一种筛选不育株和选种的方法及其在育种中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种筛选不育株和选种的方法及其在育种中的应用。本发明的筛选不育株的方法包括：将具有第一种隐性基因的第一种水稻的植株与具有第二种隐性基因的第二种水稻的植株杂交获得杂交F1代，其中，该第一种隐性基因表达时表现为不育，该第二种隐性基因表达时表现为植株的特定部位的颜色特异性；以所述第一种水稻的植株为母本，杂交获得的F1代的种子所生长出的植株为父本进行回交，获得BC1F1代；BC1F1代植株自交，获得BC1F2代的种子；种植BC1F2代的种子，从而生长出多株BC1F2代植株，从所得植株中选出所述特定部位具有颜色特异性并且不育的植株。
【专利说明】一种筛选不育株和选种的方法及其在育种中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻两系不育系育种领域，具体地说涉及通过具有连锁的隐性基因的不育株来培育两系不育系。
【背景技术】
[0002]水稻是我国最重要的粮食作物之一，杂交水稻的发明为我国乃至世界的粮食安全作出了巨大贡献。杂交水稻发展经历了从三系到两系的过程，两系水稻与三系水稻相 t匕，不仅配组自由，制种程序简化，且产量和米质均有较大提高。按照两系不育基因的来源分类，可以分为两类，一类来源于农垦58S, —般被称为光敏不育基因(PGMS),生产上使用的代表不育系如培矮64S，7001S，这类不育系的花粉败育为典败；另一类来源于安农S-1， 常被称为温敏不育基因(TGMS，tms5, ptgms2_l)，代表的不育系有广占63s、1892S等，这类不育系在高温条件下常表现无花粉型，但是这两类起源的不育系后代常常表现光温互作型。目前，光敏不育基因已经被克隆，而温敏不育基因已被精细定位，Wang Y.G.(Fine mapping of the rice thermo-sensitive genic male-sterile gene tms5, Theor Appl Genet, 2003，107:917 - 921)等将 tms5 定位在第二染色体的 C365-1 和 G227-1 标记间，遗传距离 3.12cM。Peng H.F.等[Fine mapping of a gene for non-pollen type thermosensitive genic male sterility in rice(Oryza sativa L.)Theor Appl Genet, 2010, 120:1013 - 1020]将tms5基因定位在第二染色体的标记RMAN81和RMX21 间，两标记间的物理距离为 183Kb。Xu Jianjun 等[Fine mapping and candidate gene analysis of ptgms2_l, the photoperiod-thermo-sensitive genic male sterile gene in rice (Oryza sativa L.), Theor Appl Genet.2011，122 (2): 365-372]将其定位在第二染色体的两个Indel标记间,距离50.4Kb,该区间有10个基因,其中一个核糖核酸酶Z基因被认为是tms5的候选基因(L0C_0s02gl2290)，位于日本晴基因组第二染色体6.40M位置。
[0003]培育新的优良两系不育系，对于提高两系杂交稻的产量、品种和抗性都具有重要意义。目前，两系不育系的选择主要通过亲本材料与光/温敏不育系杂交，在后代选择株型理想的不育株。当前两系不育系的选择主要在正季进行，因为正季的高温长日照使不育基因纯合的植株表现不育，育种者通过观察花药和花粉，挑选雄性败育的单株，这个过程花粉镜检的工作量大，且短暂的花期过后将无法通过观察花药和花粉判别育性。另一方面，为加速育种进程，常在海南进行冬季加代种植，但是海南冬季为低温短日照条件，两系不育系表现可育，所以不育系筛选材料在海南冬季种植只 能加代，却无法筛选不育株。
[0004]我们的设想是寻找与不育基因紧密连锁的形态学标记，聚合形态学标记和不育基因，通过形态标记来筛选不育株，一方面可以简化不育株的筛选程序，减少工作量，另一方面也可以在海南可育条件下筛选不育系。
[0005]颖壳颜色作为一类重要的形态学标记，具有易识别的特点。当前，两系不育系新安S的颖壳呈棕色，但是这种颜色表达时期较晚，刚抽穗时颖壳为绿色，与普通水稻无明显区别，随后颜色逐渐加深，最后达到棕色(图1)，这种颜色表达可能是受光诱导。这对于繁殖田和制种田根据不育系颖壳颜色及早去杂不利，且未见新安S的壳色性状和不育性状连锁的报道。2006年，Zhang Kewei等(GOLD HULL AND INTERN0DE2 Encodes a Primarily Multifunctional Cinnamyl-Alcohol Dehydrogenase in Rice, Plant Physiology, 2006，140:972 - 983)克隆了一个调控木质素合成的基因(GH2，L0C_ 0s02g09490.1),该基因的隐性突变(gh2)使水稻颖壳颜色呈现红棕色，该基因位于日本晴基因组第二染色体4.87M位置，与tms5相距1.53Mb。gh2基因调控的颖壳还没抽穗时，在稻苞中就呈现红棕色，携带有gh2基因的花香B和新安S在抽穗时的颖壳颜色差异见图1。
[0006]如果将gh2和tms5基因进行聚合,选育出红棕色颖壳的两系不育系，并评价其在两系不育系育种中的价值，对简化和加速两系温敏不育系的选育和不育系及其杂交种F1的保纯都具有应用价值。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种筛选不育株的方法，所述方法包括:
[0008]将具有第一种隐性基因的第一种水稻的植株与具有第二种隐性基因的第二种水稻的植株杂交获得杂交F1代，其中，该第一种隐性基因表达时表现为不育，该第二种隐性基因表达时表现为植株的特定部位的颜色特异性；
[0009]以所述第一种水稻的植株为母本，杂交获得的F1代的种子所生长出的植株为父本进行回交，获得BC1F1代；
[0010]种植BC1F1代的种子，自交，获得BC1F2代的种子；
[0011]种植BC1F2代的种子，从而生长出多株BC1F2代植株，从所得植株中选出所述特定部位具有颜色特异性并且不育的植株。
[0012]进一步地,所述第一种水稻为1892S，所述第二种水稻为花香B。
[0013]进一步地，所述第一种隐性基因为tms5，所述第二种隐性基因为gh2，其中，所述第一种隐性基因tms5与所述第二种隐性基因gh2紧密连锁。·
[0014]进一步地，所述第一种隐性基因表达时表现为水稻的雄性不育，第二种隐性基因表达时表现为水稻的颖壳呈红棕色。
[0015]另一方面，本发明提供一种利用根据上述方法获得的不育株进行两系不育系选种的方法，该方法包括:
[0016]将所述不育株与目标植株进行杂交，获得第一代杂交种子；
[0017]种植第一代杂交种子，将所获得的植株与所述不育株或者目标植株进行回交获得回交植株的种子；
[0018]种植回交植株的种子并将所获得的植株进行自交；
[0019]筛选自交植株中所述特定部位具有颜色特异性的植株；
[0020]采集所筛选出的植株的种子。
[0021]另一方面，本发明提供一种利用根据上述方法获得的不育株进行两系不育系选种的方法，该方法包括:
[0022]将所述不育株与目标植株进行杂交，获得第一代杂交种子；
[0023]种植第一代杂交种子，并将所得植株进行自交；
[0024]筛选自交植株中所述特定部位具有颜色特异性的植株；[0025]采集所筛选出的植株的种子。
[0026]另一方面，本发明提供一种利用上述选种方法获得的种子在不育系培育、繁殖和制种过程中的应用，其特征在于，利用所培育不育系的所述特定部位的颜色特异性进行植株的去杂保纯。
[0027]另一方面，本发明提供一种利用上述选种方法获得的种子在防止不育系和杂交种的机械混杂中的应用，其特征在于，利用所培育不育系的种子的颜色特异性去除与该特异颜色不同的种子。
[0028]在一种实现方式中，本发明通过培育BC1F2群体，将紧密连锁的两个隐性基因gh2 和tms5聚合在一起，gh2基因使稻壳呈现红棕色，tms5使水稻表现两系温敏不育,聚合后的植株为两系不育系且壳红棕色。因为tms5和gh2紧密连锁，所以在选育新的不育系时可以通过将所得植株与目标植株进行杂交，然后自交在所得的分离群体中选择红棕色颖壳的单株，则所选单株具有不育特性，从而间接选择新的两系不育系，这种选择方式在正季和海南，从抽穗到成熟均能进行，从而打破了传统的不育系选择只能在正季长日照高温条件下开花期这段时间进行的限制，简化和加速了两系不育系的培育进程。
[0029]另一方面由于gh2为隐性基因，且与tms5连锁，gh2调控的红棕色颖壳与生产上的普通水稻颖壳明显不同，通过观察颖壳颜色可以实现不育系和杂交种F1的保纯，去除颜色并非红棕色的种子。
[0030]与已有技术相比，本发明有益效果体现在:
[0031](I)方便选择。当前不育系的选择主要是在正季进行，育种者需在花期，通过观察花药形态并结合花粉镜检结果，挑选雄性败育株，但识别败育的花药需要育种者具有较丰富的经验，且花粉镜检的工作量大，时间短。本发明通过对壳色的选择，间接实现对不育基因的筛选，由于颖壳颜色易识别，且可供选择的时间长，从抽穗到成熟都可以，从而简化了整个选择过程。
[0032](2)加速不育系筛选进程。为加速育种进程，常在海南进行冬季加代种植，但是海南冬季为低温短日照条件，两系不育系表现可育，所以不育系筛选材料在海南冬季种植只能加代，却无法筛选不育株。本发明的筛选方法则不受气候条件限制，在海南仍可进行筛选，因为壳色的表现不受日照长短和温度高低影响，从而加速不育系筛选进程。
[0033](3)便于去杂保纯。不育系的纯度对于杂交稻制种具有至关重要的作用。由于串粉、机械混杂、再生苗等时有发生，如不及时去杂，将导致不育系纯度降低。对于不育系繁殖田，当前去杂主要是通过观察株型，来提高不育系的纯度。株型观察对于植株差异大的杂株适用，而对株型差异小的杂株，将难以识别。制种田不育系去杂一般采用观察株型和散粉相结合的办法去杂，株型观察同样无法区分形态差异小的杂株，观察散粉常需在颖花开放后， 这种去杂方式风险大，因为开花散粉后，杂株的花粉可能已经污染到周围的不育系。本发明中的gh2基因为隐性基因，串粉和机械混杂株颖壳均表现绿色，只有纯合的不育系表现颖壳红棕色，通过观察颖壳颜色来去除颖壳杂色的单株，达到去杂的目的。
[0034](4)防机械混杂。不育系和杂交种Fl收获、晾晒和包装过程中，常易发生机械混杂，影响纯度。本发明产生的不育系及其制种获得的杂交稻Fl壳色均为棕色，一般的水稻种子为金黄色，所以如发生机械混杂，可以通过观察颖壳颜色将其识别出来。【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为新安S和花香B的颖壳颜色对比图。
[0036]图2为具有gh2基因和tms5基因的植株的颖壳和花粉染色图。
[0037]图3为普通水稻和具有gh2基因和tms5基因的水稻的成熟种子的对比图。
[0038]图4为p(X)在(0，1/2]区间的函数曲线，p(X)表示BC1F2群体和F2群体出现 gh2gh2 tms5tms5单株的频率差。
【具体实施方式】
[0039]以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
[0040]在一个实施例中，本发明采用1892S与花香B来获得BC1F2群体。其中，1892S为两系温敏不育系，含有tms5基因，花香B含有gh2基因，壳红棕色。
[0041]在本实施例中，将1892S与花香B杂交，获得杂交F1代。种植F1R的种子，再以 1892S的植株为母本，Fl的植株为父本回交，获得BC1F1代。种植BC1F1代的种子，分别以 BC1F1代的植株为父本和母本进行自交，获得BC1F2的种子，种植BC1F2群体3474株，开花期筛选壳红棕色且雄性不育的单株(图2)共计21株。以聚合了 tms5基因和gh2基因的红棕壳不育系(图3)为样本，与其他水稻杂交或回交，在自交后代中通过选择红棕色颖壳的水稻， 实现对不育基因的间接选择，从而简化不育系的筛选过程，缩短育种周期，且选择的不育系为红棕壳单株，该性状为隐性性状，易于区分其中可能混有的串粉或机械混杂株，保证不育系及其杂交种F1的纯度。
[0042]图1为新安S和花香B两种水稻的颖壳的颜色对比,其中a和b为新安S的水稻颖壳，c和d为花香B的水稻颖壳；a和c为刚抽穗时颖壳的颜色，新安S为绿色(b)，而花香B为红棕色(c) ；b和d为抽穗7天后颖壳颜色，新安S颖壳颜色加深(b)，而花香B颖壳颜色(d)较7天前无较大变化，仍为红棕色。虽然图中采用灰度图片进行描绘，而非采用彩色图片，但是，从图中依然可以看出颜色在深浅度上的区别。
[0043]图2为具有gh2基因和tms5基因的植株的颖壳和花粉染色图。其中，图2中a为花香B的植株，b为BC1F2群体中筛选的壳红棕色的不育株，即具有gh2和tms5的聚合体的植株，其基因型为gh2gh2 tms5tms5, c为1892s的植株。图2中的底部从左到右分别为花香B、红棕壳不育株、1892s的花粉染色结果，拍摄于2013年8月，高温长日照条件，花香B 花粉可染色，而红棕壳不育株和1892s为无花粉雄性败育。
[0044]图3为普通水稻和具有gh2基因和tms5基因的水稻的成熟种子的对比图。其中， a为普通水稻壳色,黄白色；b为gh2、tms5聚合体稻壳颜色,红棕色。
[0045]本发明之所以采用BC1F2群体来筛选基因型为gh2gh2 tms5tms5的单株,是因为本申请的发明人发现，采用BC1F2群体获得该基因型的概率要明显大于采用其他群体。下面， 申请人:对分别采用F2群体和BC1F2群体筛选双隐性基因纯合体的效率进行了比较。
[0046]本发明采用紧密连锁的gh2和tms5基因。本文中所说的“紧密连锁”是指遗传距离小于5.5cM的基因。当然，本发明还可以采用其它遗传距离小于5cM的连锁基因。优选地，本发明利用遗传距离小于4.7cM的隐性连锁基因。[0047]选择上述两种基因是因为这两种基因的遗传距离近，采用下面进一步描述的计算方法，可以计算出这两个基因间的遗传距离为4.6cM。
[0048]由于gh2和tms5基因连锁，且均为隐性基因。我们希望通过染色体交换，获得基因型为gh2gh2 tms5tms5的单株，该单株的表型为颖壳红棕色且不育。F2群体和BC1F2群体均可用来筛选这样的交换单株，但是哪个群体更有效，即出现gh2gh2 tms5tms5的频率更高，目前还不清楚。我们通过计算的方法，比较了这两种群体的筛选效率。
[0049]假定gh2和tms5之间的交换值为x(l/2≤x > 0)，则根据连锁遗传规律，可以推算出F2群体中基因型gh2gh2 tms5tms5单株出现的频率为f (x)=x2/4。在BC1F2群体中 gh2gh2 tms5tms5 单株出现的频率为 g (x) =x/8+(l_x) x2/8。令 p (x) =g (x)-f (x),如果需要判断BC1F2群体和F2群体中，哪个群体出现gh2gh2 tms5tms5单株的频率高,只需要检验在 1/2≤x>0范围内，p(X)的值是大于0还是小于O。
[0050]p (X) =g (X)-f (X) =x/8+(1-x) x2/8_x2/4=l/8 (x-x2-x3) (1/2 ^ x > 0)
[0051]求端点值，p(0)=0, p (0.5) =1/64。
[0052]求p(x)的极值，对 p(x)求导,p，(x)=l/8(l-2x_3x2),令 p’(x)=0,可求得 x=l/3, 则 p (1/3) =5/216，由于 p (1/3) >p (0.5)，所以 p (1/3)为 p (x)的极大值。
[0053]对p，(X)再次求导,得p” (x)=l/8(-2_6x),在1/2≤x > 0取值范围内永远小于 O0
[0054]p(x)的函数图形如图4所示，且p (X)的取值范围为(0,5/216]，当交换值x=l/3 时，达到最大值。
[0055]可见交换值X在1/2≤X > 0区间内，p (X)值永远大于0，说明利用BC1F2群体获得gh2gh2 tms5tms5单株的概率要大于F2群体。
[0056]tms5矛口 gh2基因的聚合
[0057]为了要获得基因型为gh2gh2 tms5tms5 的单株，我们将 1892S(GH2GH2 tms5tms5) 和花香B(gh2gh2 TMS5TMS5)杂交，收获的种子为F1，种植F1，并让其自交，收获自交的种子， 首先获得F2群体；将1892S和花香B杂交的F1花粉授予1892s，收获结实的种子(BC1F1代)， 播种BC1F1代的种子，并让所得植株进行自交，获得BC1F2群体；同时在海南种植1892S和花香B的F2小群体(50株)，混收其中的红棕色壳单株(12株)种子，制备出红棕壳F3群体。
[0058]正季同时种植F2群体、红棕壳F3群体和BC1F2群体，其中F2群体共计3128株，红棕壳F3群体3668株，BC1F2群体3474株。
[0059]在这三个群体中，筛选红棕壳的不育单株，结果F2群体和红棕壳F3群体均未获得红棕壳的不育单株，但是在BC1F2群体中共找到21株红棕壳不育单株(图2)。这说明BC1F2 群体在聚合连锁的双隐性基因的能力强于F2群体和红棕壳F3群体。
[0060]tms5和gh2间的遗传距离计算
[0061]根据BC1F2群体,共计3474株,有21株红棕壳不育单株的结果,可以计算出tms5 和gh2间的交换值。
[0062]即:g (x)=x/8+(l_x)x2/8=21/3474，这是一个一元三次方程，可以求解出在 l/2>x>0范围内,x=0.046,也就是说tms5和gh2的遗传距离为4.6cM。
[0063]同时，tms5位于日本晴第二染色体6.40M位置，而gh2位于日本晴第二染色体的
4.87M位置，根据水稻基因组平均每个CM物理距离约300Kb，可以计算出两者之间的遗传距离为5.1cM,与我们实际计算值接近。
[0064]根据BC1F2群体计算出来的tms5和gh2的遗传距离4.6cM,可以计算出F2群体出现 gh2gh2 tms5tms5 单株的概率只有 f (0.046)=0.0462/4=0.000529,而 BC1F2 群体中出现 gh2gh2 tms5tms5 单株的概率为 g (0.046) =0.046/8+(1-0.046) X 0.0462/8=0.006，这个概率是F2群体的11.3倍，所以用BC1F2群体聚合紧密连锁的双隐性基因效率远高于F2群体。
[0065]通过选择壳色筛选不育系的准确度评估
[0066]聚合tms5和gh2基因的一个重要应用就是通过选择壳色间接筛选不育系。tms5 和gh2的遗传距离为4.6cM，所以利用gh2基因筛选tms5基因的准确度需要作出评估，即全部为红棕色颖壳的水稻中不育株占的比例有多大。
[0067]以gh2gh2 tms5tms5的聚合体水稻与普通水稻(基因型为GH2GH2 TMS5TMS5)杂交得到F1代，种植多株F1代，进行自交获得F2代，在F2群体中筛选gh2gh2基因型的红棕壳单株，其中的不育株条件概率为:
[0068]P(tms5tms5|gh2gh2)=P(tms5tms5 gh2gh2)/P(gh2gh2) = (l~x) 2=0.910
[0069]其中至少携带有一个tms5基因(即基因型为tms5_，_表示为tms5或TMS5)的条件概率为:
[0070]P(tms5_Igh2gh2)=P(tms5_gh2gh2)/P(gh2gh2)=1-X2=0.998
[0071]这说明在F2群体中，筛选出的红棕壳单株中,有99.8%单株都携带至少一个tms5 基因，91%的单株为不育系(基因型为tms5tms5)，8.8%的单株基因型为tms5TMS5，尽管这些单株可育，但是由于它们携带有tms5基因，自交一代后仍可以分离出不育系。
[0072]同理,可以推算出在回交后代中，筛选红棕壳单株，获得tms5tms5和tms5_基因型的条件概率(见表1)。
[0073]如:在B C1F2 群体中，P(tms5tms5|gh2gh2) = (l_x)3 = 0.868， P(tms5_Igh2gh2)=0.952 ；
[0074]BC2F2 群体中，P (tms5tms5 | gh2gh2) =0.828, P (tms5_ | gh2gh2) =0.908。
[0075]回交n 代，P (tms5tms5 | gh2gh2) = (l_x)2+n，P (tms5_ gh2gh2) = (l_x)n(l_x2)。
[0076]可见，由于gh2和tms5紧密连锁，根据条件概率计算可知，选择红棕壳单株获得不育株或携带不育基因的单株准确性很高，回交2代后，准确率仍在80%以上。。
[0077]表1各个世代筛选的红棕色单株为tms5tms5和tms5_基因型的条件概率
[0078]
【权利要求】
1.一种筛选不育株的方法，所述方法包括:将具有第一种隐性基因的第一种水稻的植株与具有第二种隐性基因的第二种水稻的植株杂交获得杂交F1代，其中，该第一种隐性基因表达时表现为不育，该第二种隐性基因表达时表现为植株的特定部位的颜色特异性；以所述第一种水稻的植株为母本，杂交获得的F1代的种子所生长出的植株为父本进行回交，获得回交BC1F1代的种子；种植BC1F1代的种子，自交，获得BC1F2代的种子；种植BC1F2代的种子，从而生长出多株BC1F2代植株，从所得植株中选出所述特定部位具有颜色特异性并且不育的植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一种水稻为1892S，所述第二种水稻为花香B。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一种隐性基因为tms5，所述第二种隐性基因为gh2，其中，所述第一种隐性基因tms5与所述第二种隐性基因gh2紧密连锁。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一种隐性基因表达时表现为水稻的雄性不育，所述第二种隐性基因表达时表现为水稻的颖壳呈红棕色。
5.一种利用根据权利要求1-4所述的方法获得的不育株进行两系不育系选种的方法， 该方法包括:将所述不育株与目标植株进行杂交，获得第一代杂交种子；种植第一代杂交种子，将所获得的植株与所述不育株或者目标植株进行回交获得回交植株的种子；种植回交植株的种子并将所获得的植株进行自交；筛选自交植株中所述特定部位具有颜色特异性的植株；采集所筛选出的植株的种子。
6.一种利用根据权利要求1-4所述的方法获得的不育株进行两系不育系选种的方法， 该方法包括:将所述不育株与目标植株进行杂交，获得第一代杂交种子；种植第一代杂交种子，并将所得植株进行自交；筛选自交植株中所述特定部位具有颜色特异性的植株；采集所筛选出的植株的种子。
7.一种利用根据权利要求5-6所述的方法获得的种子在不育系培育、繁殖和制种过程中的应用，其特征在于，利用所培育不育系的所述特定部位的颜色特异性进行植株的去杂保纯。
8.一种利用根据权利要求5-6所述的方法获得的种子在防止不育系和杂交种的机械混杂中的应用，其特征在于，利用所培育不育系的种子的颜色特异性去除与该特异颜色不同的种子。
【文档编号】A01H1/02GK103583353SQ201310582794
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】宋丰顺, 杨剑波, 倪大虎, 倪金龙, 杨亚春 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所