一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。具体地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10%二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。本发明的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性；能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性的稳定性，可直接应用于临床治疗，本发明适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存。
【专利说明】一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞保存【技术领域】，尤其涉及一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。
[0003]影响免疫细胞冻存和复苏活性的主要因素包括冷冻及复苏的方式和冷冻剂的选择。造成细胞损伤的两种因素一种是细胞内冰晶形成和重结晶，一般是由不适当的降温和复温导致；另一种是溶质损伤，一般是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所致。免疫细胞在-70°C~_80°C冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在_196°C时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。细胞冻存常用渗透性保护剂，有甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，DMSO可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，为免疫细胞冻存最理想的冷冻保护剂。目前国内冻存方法多采用的是DMS0、动物血清和细胞培养液按不同比例 搭配成的冻存液，优点是细胞保存时间长，缺点是冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；本发明的免疫细胞冻存液能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
[0005]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0006]在第一方面，本发明提供一种免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。
[0007]本发明的免疫细胞冻存液用人供体血浆代替动物血清，不但避免了引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性；而且用人供体血浆保存供体自身的免疫细胞，比用动物血清保存人免疫细胞能够更好地保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性。
[0008]本发明的免疫细胞冻存液并不排除其它成分的存在，比如生理盐水等。
[0009]优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10% 二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。[0010]本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比二甲基亚砜的含量比如可以是5%、6%、7%、8%、9% 或 10% 等，优选 10% ο
[0011 ] 本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比人供体血浆的含量比如可以是10%、12%、15%、20%、24%、28%、32%、40%、50%、60%、70%、80%、85% 或 89% 等，优选 10%。
[0012]本发明的免疫细胞冻存液按体积百分比免疫细胞基础培养基的含量比如可以是
0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 或 80% 等，优选 80%。
[0013]更优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比由5-10% 二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基组成，即仅含有上述体积百分比的三种成分。
[0014]进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10% 二甲基亚砜、10-40%人供体血浆和50-80%免疫细胞基础培养基。
[0015]更进一步优选地，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含10% 二甲基亚砜、10%人供体血浆和80%免疫细胞基础培养基。
[0016]本发明的免疫细胞冻存液中，所述免疫细胞基础培养基选自opTmizer?CTS?T-Cell Expans1n SFM 培养基或 RPM1-1640 培养基，可购自美国 GIBCO 公司。
[0017]在第二方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞冻存液的制备方法，所述方法包括将所述二甲基亚砜 、人供体血浆和免疫细胞基础培养基混合的步骤。
[0018]本发明对制备人供体血浆的方法不限，比如可以通过如下方法制备:将抗凝外周血于2000-2500rpm离心15_20min，吸取上层血浆，置于水浴锅中56 °C保持30min，然后2000-2500rpm离心5_10min,取上清，即自体血衆,4°C保存备用。
[0019]因此本发明免疫细胞冻存液的一个优选的制备方法包括:
[0020](I)制备人供体血浆；例如，可以通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，52_60°C、优选56°C水浴上层血衆25-35min、优选30min,然后离心弃沉淀的过程制备人供体血衆；和
[0021](2)将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基按配比混合，得到所述免疫细胞冻存液。
[0022]在第三方面，本发明提供一种免疫细胞的冻存方法，包括:
[0023](a)将免疫细胞悬浮于如第一方面所述的免疫细胞冻存液；和
[0024](b)进行程控降温至_80°C，然后转移至液氮中冷冻保存。
[0025]本发明程控降温的程序不限，比如可以是:第一步:4°C，等待；第二步:以1.(TC /分钟降至-3.(TC ;第三步:以10.(TC /分钟降至-20.(TC ;第四步:以1.(TC /分钟降至-40.(TC ;第五步:以10.(TC /分钟降至-80.(TC。
[0026]在第三方面，本发明提供如第一方面所述的免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。
[0027]优选地，所述免疫细胞为外周血单个核细胞，更优选自然杀伤细胞。
[0028]本发明的有益效果为:
[0029]本发明的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；本发明的免疫细胞冻存液能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，免疫细胞复苏后的活性达到90%，细胞生物学特性不发生变化，可应用于临床治疗，本发明适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存。
【具体实施方式】
[0030]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0031]实验材料及其来源:
[0032]1、实验环境:GMP实验室里的生物安全柜中操作。
[0033]2、试剂:opTmizerTMCTS?T-Cell Expans1n SFM 培养基(GIBC0，美国)、RPM1-1640培养基(GIBC0，美国)、SCGM培养基(Sigma公司)、GT-T551培养基(宝生物工程(大连)有限公司)、人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、胎牛血清(GIBC0，美国)、二甲基亚砜DMSO (WAK，德国)、肝素钠盐溶液(上海第一生化药业有限公司)、生理盐水(杭州民生药业)、L-谷氨酰胺(GIBC0，美国)、注射用甘露聚糖肽、抗人⑶16单抗、白细胞介素2。
[0034]3、器材:离心机(THERMO，美国)、T175培养瓶(NUNC，丹麦)、GT-A610培养袋(TAKARA,日本)、C02培养箱(三洋，中国)、程控降温仪(THERMO，美国)、生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司，香港)、50ml离心管(BD，美国)。
[0035]实施例1:制备人供体血浆
[0036]( 1)抽血:选两名志愿者(A和B),分别用50ml注射器抽取50ml外周血,肝素抗凝(也可以采用柠檬酸钠或EDTA等其它抗凝方式)。
[0037](2)取少量外周血进行梅毒螺旋体、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒和EB病毒等特异性病毒检测，均为阴性(表1)，证明两志愿者均为不携带上述病菌或病毒的健康个体。
[0038]表1志愿者血液检测结果
[0039]
【权利要求】
1.一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10% 二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比由5-10% 二甲基亚砜、10-90%人供体血浆和0.01-80%免疫细胞基础培养基组成。
4.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含5-10% 二甲基亚砜、10-40%人供体血浆和50-80%免疫细胞基础培养基。
5.根据权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液按体积百分比包含10% 二甲基亚砜、10%人供体血浆和80%免疫细胞基础培养基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞基础培养基选自 opTmizerTMCTS?T-Cell Expans1n SFM 培养基或 RPM1-1640 培养基。
7.如权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基混合的步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括: (1)制备人供体血浆； 优选地，通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，52-60°C、优选56°C水浴上层血浆25-35min、优选30min,然后离心弃沉淀的过程制备人供体血衆；和 (2)将所述二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基按配比混合，得到所述免疫细胞冻存液。
9.一种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，包括: Ca)将免疫细胞悬浮于权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液；和 (b)进行程控降温至_80°C，然后转移至液氮中冷冻保存。
10.如权利要求1-6任一项所述的免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用； 优选地，所述免疫细胞为外周血单个核细胞，更优选自然杀伤细胞。
【文档编号】A01N1/02GK104026118SQ201310571326
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年11月13日 优先权日:2013年11月13日
【发明者】项春生, 王大奎, 张翠翠 申请人:杭州易文赛生物技术有限公司