-200 份；
[0011]柑橘精油10-15份；
[0012]大蒜素3-5份；
[0013]柑橘黄酮1-3份；
[0014]松花精油1-3份。
[0015]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂由以下重量份比的原料组成:
[0016]松针粉180份；
[0017]柑橘精油12份；
[0018]大蒜素3.6份；
[0019]柑橘黄酮2.2份；
[0020]松花精油2.2份。[0021]本发明的另一技术方案为提供一种复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤:将柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉和松花精油进行混合得到复合植物提取物饲料添加剂。
[0022]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述柑橘精油的制备方法为:柑橘皮干燥后粉碎成柑橘粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，添加质量分数为2.0%的NaCL、蒸馏时间60min时，蒸馏处所得为提纯柑橘精油。
[0023]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述柑橘黄酮的制备方法为:柑橘皮粉末装入萃取池中，使用甲醇萃取技术提取，所述甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为:压力为10.3MPa，温度为70°C，萃取池的甲醇质量分数为80%，料液比为1:15，提取时间lOmin，得提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物，经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮。
[0024]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述松针粉制备方法为:松针药材用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，浓缩至浸膏状，所得浸膏放置于4°C冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，真空干燥24小时得松针粉。
[0025]优选的，上述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法中，所述大蒜素提取方法为:将去皮蒜瓣捣碎制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2_，所述蒜泥在发酵温度为45°C，酶解时间为30min，酶解ph值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，离心，取上清液，在温度50°C、压力0.0謹?&、转速751./ min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得大蒜素。
[0026]本发明有益效果:本发明复合植物提取物饲料添加剂借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂，具有良好的体外抑菌活性，具有高效、安全无毒，长期使用无残留的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1本实验采用挥发油提取蒸馏装置来提取橘皮精油的收率图；
[0028]图2为柑橘皮粉碎度对精油收率的影响；
[0029]图3为柑橘皮蒸馏时间对精油收率的影响；[0030]图4为NaCl的添加量对精油收率的影响。
【具体实施方式】
[0031]为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。
[0032]实施例1
[0033]( I)柑橘精油一蒸馏法
[0034]干燥橘皮一粉碎一水蒸气蒸馏一橘皮精油。
[0035]柑橘干燥后粉碎至40目橘皮粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，内添加NaCL2.0%、蒸馏时间60min时，蒸馏处所得为提纯橘皮精油。
[0036](2)柑橘黄酮的提取
[0037]黄酮类化合物大多具有酚羟基，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。
[0038]提取设备:试剂与设备:芦丁，无水甲醇，盐酸，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等。电热恒温鼓风干燥箱，分光光度计，高速粉碎机，电子天平，加速溶剂萃取仪:压力10.3MPa，34mL萃取池。
[0039]提取工艺流程:橘皮粉末-装入萃取池中-甲醇萃取技术提取-提取液干燥-成品，橘皮经高速粉碎机粉碎粒度过30目筛。
[0040]甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为压力10.3MPa，温度是700C (使用电热恒温鼓风干燥箱)，加速溶剂萃取仪:压力10.3MPa，34mL萃取池，以甲醇浓度为80%，料液比为1:15，提取时间lOmin。提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物。经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮提取物。
[0041](3)松针粉
[0042]复方松针药材约(IOOg)用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得浸膏约Hg，放置于4°C冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，至真空干燥器中，真空干燥24小时。
[0043](4)大蒜素提取
[0044]晚干大蒜头一(纟父碎)一油水混合物一(蒸懼)一粗提取物一(分懼)一成品。
[0045]水蒸气蒸馏法主要得到的是大蒜素进一步降解的烯丙基硫化物，有机溶剂提取法所得广物以大蒜素为主。
[0046]将大蒜去皮，称取一定量的去皮蒜瓣，用组织捣碎机制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2mm。亚铁离子浓度为10m01/l，发酵温度为45°C，酶解时间为30min，酶解ph值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，3500r / min离心lOrain，取上清液，在温度50°C、压力0.0lMPa、转速75r / min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，测定浓缩大蒜素溶液中大蒜素含量。酶解时间、萃取温度、料液比对大蒜素提取率影响最显著。优化所得的大蒜素提取最佳工艺为:酶解时间30min、酶解温度45°C、酶解pH6.0、料液比Ig:4ml、萃取时间60min、萃取温度30°C，乙醇浓度95%。
[0047]柑橘精油、大蒜素、松针粉、松花黄酮、柑橘黄酮分别从柑橘皮、大蒜、松花、松针中提取。柑橘精油提取后呈现沸点高、热敏性、易氧化的特性；柑橘黄酮不但具有独特的芳香性、良好的水溶性。大蒜素性质:淡黄色油状液体。大蒜素，沸点80-85°C (0.2kPa)，相对密度1.112 (20/4°C)，折光率1.561。溶于乙醇、氯仿或乙醚。水中溶解度2.5%(质量)(10°C )，其水溶液pH值为6.5，静置时有油状物沉淀物形成。与乙醇，乙醚及苯可互溶。对热碱不稳定，对酸稳定。由存在于百合科植物大蒜的鳞茎中，由存在的大蒜氨酸在大蒜酶作用下转化产生。也存在于葱的鳞茎中。具有强烈的大蒜臭，味辣。
[0048]将上述的柑橘精油、柑橘黄酮、松花黄酮及大蒜素按照比例及先后顺序，投放至温州发昊星机械设备制造有限公司生产的水粉混料泵THJ-f中，先后顺序按照其沸点的高低进行安排，由高到底，综合考虑其热敏活性。混合的顺序分别为:大蒜素、柑橘黄酮、松花黄酮、柑橘精油。混合比例为，松花粉1.8kg，柑橘精油0.12kg，柑橘黄酮0.022kg，松花黄酮0.022kg，大蒜素0.036kg。制作工艺参数参考福建正源饲料有限公司柑橘复合素制作工艺控制。
[0049]实施例2本发明复合植物提取物饲料添加剂体外抑菌效果
[0050]嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属，是嗜温、有动力的气单胞菌群，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，具有广泛的致病性，对水产动物1、两栖动物和哺乳动物均有致病性。在水产上，是鱼类最常见的致病菌，对淡水鱼感染称为细菌性败血症，发病率达到90%以上，死亡率高达65%以上。曾在上海、江苏、浙江、安徽、广东、广西、福建等20多个省、市、自治区广泛流行，受危害的鱼种类有鲢、鳙、鲮、鲤、鳜、黄鳝、草鱼、白鲳、加州鲈、虾、鳖等多种淡水养殖鱼类。植物提取物作为免疫增强剂和治疗药物在水产上的应用逐渐增多。
[0051]本发明借鉴传统中草药理论研究和实践的基础上选出4种中草药5种提取物，并测定其体外抑菌活性，从中筛选出对嗜水气单胞菌有抑制作用的植物提物，制备成复方制剂。
[0052]1.1试验材料
[0053]1.1.1 供试菌株:嗜水气单胞菌 IB101，JGlOl，4LNS301，CCH201，LNBlOl，CGlOl:由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心惠赠；BSK — 10、TPS 一 30由浙江省淡水水产研究所提供。
[0054]1.1.2培养基:普通肉汤培养基为牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,琼脂20g，高压蒸汽灭菌。
[0055]1.1.3供试植物样品:柑橘皮、松针叶、松花粉、大蒜中提取物。柑橘黄酮、柑橘精油、松针叶提取松针粉、松花精油、大蒜素。(提取方法按照上文方式)
[0056]1.1.4仪器800型离心机:北京医学仪器厂；SW?CJ 一 2F超净工作台:苏州净化设备厂制造；电子天平:Sartorius Co, Germany公司制造；PW—30精密培养箱；UV — 2100分光光度仪:尤尼柯上海仪器有限公司制造；高效液相色谱仪:美国Agilent公司制造。
[0057]1.2实验方法
[0058]1.2.1各植物提取物的制备:按实施例1方法制备。
[0059]1.2.2茵悬液的制备
[0060]将菌株融化，用接种针在固体培养基上划线，37°C培养24h后，挑取单个菌落，接种到液体培养基上振荡培养12?16h。采用麦氏比浊法将菌液用液体培养基稀释到合适浓度。实验中菌液浓度为10CFU / mL。[0061]1.2.3抗茵活性的测定
[0062]I)滤纸方法(琼脂扩散法):滤纸片出_)经灭菌后，分别浸入提取物，无菌条件下贴在涂有菌液的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，并做空白对照，37C培养24h后测抑菌圈直径(尽可能地使纸片的含药量一致)，每种提取物8次重复。
[0063]2) 二倍稀释法:通过抑菌圈的测定筛选出有抑菌效果的植物提取物进行最小抑菌浓度(Minimumlnhibitory Concentration,MIC)的测定。采用二倍稀释法。对植物提取物进行梯度稀释至0.006~12.5mg/mL的12个2倍系列浓度。然后在盛有1.9mL肉汤培养基的试管中分别加入100L稀释后的药液，最后一管不加提取物作空白对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达到10CFU/mL。37°C培养24h，625nm测定吸光值，无菌生长的试管中的药物浓度即为该药物的最小抑菌浓度(MIC)。试验重复3次。
[0064]1.2.4正交t值法优化组合复方及剂量配比从抑菌活性试验中筛选出抑菌效果佳的提取物，利用正交t值法，以最小抑菌浓度为检测指标，对筛选出的提取物进行组方和剂量优化。
[0065]I)正交t值法优化组方原则:将筛选出来的提取物其中每种为一个因素，其代号随机选定，分别为A、B、C、D、E，每种提取物均有给药和不给药两个水平，设水平I为给药，水平2为不给药，结果见表1。各药在每组方中的用量采用正交试验中效果最优的剂量组合。试验选用正交t值表们进行试验安排，各组通过二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，每组3个重复，数据越小，抑菌效果越好。
[0066]表1复方5种成分因素水平分析表(单位:mg)
[0067]
【权利要求】
1.一种复合植物提取物饲料添加剂，其特征在于，由柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉、松花精油混合而成。
2.根据权利要求1所述的复合植物提取物饲料添加剂，其特征在于，由以下重量份比的原料组成: 松针粉150-200份； 柑橘精油10-15份； 大蒜素3-5份； 柑橘黄酮1-3份； 松花精油1_3份。
3.根据权利要求2所述的复合植物提取物饲料添加剂，其特征在于，由以下重量份比的原料组成: 松针粉180份； 柑橘精油12份； 大蒜素3.6份； 柑橘黄酮2.2份； 松花精油2.2份。
4.一种复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将柑橘精油、大蒜素、柑橘黄酮、松针粉和松花精油进行混合得到复合植物提取物饲料添加剂。
5.根据权利要求4所述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述柑橘精油的制备方法为:柑橘皮干燥后粉碎成柑橘粉，柑橘粉与水按照固液比1:5添加至蒸馏器，添加质量分数为2.0%的NaCL、蒸馏时间60min，蒸馏处所得为提纯柑橘精油。
6.根据权利要求4所述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述柑橘黄酮的制备方法为:柑橘皮粉末装入萃取池中，使用甲醇萃取技术提取，所述甲醇萃取技术提取柑橘皮中黄酮类化合物的工艺条件为:压力为10.3MPa，温度为70°C，萃取池的甲醇质量分数为80%，料液比为1:15，提取时间lOmin，得提取液，经过滤渣滓过滤得甲醇柑橘黄酮提取物，经氢氧化钠提取，可得柑橘黄酮。
7.根据权利要求4所述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述松针粉制备方法为:松针药材用沸水提取两次，过滤，把两次的滤液合并，浓缩至浸膏状，所得浸膏放置于4°C冰箱静置48h后，除去下层沉淀物，取上清液，真空干燥24小时得松针粉。
8.根据权利要求4所述的复合植物提取物饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述大蒜素提取方法为:将去皮蒜瓣捣碎制成蒜泥，大蒜破碎粒径为0.2mm,所述蒜泥在发酵温度为45°C，酶解时间为30min，酶解ph值为6.0条件下利用大蒜细胞破碎后产生的蒜氨酸酶酶解后，用乙醇浸提，离心，取上清液，在温度50°C、压力0.01MPa、转速75r / min的条件下，用旋转蒸发仪进行减压浓缩，得大蒜素。
【文档编号】A23K1/14GK103564197SQ201310571309
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】陆鹏 申请人:福建正源饲料有限公司