用植酸改善植酸酶的稳定性以及包含植酸酶和植酸的组合物的制作方法

用植酸改善植酸酶的稳定性以及包含植酸酶和植酸的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供改善的方法和包含植酸酶和植酸的组合物。在一些实施例中，改善的植酸酶稳定性得以实现并且在诸如改善的动物饲料组合物之类的领域中采用。所述植酸酶和植酸功能邻近，优选在多层型颗粒或包含这种多层型颗粒的丸粒中。
【专利说明】用植酸改善植酸酶的稳定性以及包含植酸酶和植酸的组合 物
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2012年2月7日提交的系列号为61/595,923的美国临时专利申请的 优先权，特此将该专利以引用的方式并入本文。

【技术领域】
[0003] 本教导内容还涉及用植酸稳定植酸酶的方法。本教导内容还涉及包含植酸酶和植 酸的组合物、颗粒（granule)、丸粒（pellet)和酶溶液。另外，本教导内容涉及制备包含植 酸酶和植酸的组合物的方法；改善植酸酶的稳定性（包括热稳定性）的方法；改善植酸酶 的恢复活性（recovered activity)的方法；以及制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法。 本教导内容还涉及使用本教导内容的组合物、颗粒、丸粒、丸粒改善组合物和酶溶液来制备 热处理食品或动物饲料丸粒的方法。

【背景技术】
[0004] 活性剂如酶在食品和动物饲料中的使用是普遍的。酶已知可改善食品或动物饲料 的消化率、减少食品和动物饲料中的抗营养因子和改善动物生产率。
[0005] 当与干饲料混合物比较时，饲料丸粒具有受本行业欢迎的性质，如改善的饲料品 质、降低的病原体、制造期间较低的粉尘水平、良好的处理性和更均匀的成分配量。
[0006] 在通过例如热处理、高压、剪切应力和化学处理（如pH、表面活性剂和溶剂）进行 的工业食品和饲料加工（如制丸（pelleting))期间可发生酶失活。如果在加工后，例如在 蒸气处理和制丸后冷却时，酶再活化，则该失活是至少部分可逆的；如果在加工后，例如在 蒸气处理和制丸后冷却时催化活性不恢复，则该失活是不可逆的。酶的不可逆失活和活性 降低通常是诸如制丸之类的工艺中不期望的。
[0007] 优选的工业制丸工艺在称为调理的处理中利用蒸气喷射，其在制丸步骤之前添加 水分并提高温度，这迫使蒸气加热的饲料成分或经调理的糊料穿过模具。制丸工艺温度可 为约70°C至95°C或更高。
[0008] 由于制丸工艺中所用的蒸气、温度、压力或化学品，酶的活性或效能在加工和随后 的储存过程中通常显著降低。该问题通过这样的事实来说明：饲料酶通常以稳定化的液体 产品提供给本行业，在制丸工艺后将该液体产品喷涂在饲料丸粒上以避免酶失活。当在制 丸后施加酶（例如通过将酶喷涂于丸粒上）时难以实现均匀的配量，并且在制丸后添加酶 的设备费用高。或者，可在制丸之前将液体酶制剂或干混合酶制剂添加至混合器。在某些 情况下，可能要添加比原本所需的酶水平高的酶水平来补偿制丸过程中的损失。
[0009] 在食品和饲料行业中，对在经受蒸气处理制丸工艺的制剂中充当组分而无可测量 的酶活性损失的稳定、耐用的酶颗粒剂存在需要。
[0010] 避免工业过程中不可逆地使酶失活或减少酶活性的问题的方法包括鉴别新的酶 来源（如在极端嗜热微生物中鉴别已知的酶）或鉴别使已知酶稳定化的手段。
[0011] Klibanov, 1983, (Stabilization of Enzymes against Thermal Inactivation, Advances in Applied Microbiology (《应用微生物学进展》），第 29 卷，第 1-28页）公开说，存在三种使酶稳定的基本手段：（1)固定化，（2)化学修饰和（3)增添添 加剂。然而，Klibanov(1983)还公开说，这些方法中的任一种均可导致稳定化或脱稳定化， 或根本没有效果。
[0012] Pace和Grath(J Biol Chem(《生物化学杂志》）255:3862, 1980)声称，酶在其底 物、辅酶或与其特异性结合的任何小分子的存在下导致稳定性增加，因为与天然状态结合 可改变去折叠平衡而降低酶去折叠状态的浓度。
[0013] EP0969089公开说，氨基酸置换可影响植酸酶的稳定性，一些置换具有稳定化效果 而另一些则具有失稳效果，并且一些氨基酸置换根本没有效果。
[0014] 植酸（或当处于盐形式时的植酸盐）存在于许多植物组织尤其是麸皮、种子和谷 类中。单胃动物如猪、家禽、鱼和人对植酸磷的消化差，因为它们在肠中缺少或具有低水平 的消化酶植酸酶。
[0015] EP0619369和US5554399公开了包含植酸酶和酸性磷酸酶的组合物以及该酶组合 物在食品、制丸的饲料和草料中的用途。
[0016] W02004071218公开了增加食品中的矿物质的量。W02004071218公开了包含活性 植酸酶、植酸盐和必需的阳离子的制备物。W02004071218公开说，可将该制备物添加至供人 消费的任何食品或饮用品或添加至诸如咖喱粉之类的调味品。
[0017] EP0420428公开了通过使用植酸、植酸盐或者植酸或植酸盐的异构体或水解产物 (包括肌醇）与脱磷酸化酶组合的混合物来治疗类风湿性关节炎的方法。植酸或植酸盐可 吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。
[0018] US4952396公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物 (包括肌醇）的化合物或任何这些化合物的组合的混合物来抑制肿瘤生长的方法。植酸或 植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。
[0019] US5112814公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物 (包括肌醇）的化合物或者任何这些化合物的组合的混合物来治疗帕金森氏病的方法。植 酸或植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，可将该组合物与水解磷酸基团的 酶如植酸酶一起使用。
[0020] US4758430公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物 的化合物或者任何这些化合物的组合的混合物来治疗阿尔茨海默病的方法。植酸或植酸盐 可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。
[0021] EP0969089公开了使包含植酸酶和一种或多种稳定剂的酶制剂稳定的方法，所述 稳定剂选自：C5糖；分子量为600至4000Da的聚乙二醇；丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠 盐；羧甲基纤维素；和海藻酸盐。作为备选，EP0969089公开说，植酸酶可通过与戊二醛交联 或通过用高碘酸钠氧化以及与己二酸二肼反应来稳定化。
[0022] W09316175公开了通过添加尿素和/或多元醇如山梨醇和甘油来稳定化并施加至 制丸的饲料物质的液体植酸酶制剂。W09316175的稳定化液体制剂更耐受酶活性的热失活 并且可储存更长时间周期，植酸酶活性保持性更好。
[0023] Singh 和 Satyanarayana (Bioresource Technology (《生物资源技术》），2009 ; 100:2046-2051)公开了从嗜热霉菌嗜热侧抱霉（Sporotrichum thermophile)纯化和 表征组氨酸酸性磷酸酶（HAP)植酸酶。Singh和Satyanarayana (2009)通过在60 °C 和80°C、pH 3. 0、5. 0和7. 0缓冲液下温育该植酸酶测定了该酶的热稳定性。Singh和 Satyanarayana(2009)测定了 80°C下稳定剂甘油、海藻糖、山梨醇和植酸对酶活性的影响。
[0024] 本教导内容寻求克服这些问题中的一些问题。例如，本教导内容可解决与食品和 动物饲料工业过程对植酸酶的影响相关的问题。
[0025] 为了便于参考，我们在一个或多个标题下描述了本教导内容的要素。注意，在所述 标题每一者下的教导内容也适用于其他标题下的教导内容。例如，关于本教导内容的使用 的所述实施例和方面的每一者同样是关于本教导内容的方法或本教导内容的组合物。同样 地，关于本教导内容的方法或使用的所述实施例和方面的每一者同样是关于本教导内容的 组合物的实施例或方面。


【发明内容】

[0026] 在一些实施例中，本教导内容提供了增加组合物中植酸酶的稳定性的方法，该方 法包括将至少10毫重量摩尔浓度（millimolal)的植酸引入至所述组合物，其中所述植酸 酶和所述植酸功能邻近。
[0027] 在一些实施例中，本教导内容提供了包含植酸和植酸酶的颗粒组合物，其中所述 植酸酶和所述植酸功能邻近。
[0028] 在一些实施例中，本教导内容提供了改善在将固体状态的植酸酶与至少一种食品 或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混合物制丸后所述植酸酶的恢复活性的方法， 该方法包括：将浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸提供给该植酸酶；将所述植酸酶与 至少一种食品或动物饲料成分混合；以及以蒸气处理将所得的混合物制丸，其中与未通过 至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的恢复活性高至少 15%、至少17%、至少19%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%或至少30%。
[0029] 在一些实施例中，本教导内容提供了包含颗粒的丸粒组合物，其中所述颗粒包含 功能邻近的植酸和植酸酶，其中植酸的浓度为至少10毫重量摩尔浓度。
[0030] 在一些实施例中，本教导内容提供了制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法，包 括如下步骤：将根据权利要求17-30和32-36中的任一项所述的组合物与至少一种食品或 动物饲料成分混合；以及利用蒸气将所得的混合物制丸。
[0031] 在一些实施例中，本教导内容提供了制造饲料组合物的方法，包括如下步骤：将饲 料组分与包括芯和涂层的颗粒混合，其中该芯包含功能邻近的植酸酶和植酸；蒸气处理所 述组合物，并将所述组合物制丸。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 本教导内容将参考如下附图进行描述：
[0033] 图1示出了相对于制丸之前糊料的植酸酶活性的在90°C或95°C下制丸后获得的 恢复植酸酶活性。
[0034] 图2示出了含有和不含有15mM植酸的0. 5mg/ml植酸酶的DSC Tm差示扫描量热 法图。
[0035] 图3示出了含有和不含有15mM肌醇的0. 5mg/ml植酸酶的DSC Tm差示扫描量热 法图。
[0036] 图4示出了 DSC Tm对植酸浓度的图。（0· 5mg/ml植酸酶。）
[0037] 图5示出了 DSC Tm对植酸浓度的图，将BP17 EDT与Ronozyme P-(CT)(来自帝斯 曼公司（DSM)的一种市售的植酸酶）进行了比较。
[0038] 序列
[0039] SEQ ID NO: 1 = BP17,布丘氏菌属物种（Buttiauxella sp.)的变体植酸酶，与缺 少信号序列（SEQ ID N0:12)的野生型（SEQ ID N0:4)相比包含12个氨基酸置换。
[0040] SEQ ID N0:2 = BP11，布丘氏菌属物种的变体植酸酶，与缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)的野生型（SEQ ID NO:4)相比包含11个氨基酸置换。
[0041] SEQ ID N0:3 = BP111，布丘氏菌属物种的变体植酸酶，与缺少信号序列（SEQ ID NO: 12)的野生型（SEQ ID N0:4)相比包含21个氨基酸置换。
[0042] SEQ ID N0:4 =缺少信号序列（SEQ ID N0:12)的由以登录号NCMB41248保藏的 布丘氏菌属菌株P 1-29编码的野生型植酸酶。
[0043] SEQ ID N0:5 =具有额外的氨基酸置换E121T的BP17。
[0044] SEQ ID N0:6 =具有额外的氨基酸置换P394N的BP17。
[0045] SEQ ID N0:7 =具有额外的氨基酸置换D386N的BP17。
[0046] SEQ ID N0:8 =具有额外的氨基酸置换K202N和N204T的BP17。
[0047] SEQ ID N0:9 =具有额外的氨基酸置换Q151N和P153S的BP17。
[0048] SEQ ID N0:10 =具有额外的氨基酸置换P373T的BP17。
[0049] SEQ ID N0:11 =具有额外的氨基酸置换Q76N的BP17。
[0050] SEQ ID N0:12 =野生型（SEQ ID N0:4)的信号序列。

【具体实施方式】
[0051] 除非另外指明，否则本教导内容的实施将采用分子生物学的常规技术（包括重组 技术）、微生物学的常规技术、细胞生物学的常规技术、生物化学的常规技术和动物饲料制 丸的常规技术，这些常规技术在本领域技术内。这类技术在例如以下的文献中充分解释： Molecular Cloning:ALaboratory Manual (〈〈分子克降:实验室手册》)，第二版（Sambrook等 人，1989) ：01igonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》）（M. J. Gait 编辑，1984 ；Current Protocols in Molecular Biology (《现代分子牛.物学实骑技术》)(F. M. Ausubel等人编辑， 1994) :PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR :聚合酶链反应》）（Mullis 等人编辑， 1994) ：GeneTransfer and Expression: A Laboratory Manual (《基因转移和表达：实验室 手册》）（Kriegler, 1990)，以及Fairfield, D. 1994.第 10 章 ，Pelleting Cost Center.载于： Feed Manufacturing Technology IV (饲料制造技术 IV). (McEllhiney 编辑），弗吉尼亚州 阿灵顿县的美国饲料行业协会（American Feed Industry Association, Arlington, Va.), 第 110-139 页。
[0052] 除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本教导内容 所属领域普通技术人员技术通常所理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (《微生物学和分子生物学词典》），第二版，纽约约 翰威立国际出版公司（John Wiley and Sons, New York) (1994),以及 Hale 和 Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology (《哈拍柯林斯生物学词典》)，纽约哈拍永久出版 社（Harper Perennial, NY) (1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。与 本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本教导内容的实践或 测试。
[0053] 本文提供的数字范围包括限定该范围的数字。
[0054] 除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左 至右以氨基至羧基取向写出。
[0055] 定义
[0056] 如本文所用，术语"植酸"是指肌醇六磷酸（IP6)，但是由于IP6通常不以纯的形式 存在，所以该术语还涵盖作为IP6的分解代谢产物的磷酸肌醇，包括肌醇五磷酸（IP5)、肌 醇四磷酸（IP4)、肌醇三磷酸（IP3)、肌醇二磷酸（IP2)和肌醇一磷酸（IP1)、它们的盐以及 它们的混合物。术语"植酸"不指肌醇，肌醇为植酸的完全水解产物（ΙΡ0)。因而，术语"植 酸"涵盖分解代谢产物、水解产物、盐和类似物（如酯和盐）。如本文所用，术语IP6、IP5、 IP4、IP3、IP2、IP1及它们的盐是指该特定肌醇磷酸（盐）的任何异构体。
[0057] 而处于盐形式的IP6、IP5、IP4、IP3、IP2和IP1通常称为"植酸盐"，如本文所用， 术语"植酸"还包括这类植酸盐。植酸盐的抗衡离子通常是钠（如植酸钠）。然而抗衡离子 可以是例如钙、镁、铁或锌。
[0058] 因而，本文所用的术语"植酸"包括对植酸的酸形式和盐形式的指代。在某些实施 例中，植酸为酸形式或酸形式的组合。在某些实施例中，植酸为盐形式或盐形式的组合。在 某些实施例中，植酸是酸形式（或酸形式的组合）和盐形式（或盐形式的组合）的组合。
[0059] 如本文所用，术语"毫重量摩尔浓度"是用于液体和固体二者。
[0060] 用于溶液（液体）的术语"毫重量摩尔浓度"在本文中是如科学文献中定义使用-即溶液的重量摩尔浓度被定义为组分（其在这里为植酸）的摩尔量除以单位为千克的溶剂 质量（其在这里为溶液中除了植酸之外的任何东西）。因而，1，〇〇〇毫重量摩尔浓度等同于 1重量摩尔浓度。
[0061] 在本文中用于固体的"毫重量摩尔浓度"定义为植酸的量（单位为毫摩尔）除以 固体（如颗粒的酶层）的溶剂的质量，其中溶剂定义为非植酸固体（如在包含植酸酶和植 酸的颗粒酶层中的非植酸固体）。
[0062] "饲料"和"食品"分别意指旨在用于或适合于分别由非人动物和人吃、摄取、消化 的任何天然的或人工的饮食、膳食等或这类膳食的组分。
[0063] 如本文所用，术语"食品"在广义上使用-并且涵盖用于人的食品和食物产品以及 用于非人动物的食品（即饲料）。
[0064] 术语"饲料"用于指在动物饲养中喂养给动物的产品。术语"饲料"和"动物饲料" 可互换使用。在一个优选的实施例中，食品或饲料是供非反刍动物和反刍动物消费。反刍 动物的例子包括乳牛、绵羊、山羊和马。非反刍动物的例子包括单胃动物如猪、家禽（如鸡 和火鸡）、鱼（如鲑鱼）、狗、猫和人。
[0065] 食品或饲料可以是溶液的形式或可以为固体-这取决于用途和/或施加的模式和 /或施用模式。在一些实施例中，本文提及的酶可以用作食品或饲料物质或用于食品或饲料 物质的制备或生产。
[0066] 如本文所用，术语"食品或饲料成分"包括制剂，该制剂被或可被添加至食品或食 物并且包括可在广泛产品中以低水平使用的制剂。食品成分可以是溶液的形式或可以为固 体-这取决于用途和/或施加的模式和/或施用模式。本文描述的酶可以用作食品或饲料 成分或可用于制备或生产。该酶可以是食品补充剂或可以添加至食品补充剂。
[0067] 用于单胃动物的饲料组合物通常包括包含含有植酸盐的植物产品的组合物。这类 组合物包括基于玉米粉、大豆粉、菜籽粉、棉籽粉、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱的饲料。本文所 述的酶可以是（或可添加至）食品或饲料物质和组合物。
[0068] 本教导内容还提供了制备食品或饲料成分或补充剂的方法，该方法包括将通过本 说明书的工艺制备的酶、或本说明书的经修饰的酶或包含根据本说明书的酶的组合物与另 一食品成分一起混合或添加。制备饲料或食品成分的方法是本发明的另一个实施例。这类 方法可涉及制丸。为了制备食品或饲料成分，可以固体、诸如预混物之类的制剂或液体的形 式添加本说明书的酶。
[0069] 如本文所用，术语"氨基酸序列"与术语"多肽"、"蛋白质"和"肽"是同义词，并且 可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为"酶"。使用常规的氨基 酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向（即，N - C) 提供。
[0070] 术语"核酸"涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单 链或双链的，而且可为化学修饰物。术语"核酸"与"多核苷酸"可互换使用。由于遗传密 码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法 涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向 给出。
[0071] 所谓"同源物"，应当意指对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有指定程度的同一 性的实体。同源序列被认为包括与对象序列具有至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序 列，该同一性使用常规的序列比对工具Clustal V采用默认参数测量。通常，同源物将包括 与对象氨基酸序列相同的活性位点残基，但可包括任何数目的保守氨基酸置换。示例性的 保守氨基酸置换在如下保守氨基酸置换表中列出。
[0072] 保守氨某酸置换
[0073]

【权利要求】
1. 一种增加组合物中的植酸酶的稳定性的方法，所述方法包括将至少10毫重量摩尔 浓度的植酸引入至所述组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植酸酶和植酸在溶液中。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植酸酶和植酸处于固体状态。
4. 根据权利要求1或3所述的方法，其中将所述植酸酶和植酸喷雾干燥于固体支持物 上。
5. 根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中将所述植酸酶和植酸掺入进颗粒中。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述颗粒是多层型颗粒。
7. 根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中将所述植酸酶和植酸掺入进多层型颗 粒的相同层中。
8. 根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中将所述颗粒包括在食品或动物饲料丸 粒中，其中在食品或动物饲料制丸后恢复活性百分比为至少65%、至少70%、至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓 度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少1°C、至少1. 3°C、至少 1. 4°C或至少 1. 5°C。
10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔 浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少2°C、至少4°C、至少 6°C、至少7°C、至少7. 5°C、至少7. 6°C、至少8°C。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在将所述稳定化的植酸酶与至少一 种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混合物制丸后，所述植酸酶活性比未通 过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少15%、 至少17%、至少19%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%或至少30%。
12. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在将所述稳定化的植酸酶与至少一 种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混合物制丸后，所述植酸酶活性比至少 10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围的浓度下的对照植酸酶的植酸酶活性高至 少15%、至少17%、至少19%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%或至少30%。
13. 根据权利要求11或12所述的方法，其中所述食品或动物饲料是液体。
14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是植酸酶BP17。
15. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是Ronozyme P-(CT)。
16. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是在包含内切-N-乙酰 氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉属（Trichoderma)宿主细胞中产生的植酸酶BP17。
17. -种包含植酸和植酸酶的颗粒组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近。
18. 根据权利要求17所述的组合物，其中所述植酸是至少10毫重量摩尔浓度、至少20 毫重量摩尔浓度、至少30毫重量摩尔浓度、至少50毫重量摩尔浓度、至少80毫重量摩尔浓 度或至少100毫重量摩尔浓度，其中所述植酸酶以不超过500毫重量摩尔浓度、400毫重量 摩尔浓度、300毫重量摩尔浓度、200毫重量摩尔浓度、150毫重量摩尔浓度或100毫重量摩 尔浓度存在。
19. 根据权利要求18所述的组合物，其中所述植酸是10-100毫重量摩尔浓度、20-90 毫重量摩尔浓度、30-80毫重量摩尔浓度或40-70毫重量摩尔浓度。
20. 根据权利要求17-19中任一项所述的组合物，其中与对照植酸酶相比所述植酸酶 是稳定的。
21. 根据权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中所述植酸酶和植酸喷雾干燥于 固体支持物上。
22. 根据权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中所述植酸酶和植酸掺入于多层 型颗粒中。
23. 根据权利要求22所述的组合物，其中所述植酸酶和植酸掺入于所述多层型颗粒的 相同层中。
24. 根据权利要求20所述的组合物，其中所述稳定性包括增加的DSCTm。
25. 根据权利要求24所述的组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植 酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSCTm增加至少1°C、至少1. 3°C、至少1. 4°C或 至少1. 5°C。
26. 根据权利要求20所述的组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度 的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少2°C、至少4°C、至少6°C、 至少7°C、至少7. 5°C、至少7. 6°C、至少8°C。
27. 根据权利要求17-26中任一项所述的组合物，其中与未通过植酸来稳定的对照植 酸酶相比，在将所述植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混 合物制丸后，所述植酸酶的恢复活性高至少15%、至少17%、至少19%、至少20%、至少 23%、至少25%、至少27%或至少30%。
28. 根据权利要求17-26中任一项所述的组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量 摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的恢复活性相比，在将所述稳定化的植酸酶与至少一 种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混合物制丸后，所述植酸酶的恢复活性 高至少15%、至少17%、至少19%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27%、至少30%、 至少32%、至少35%、至少40%、至少42%或至少45%。
29. 根据权利要求17-28中任一项所述的组合物，所述组合物包含由所述植酸酶水解 所述植酸而得到的低级磷酸肌醇，包括肌醇六磷酸、肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、 肌醇二磷酸、肌醇一磷酸以及它们的混合物。
30. 根据权利要求17-29中任一项所述的组合物，其中所述植酸酶是植酸酶BP17或 Rononzyme P_(CT)〇
31. 根据权利要求17-30中任一项所述的组合物，其中所述植酸酶是在包含内切-N-乙 酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉属宿主细胞中产生的植酸酶BP17。
32. -种改善在将固体状态的植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处 理将所得的混合物制丸后所述植酸酶的恢复活性的方法，所述方法包括： 将浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸提供给所述植酸酶； 将所述植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合；以及 以蒸气处理将所得的混合物制丸， 其中与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶 的恢复活性高至少15%、至少17%、至少19%、至少20%、至少23%、至少25%、至少27% 或至少30%。
33. -种包含颗粒的丸粒组合物，其中所述颗粒包含功能邻近的植酸和植酸酶，其中植 酸的浓度为至少10毫重量摩尔浓度。
34. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述颗粒是多层型颗粒。
35. 根据权利要求34所述的组合物，其中所述植酸酶和植酸掺入于所述多层型颗粒的 相同层中。
36. 根据权利要求17-31和33-35中任一项所述的、根据权利要求1-16和32中任一项 制备的组合物，其中所述颗粒还包含硫酸钠芯，其中所述植酸和植酸酶被包含在围绕所述 硫酸钠芯的层中，其中所述植酸和植酸酶层包含淀粉、蔗糖和油菜籽油，所述组合物还包括 包含硫酸钠的第一外涂层和包含PVA和滑石粉的第二外涂层。
37. 根据权利要求17-31和33-35中任一项所述的、根据权利要求1-16和32中任一项 制备的组合物，其中所述颗粒还包含硫酸钠芯，其中所述植酸和植酸酶被包含在围绕所述 硫酸钠芯的层中，其中所述植酸和植酸酶层包含淀粉、蔗糖和油菜籽油，所述组合物还包括 包含PVA和滑石粉的第一外涂层、包含蔗糖和淀粉的第二外涂层和含有PVA和滑石粉的第 三外涂层。
38. -种制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法，所述方法包括如下步骤： 将根据权利要求17-30和32-36中任一项所述的组合物与至少一种食品或动物饲料成 分混合；以及 以蒸气将所得的混合物制丸。
39. -种制造饲料组合物的方法，所述方法包括如下步骤： 将饲料组分与包括芯和涂层的颗粒混合，其中所述芯包含功能邻近的植酸酶和植酸； 蒸气处理所述组合物，以及 将所述组合物制丸。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述涂层包含盐。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述盐选自柠檬酸钠、NaCl、Na2C03、NaN0 3、 Na2HP04、NH4C1、（ΝΗ4) 2ΗΡ04、NH4H2P04、（NH 4) 2S04、KC1、Κ2ΗΡ04、KH2P0 4、KN03、Na2S04、K2S0 4、KHS04、 MgS04、ZnS04 和 CuS04。
42. 根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述植酸的浓度是至少10毫重量 摩尔浓度。
43. 根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是BP17。
44. 根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是Ronozyme P-(CT)。
【文档编号】A23K1/165GK104125778SQ201380008459
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年2月1日 优先权日:2012年2月7日
【发明者】M·S·格伯特 申请人:丹尼斯科美国公司