在花瓣中发挥功能的来自蓝猪耳的启动子的制作方法
【专利摘要】一种用于改变植物花色的新型启动子，其选自：1)核酸，所述核酸包含由序列号:20、序列号:12或序列号:21代表的核苷酸序列；和2)核酸，所述核酸与序列号:20、序列号:12或序列号:21代表的核苷酸序列保持相同的启动子活性，并且其包含通过一个或若干核苷酸序列的附加、缺失和/或取代修饰原始核苷酸序列而产生的核苷酸序列，或其可在极严苛条件下与包含和原始核苷酸序列互补的核苷酸序列的核酸杂交，或其有90％或更多与原始核苷酸序列相同的序列。
【专利说明】在花瓣中发挥功能的来自蓝猪耳的启动子
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型启动子。更详细地说，本发明涉及来自蓝猪耳的类黄酮3'，5'_羟 化酶（以下简写为F3' 5' H。）基因或黄酮合成酶（以下简写为FNS。）基因的转录调控区 域及其利用。
【背景技术】
[0002] 通过利用基因重组技术，使有用的基因在目的植物中表达，可赋予其植物新的性 状。如此制备的基因重组植物已被广泛商业化栽培。因基因表达调控主要在转录阶段进行 控制，所以，转录调控在调控基因表达上也最为重要。即在适合的时期、适合的组织中、以适 合的强度转录目的基因，对制备产业上有用的基因重组植物非常重要。转录开始在很多情 况下通过位于翻译区域的5'侧的DNA序列来控制。将确定基因转录的起始位点，直接调控 其频率的DNA上的区域称为启动子。启动子有时存在于起始密码子的5'侧数十bp处，多 包含TATA盒等的序列。其进一步还在5'侧具有结合各种转录调控因子的顺式作用元件， 这些顺式作用元件的存在控制转录的时期、进行转录的组织、转录的强度等。转录调控因 子根据其氨基酸序列的不同被分为很多家族。例如，Myb型转录调控因子、bHLH(碱性/螺 旋-环-螺旋（basic helix loop helix))型转录调控因子等为有名的家族。实际上，在 很多情况下，转录调控区域和启动子在相同意义上使用，并无严格的区别。
[0003] 作为花色的主要成分的花色素苷为总称为类黄酮的次级代谢产物之一。花色素苷 的颜色依赖于其结构。即作为花色素苷的发色团的花色素 B环的羟基数增加时变蓝。代表 性的花色素中有花翠素、花青素、花葵素，B环的羟基数分别为3个、2个、1个。其中，花翠 素最蓝（参照图1)。此外，还已知修饰花色素苷的芳香族酰基（香豆酰基、咖啡酰基等）的 数量增加时，花色素苷的颜色变蓝（即最大吸收值向长波长方向移动），花色素苷的稳定性 增加。或还已知，黄酮等的类黄酮与花色素苷共存时，颜色变蓝变深。将此种效果称为辅色 素效果，黄酮为辅色素的1种（以下参照非专利文献1)。
[0004] 与花色素苷的生物合成有关的酶、编码该酶的基因已被充分研究（参照上述非专 利文献1)。例如，催化使B环的羟基数增加的反应的酶为类黄酮3'-羟化酶（以下简写 为F3' H。）和F3' 5' H。F3' Η是花青素合成所必需的酶，F3' 5' Η为花翠素合成所必需 的酶。因月季、康乃馨、菊花等不合成花翠素，所以，这些植物中无蓝色品种。已有通过使 F3'5'Η基因在这些植物中表达，从而使花色变蓝的实例（参照国际公开第W01996/036716 号、以下专利文献4同第W02009/062253号）。黄酮通过FNS的催化由黄烷酮合成。已有 通过使黄酮合成酶基因在矮牵牛中表达而改变花色的实例（参照Plant Biotechnol 21 377-386(2004))。
[0005] 而且对于花色素苷的生物合成酶的基因的转录调控也得到了结论。在位于这些基 因的起始密码子的5'侧的转录调控区域中，有结合了 Myb型转录调控因子、bHLH型转录调 控因子的顺式作用元件序列。已知Myb型转录调控因子和bHLH型转录调控因子控制矮牵 牛、玉米、紫苏等的花色素苷的合成（参照上述非专利文献1)。
[0006] 在植物中负责基因转录的启动子（以下也称为转录调控区域。）中，有在任何组 织或发育阶段的任何时期均发挥功能的所谓组成型启动子、仅在特定器官·组织内发挥功 能的器官?组织特异性启动子和仅在发育阶段的特定时期表达的时期特异性启动子。作为 用于使有用基因在基因重组植物中表达的启动子，常用组成型启动子。作为代表性的组成 型启动子，有花椰菜花叶病毒35S启动子、在其基础上构建的启动子（以下参照非专利文献 3)、Macl启动子（以下参照非专利文献4)等。但是，植物中，很多基因为组织?器官特异 性或时期特异性表达。其表明使基因进行组织·器官特异性或时期特异性表达对植物是必 需的。已有利用此种组织?器官特异性或时期特异性的转录调控区域进行植物的基因重组 的实例。还有例如使用种子特异性转录调控区域使蛋白质在种子中积累的实例。
[0007] 对于在花瓣内特异性发挥功能或在花瓣内主要发挥功能的启动子及其利用，已有 一些报道。例如，已有使用来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合酶基因的启动子，使F3 ' 5 ' Η基 因在矮牵牛和康乃馨内表达而改变花瓣颜色的实例。并显示出月季的查耳酮合酶基因的启 动子在月季、菊花中发挥了功能。也有通过使瓜叶菊的F3' 5' Η基因的启动子在矮牵牛中 表达而改变花色的实例。此外，还有为使F3' 5'Η基因在菊花花瓣中表达而使用菊花的黄 烷酮3-羟化酶基因启动子的实例。
[0008] 但是，此种启动子在目的重组植物中，能在何种程度上发挥强的功能，是否能带来 目的表现型，还很难预测。而且，转入与宿主植物相同或类似的碱基序列或转入基因在染色 体中进行多拷贝或重复插入时，有时会引起基因的沉默（参照以下非专利文献5)。因此，为 使多个外源基因表达而重复使用相同启动子，有时会引起基因的沉默，所以应避免。此外， 即使说与类黄酮的合成有关的酶基因在花瓣内发挥功能，其表达的时间点也不同。已知通 常黄酮、黄酮醇与花色素苷相比，会在花更早期的时候即表达。例如，为了改变花色，获得表 达时间点不同的多个启动子在产业上非常重要。
[0009] 现有技术文献
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献1国际公开第W096/25500号
[0012] 专利文献2国际公开第W001/72984号
[0013] 专利文献3国际公开第W094/28140号
[0014] 专利文献4国际公开第W005/17147号
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1 Plant J. 54, 737-749, 2008
[0017] 非专利文献 2 Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800, 1989
[0018] 非专利文献 3 lant Cell Physiology 1996,37,49-59
[0019] 非专利文献 4 Plant Molecular Biology 1990, 15, 373-381
[0020] 非专利文献 5 Annals of Botany 1997, 79, 3-12
【发明内容】
[0021] 本发明要解决的课题在于，提供用于改变植物花色的有用的新型启动子。
[0022] 本
【发明者】为解决上述课题而深入研究，不断实验，结果发现了作为用于改变植物 花色的有用的新型启动子的来自蓝猪耳的F3' 5' Η基因和FNS基因的转录调控区域，并确 认了其有用性，从而完成了本发明。
[0023] 即本发明如下。
[0024] [1] -种核酸，其特征在于，选自以下核酸：
[0025] (1)核酸，其由序列号20所示的碱基序列组成，
[0026] (2)核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号 20所示的碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序 列组成，
[0027] (3)核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列 号20所示的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及
[0028] (4)核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号20 所示的碱基序列有至少90%的序列同一性。
[0029] [2] -种表达载体，其特征在于，包含所述[1]中所述的核酸。
[0030] [3]根据所述[2]中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号20所示的碱基序 列。
[0031] [4] 一种非人宿主，其特征在于，通过所述[2]或[3]中所述的表达载体转化。
[0032] [5] -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[1]中所 述的核酸。
[0033] [6]根据所述[5]中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于， 为切花。
[0034] [7] -种切花加工品，其特征在于，为将所述[6]中所述的切花用作原料而得到的 切花加工品。
[0035] [8] -种核酸，其特征在于，选自以下核酸：
[0036] (1)核酸，其由序列号12所示的碱基序列组成，
[0037] (2)核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号 12所示的碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序 列组成，
[0038] (3)核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列 号12所示的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及
[0039] (4)核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号12 所示的碱基序列有至少90%的序列同一性。
[0040] [9] -种表达载体，其特征在于，包含所述[8]中所述的核酸。
[0041] [10]根据所述[9]中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号12所示的碱基序 列。
[0042] [11] 一种非人宿主，其特征在于，通过所述[9]或[10]中所述的表达载体转化。
[0043] [12] -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[8]中 所述的核酸。
[0044] [13]根据所述[12]中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在 于，为切花。
[0045] [14] 一种切花加工品，其特征在于，为将所述[13]中所述的切花用作原料而得到 的切花加工品。
[0046] [15] -种核酸，其特征在于，选自以下核酸：
[0047] (1)核酸，其由序列号21所示的碱基序列组成，
[0048] (2)核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号21所 示的碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序列组 成，
[0049] (3)核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列号21 所示的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及
[0050] (4)核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号21所示 的碱基序列有至少90 %的序列同一性。
[0051] [16] -种表达载体，其特征在于，包含所述[15]中所述的核酸。
[0052] [17]根据所述[16]中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号21所示的碱基序 列。
[0053] [18] -种非人宿主，其特征在于，通过所述[16]或[17]中所述的表达载体转化。
[0054] [19] -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[15]中 所述的核酸。
[0055] [20]根据所述[19]中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在 于，为切花。
[0056] [21] -种切花加工品，其特征在于，为将所述[20]中所述的切花用作原料而得到 的切花加工品。
[0057] [22] -种表达载体，其特征在于，包含所述[1]中所述的核酸和所述[15]中所述 的核酸。
[0058] [23]根据所述[22]中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号20所示的碱基序 列和序列号21所示的碱基序列。
[0059] [24] -种非人宿主，其特征在于，通过所述[22]或[23]中所述的表达载体转化。
[0060] [25] -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[1]中 所述的核酸和所述[15]中所述的核酸。
[0061] [26]根据所述[25]中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在 于，为切花。
[0062] [27] -种表达载体，其特征在于，包含所述[8]中所述的核酸和所述[15]中所述 的核酸。
[0063] [28]根据所述[27]中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号12所示的碱基序 列和序列号21所示的碱基序列。
[0064] [29] -种非人宿主，其特征在于，通过所述[27]或[28]中所述的表达载体转化。
[0065] [30] -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[8]中 所述的核酸和所述[15]中所述的核酸。
[0066] [31]根据所述[30]中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在 于，为切花。
[0067] [32] -种切花加工品，其特征在于，为将所述[31]中所述的切花用作原料而得到 的切花加工品
[0068] 通过使用认为在蓝猪耳花瓣内负责酶基因转录的启动子区域、即控制蓝猪耳 F3' 5' Η基因和FNS基因转录的区域，可在花等的类黄酮、花色素苷积累的组织内引起特异 性的外源基因转录。作为转录的外源基因，有与花色、香味相关联的基因，但不限于这些。
【专利附图】
【附图说明】
[0069] 图1为类黄酮生物合成途径的概略图。
[0070] 图2为基因转入用双元载体pSPB3797的概略图。
[0071] 图3为基因转入用双元载体pSPB3798的概略图。
【具体实施方式】
[0072] 作为本发明的转录调控区域，例如可列举由序列号20、12或21所示的碱基序列组 成的核酸。但是，也认为由通过序列号20、12或21所示的碱基序列组成的核酸中多个（1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个）碱基发生附加、缺失及/或取代而进行修饰后的碱基序列组成 的启动子维持与原有启动子同样的活性。因此，只要在花瓣内作为转录调控区域发挥功能， 本发明也涉及如下核酸，其由对序列号20、12或21所示的碱基序列进行1个或多个碱基序 列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序列组成。
[0073] 本发明还进一步涉及如下核酸，其可作为蓝猪耳F3' 5' Η基因或FNS基因的转录 调控区域发挥功能，且可与序列号20、12或21所示的碱基序列在高严谨条件下杂交，或可 作为蓝猪耳F3' 5' Η基因或FNS基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号20、12或21所 示的碱基序列有至少90%的序列同一性。
[0074] 作为这些核酸，可列举由以下碱基序列组成的核酸，可与序列号20、12或21所示 的碱基序列的互补多核苷酸在严谨条件下杂交，与序列号20、12或21所示的碱基序列有优 选为约70%以上、更优选为约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最优选为约 99%的序列同一性。
[0075] 在此，严谨条件是指由本领域技术人员容易确定的杂交条件，通常为依赖探针长 度、洗涤温度及盐浓度的经验性条件。通常，探针越长，用于适合退火的温度越高，探针越短 退火温度越低。杂交通常依赖于互补链存在于接近但低于其熔点的环境中时变性DNA的再 退火能力。具体而言，例如作为低严谨条件，可列举在杂交后滤膜的洗涤阶段中，在37°C? 42°C的温度条件下，在5XSSC、0. 1% SDS溶液中洗涤等。此外，作为高严谨条件，例如可列 举在洗涤阶段，在65°C、0. 1XSSC及0. 1% SDS溶液中洗涤等。通过将严谨条件提高到更 高，可得到序列同源性或同一性高的多核苷酸。
[0076] 本发明也涉及包含蓝猪耳F3' 5' Η基因及/或FNS基因的转录调控区域的载体， 以及由该载体转化的非人宿主。
[0077] 而且，本发明涉及将蓝猪耳F3' 5' Η基因及/或FNS基因的转录调控区域与有用 的外源基因连接，转入该外源基因而得到的具有改变颜色等有用性状的植物或者其后代或 它们的部分或者组织，该部分也可为切花。作为可转化的植物的例子，可列举月季、菊花、康 乃馨、金鱼草、仙客来、兰花、大丽花、洋桔梗、小苍兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、 天竺葵、老鹳草、矮牵牛、蓝猪耳、郁金香、稻子、牵牛花、大麦、小麦、菜籽、马铃薯、西红柿、 白杨、香蕉、蓝桉、番薯、黄豆、苜蓿、羽扇豆、玉米等，但不限于这些。
[0078] 本发明涉及使用上述切花的加工品（切花加工品）。在此，作为切花加工品，包括 使用该切花的干花瓣、保鲜花、干花、树脂密封品等，但不限于这些。
[0079] 实施例
[0080] 以下，通过实施例，具体说明本发明。
[0081] 在无特殊要求的情况下，分子生物学的方法按照Molecular Cloning(Sambrook and Russell，2001)进行。农杆菌、矮牵牛、月季的转化如国际公开第W02004/020637号或 专利文献4中记载，但不限于这些方法。
[0082] [实施例1 :蓝猪耳F3' 5' Η基因 TBG10的转录调控区域的克隆]
[0083] 蓝猪耳F3' 5' H cDNA的碱基序列已为公知（Molecular Breeding6, 239-246 (2000)、Gene Bank DNA 保藏号 AB012925)。将 λ DASHII (安捷伦科 技（A gilent Technologies)株式会社）用作载体，通过制造者推荐的方法构建蓝猪耳的 染色体DNA文库。蓝猪耳染色体DNA从蓝猪耳品种Summer Wave Blue (三得利花卉株式会 社）的叶中制备。将所得到的蓝猪耳染色体DNA文库使用标记了的蓝猪耳F3'5'H cDNA筛 选，回收与蓝猪耳F3' 5' H cDNA杂交的噬菌体的噬菌斑。以该噬菌体为模板，以2种寡核 苷酸（T3pro :5, -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3,（序列号 1)、T7pro:5, -TAATACGACTCACTATAGG G-3'（序列号2))为引物进行PCR，将包含来自蓝猪耳的染色体DNA的序列的DNA片段进行 扩增。以该 DNA 为模板，以一组寡核苷酸（T3pro、THF2RV:5' -CTATGGAAGATAACAATG-3'（序 列号3))或一组寡核苷酸（T7pro、THF2RV)为引物进行PCR。将用可使用T3pro和THF2RV 的PCR进行扩增的约5. 6kb的DNA片段（序列号4)克隆到pC R2. 1 T0P0(in vitrogen公 司）上。所得到的质粒作为PSPB3745。
[0084] [0055]以上述噬菌体为模板，以一组寡核苷酸（TBGlOproFW: Sf-TGAAATATAAATATGAATGGG-S^ 序列号 5)、TBG10proRV: 5' -ACTGAATGGTGACTAGCTGC-3'（序列号6))为引物进行PCR。将所得到的DNA片段克隆到 BluntII-T0P0(in vitrogen公司）上，作为质粒pSPB3764(包含序列号7)。该DNA序列如 序列号7所示。进而以pSPB3764为模板，以一组寡核苷酸（TBG10proFW、TBG10proXb alRV : 5' -TCTAGACTGAATGGTGACTAGC-3'（序列号8))为引物进行PCR。通过将该DNA片段克隆到 Bluntll-TOPO上，得到pSPB3770。在该质粒上包含约4kb的蓝猪耳F3' 5' Η的5'非翻译 序列，在3'端有限制性内切酶Xbal的识别序列。
[0085] [实施例2 :蓝猪耳F3' 5' Η基因 TBG16的转录调控区域的克隆]
[0086] 增殖实施例1中得到的与蓝猪耳F3' 5' H cDNA杂交的噬菌体的噬菌斑，制备 噬菌体DNA。以此为模板，以一组寡核苷酸（T3pro、THF2RV)或一组寡核苷酸（T7pro、 THF2RV)为引物进行PCR。将从来自（T3pro、THF2RV)的PCR中得到的约2. 3kb的DNA片 段克隆到PCR2. 1 Τ0Ρ0上，作为pSPB3746。该序列如序列号9所示。以该质粒为模板，以 一组寡核苷酸（TBG16proFW :5' -TCCTATTGCACTCGTTTTTTC-3'（序列号 10)、TBG16proRV : 5'-ACTGAATGGTGACTAGCCGC-3'（序列号11))为引物进行PCR。将所得到的DNA片段克隆到 BluntII-T0P0(i n vitrogen公司）上，作为质粒pSPB3758。该质粒中所包含的DNA序列如 序列号12所示。进而以pSPB3758为模板，以一组寡核苷酸（TBG16proFW、TBG16pr oBamHI : 5'-GGATCCACTGAATGGTGACTAGCC-3'（序列号13))为引物进行PCR。通过将该DNA片段克 隆到Bluntll-TOPO上，得到pSPB3768。在该质粒中，包含约0. 7kb的蓝猪耳F3' 5' Η的5' 非翻译序列，在3'端具有限制性内切酶Ba mHI的识别序列。
[0087][实施例3 :蓝猪耳FNS基因的转录调控区域的克隆]
[0088] 将实施例1中得到的蓝猪耳染色体DNA文库使用标记了的蓝猪耳FNS cDNA筛选， 回收与蓝猪耳FNS cDNA杂交的噬菌体的噬菌斑。增殖噬菌体的噬菌斑，制备噬菌体DNA。 以该 DNA 为模板，以一组寡核苷酸（T3pro、TFNSR3:5' -ATTCCTAATGGGCTGAAAGTG-3'（序列 号14))或一组寡核苷酸（T7pro、TFNSR3)为引物，进行PCR。将可用使用T7pro和TFNSR3 的PCR扩增的约4. 2kb的DNA片段（序列号15)克隆到pCR2. 1 Τ0Ρ0上。所得到的质粒作 为 PSPB3747。
[0089] 以上述噬菌体DNA为模板，以一组寡核苷酸（TFNSlproFW: 5' -CAAATGAAACCCCATC AGTGTC-3'（序列号 16)、TFNSlproRV:5'-GCTTTATATATATTTTTTTAGCGC-3'（序列号 17))为 引物，进行PCR。将所扩增的DNA片段克隆到Bluntll-TOP 0上，作为质粒pSPB3759。插 入该质粒中的序列如序列号18所示。以PSPB3759为模板，以一组寡核苷酸（TFNSlproFW、 TFNSlpBamHIRV:5' -GGATCCGCTTTATATATATTTTTTTAGC-3'（序列号 19))为引物，进行 PCR。 通过将该DNA片段克隆到BluntTOPO上，得到pSPB3769。在该质粒中包含约3. 6kb的蓝猪 耳FNS的5'非翻译序列，在3'端具有限制性内切酶BamHI的识别序列。
[0090] [实施例4 :包含蓝猪耳F3' 5' Η及FNS的转录调控区域的双元载体的制备]
[0091] 用SspI酶切实施例1中得到的质粒pSPB3770并进行末端平滑化，进一步用Xbal 酶切。将所得到的1. 6kb的DNA片段（序列号20)与用Hindlll酶切p BinPLUS并进行末 端平滑化，且进一步用Xbal酶切的DNA片段连接，作为质粒pSPB3791。
[0092] 将用BamHI和PacI酶切质粒pSPB580 (如专利文献4记载）而得到的DNA片段（包 含来自三色堇的F3' 5' Η BP40 cDNA和矮牵牛D8终止子序列）与用B amHI和PacI酶切 而得到的pBinPLUS连接，得到质粒pSPB3795。通过将用Xba I和PacI酶切质粒pSPB3791 而得到的DNA片段与用Xbal和PacI酶切pSPB3795而得到的DNA片段连接，得到双元载体 PSPB3793。在该双元载体上，来自TB G10的转录调控区域、来自三色堇的F3'5'H cDNA、矮 牵牛D8终止子按顺序连接。
[0093] 用EcoRI酶切实施例2中得到的质粒pSPB3768并进行末端平滑化，进一步用 BamHI酶切。将所得到的0· 7kb的DNA片段与用Hindlll酶切pBinPLUS并进行末端平滑化， 进一步用BamHI酶切的DNA片段连接，作为质粒pSPB3790。将用BamHI和PacI酶切上述质 粒而得到的DNA片段与用BamHI和PacI酶切pSPB580而得到的DNA片段连接，得到双元载 体PSPB3792。在该双元载体上，来自T BG16的转录调控区域、来自三色堇的F3'5'HcDNA、 矮牵牛D8终止子按顺序连接。
[0094] 用Spel酶切实施例3中得到的质粒pSPB3769并进行末端平滑化，进一步用BamHI 酶切。将所得到的1. 4kb的DNA片段（序列号21)与用Hindlll酶切pS PB3383并进行 末端平滑化，进一步用BamHI酶切的DNA片段连接，得到质粒pS PB3789。在该质粒上，蓝 猪耳FNS转录调控区域、蓝猪耳FNScDNA、矮牵牛D8终止子按顺序连接，可通过将包含这些 的DNA片段用AscI切割来回收。将该D NA片段转入pSPB3793的AscI的双元载体作为 PSPB3798 (参照图3)，且转入p SPB3792的AscI的双元载体作为pSPB3797 (参照图2)。
[0095] [实施例5 :矮牵牛中的表达（PT315的结果）]
[0096] 将实施例4中记载的双元质粒pSPB3797或pSPB3798转入根癌农杆菌（(Ag robacterium tumefaciens)系统AglO中。使用该转化农杆菌，转化开浅粉色花的矮牵牛系 统Skr4xSw63(如国际公开第W093/01290号记载）。将来自pSPB3797的实验区作为PT314， 将来自PSPB3798的实验区作为PT315。得到PT314中独立的2系统的转化体。两系统的花 色变为紫红色。以下表1和表2中分别表示将PT314和PT315的花瓣及Skr4xSw63的花色 素用公知方法分析的结果。
[0097] 表 1
[0098]
【权利要求】
1. 一种核酸，其特征在于，选自以下核酸： (1) 核酸，其由序列号20所示的碱基序列组成， (2) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号20所 示的碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序列组 成， (3) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'Η基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列号20 所示的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及 (4) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号20所示 的碱基序列有至少90 %的序列同一性。
2. -种表达载体，其特征在于，包含权利要求1中所述的核酸。
3. 根据权利要求2中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号20所示的碱基序列。
4. 一种非人宿主，其特征在于，通过权利要求2或3中所述的表达载体转化。
5. -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入权利要求1中所述 的核酸。
6. 根据权利要求5中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，为 切花。
7. -种切花加工品，其特征在于，为将权利要求6中所述的切花用作原料而得到的切 花加工品。
8. -种核酸，其特征在于，选自以下核酸： (1) 核酸，其由序列号12所示的碱基序列组成， (2) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号12所 示的碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序列组 成， (3) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列号12 所示的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及 (4) 核酸，其可作为蓝猪耳F3'5'H基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号12所示 的碱基序列有至少90 %的序列同一性。
9. 一种表达载体，其特征在于，包含权利要求8中所述的核酸。
10. 根据权利要求9中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号12所示的碱基序列。
11. 一种非人宿主，其特征在于，通过权利要求9或10中所述的表达载体转化。
12. -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入权利要求8中所述 的核酸。
13. 根据权利要求12中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于， 为切花。
14. 一种切花加工品，其特征在于，为将权利要求13中所述的切花用作原料而得到的 切花加工品。
15. -种核酸，其特征在于，选自以下核酸： (1) 核酸，其由序列号21所示的碱基序列组成， (2) 核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且由对序列号21所示的 碱基序列进行1个或多个碱基序列发生附加、缺失及/或取代的修饰后的碱基序列组成， (3) 核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且可与由序列号21所示 的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，及 (4) 核酸，其可作为蓝猪耳FNS基因的转录调控区域发挥功能，且与序列号21所示的碱 基序列有至少90 %的序列同一性。
16. -种表达载体，其特征在于，包含权利要求15中所述的核酸。
17. 根据权利要求16中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号21所示的碱基序列。
18. -种非人宿主，其特征在于，通过权利要求16或17中所述的表达载体转化。
19. 一种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入权利要求15中所 述的核酸。
20. 根据权利要求19中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于， 为切花。
21. -种切花加工品，其特征在于，为将权利要求20中所述的切花用作原料而得到的 切花加工品。
22. -种表达载体，其特征在于，包含权利要求1中所述的核酸和权利要求15中所述的 核酸。
23. 根据权利要求22中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号20所示的碱基序列 和序列号21所不的喊基序列。
24. -种非人宿主，其特征在于，通过权利要求22或23中所述的表达载体转化。
25. -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入权利要求1中所述 的核酸和权利要求15中所述的核酸。
26. 根据权利要求25中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于， 为切花。
27. -种表达载体，其特征在于，包含权利要求8中所述的核酸和权利要求15中所述的 核酸。
28. 根据权利要求27中所述的表达载体，其特征在于，包含序列号12所示的碱基序列 和序列号21所不的喊基序列。
29. -种非人宿主，其特征在于，通过权利要求27或28中所述的表达载体转化。
30. -种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入权利要求8中所述 的核酸和权利要求15中所述的核酸。
31. 根据权利要求30中所述的植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于， 为切花。
32. -种切花加工品，其特征在于，为将权利要求31中所述的切花用作原料而得到的 切花加工品。
【文档编号】A01H5/02GK104254605SQ201380007587
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年2月19日 优先权日:2012年2月24日
【发明者】田中良和, 胜元幸久 申请人:三得利控股株式会社