一株高粘附力乳酸杆菌菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及饲用益生菌领域，特别涉及一株高粘附力乳酸杆菌菌株及其应用。该乳酸杆菌其具有良好的抑制病原菌黏附功能。一株高粘附力乳酸杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏日期2013年12月9日，保藏编号CGMCCNo.8542，菌株编号为ZJ617，分类命名为 Lactobacillusreuteri 。具有高粘附能力的乳酸杆菌菌株ZJ617，是为研究益生菌或乳酸杆菌的粘附机制提供有效的高粘附力模式菌株，同时在开发新型微生态制剂、应用微生物饲料添加剂、增强酸奶品质、改善人和动物微生物稳态都具有重要的实践意义。
CGMCC No.8542
2013.12.09
【专利说明】一株高粘附力乳酸杆菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及饲用益生菌领域，特别涉及一株高粘附力乳酸杆菌菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 在自然界存在的人类、动物和植物，不论体表还是体内都有大量的微生物参与活 动。微生物和宿主有各自的生理生化体系，但是两者存在着相互促进和相互制约的关系。宿 主的正常生理生化参数和病理参数都是两者相互作用的结果。人和动物的肠道是一个具有 生物多样性的微环境，其中具有几百种微生物菌群，不同微生物菌群之间的相互作用构成 肠道微生物稳态。正常人和动物机体肠道菌群组成相对恒定，而当机体处于外环境变化或 者接受应激反应会引起动物体内肠道微生物菌群失调。
[0003] 益生菌（Probiotics)为肠道微生物重要组成，在肠道中发挥着重要的益生作用。 益生菌是定植于人和动物肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效的活性有益微生物(细 菌或者酵母）的总称。常见的益生菌包括乳酸杆菌（Lactobacillus species)、双歧杆菌 (Bifidobacterium species)、链球菌（Streptococcus species)等。益生菌发挥功能的机 制包括改善机体免疫功能、干预病原微生物从而防止机体感染、修复机体微生物菌群稳态 等。
[0004] 乳酸杆菌与人和动物的生命活动息息相关，是人和动物体内必不可少的重要益 生菌群，具有重要的生理功能、理想的保健和医疗效果。在不同环境中，通过引入乳酸杆 菌改变肠道菌群是有益的，来自这种方法的营养和治疗益处在许多研究中已有报道，这种 益处包括增加营养素的利用、乳糖不耐症的减少、肠道感染防治以及肠道中病原微生物 抑制。国际上对益生菌的选择重要标准之一就是，益生菌必须能够耐受消化道的强酸和 高胆盐环境，并具有良好的粘附能力才能发挥益生作用。据研究报道，鼠李糖乳酸杆菌 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)能够粘附定植在婴儿小肠上，可有效缩短婴儿轮状病 毒的腹泻时间，同时具有对消化道的强酸和高胆盐环境有良好的耐受能力，是目前被国际 公认的安全的益生菌菌株。
[0005] 为了发挥乳酸杆菌对机体健康的促进作用，其在胃肠道中必须保持一定的数量， 同时必须具有对胃肠道中的温度、pH、胆盐和金属一定的耐受能力，从而防止被快速排除。 乳酸杆菌对粘膜表面的粘附能力可为其提供竞争优势，通过与病原菌竞争性粘附肠道上皮 细胞粘附位点从而抑制病原菌的生长扩繁，这一点对于维持消化道菌群平衡非常重要。嗜 酸乳酸杆菌菌株通过菌体本身的粘附占位阻断病原菌与细胞膜靶受体的结合，可以抑制肠 出血性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌对肠道上皮细胞的粘附和侵袭，从而起到保护肠道的作 用。显然，对上皮细胞表面粘附位点的粘附能力是乳酸杆菌在消化道长期定植并发挥益生 作用的必要条件。
[0006] 目前国内外的研究显示益生菌以及乳酸杆菌的粘附性具有菌株特异性，高粘附性 能的模式菌株较少，尚缺乏粘附相关的保护和机制研究性资料。在体内研究菌的粘附是困 难的，体外模拟体系中进行的评估已是公认的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一株从仔猪肠道分离获得的具有高粘附力的乳酸杆菌，其具有良好的 抑制病原菌黏附功能。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009] -株高粘附力乳酸杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏日期2013年12月9日，保藏编号CGMCC No. 8542,菌株编号为ZJ617,分类命名为 Lactobacillus reuteri〇
[0010] 本发明人从28日龄的断奶仔猪肠道分离筛选、纯化得到一株高粘附力乳酸杆菌 菌株。该菌株的生物学性质如下：
[0011] 形态学特征：在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在0. 1?2.0mm之间，圆形，乳 白色，边缘整齐，不透明，表面湿润光滑，无色素。在显微镜下观察，菌株细胞呈细杆状，不生 孢。属于革兰氏阳性菌，不运动。
[0012] 培养特征：最适生长温度30?37°C，兼性厌氧，有氧时生长慢，最适生长初始pH 为5. 7。生长于MRS培养基中，培养基成分：蛋白胨10. Og/L、牛肉粉8. Og/L、酵母粉4. Og/ L、葡萄糖20. Og/L、磷酸氢二钾2. Og/L、柠檬酸氢二铵2. Og/L、乙酸钠5. Og/L、硫酸镁0. 2g、 硫酸锰 〇? 04g/L、吐温 801. 0g/L。
[0013] 本发明提供的乳酸杆菌Lactobacillus reuteri ZJ617,具有高粘附力，同时具有 对热、酸、胆盐和金属（铜和锌）良好的耐受能力，证明该菌株具有良好的益生特性，能被用 来开发益生菌产品。乳酸杆菌ZJ617对病原菌(如大肠杆菌和沙门氏菌）粘附肠道细胞的 竞争、排斥、驱除性抑制方面具有显著的功效，能被用来开发抑制病原菌的菌剂。可以在研 究益生菌和乳酸杆菌的粘附机制，以及微生态制剂的研发等方面作为模式菌株。该乳酸杆 菌ZJ617因其具备的益生特性，将有广阔的应用前景，具有很高的社会效益、经济效益和生 态效益。
[0014] 一种乳制品包括如所述的高粘附力乳酸杆菌。
[0015] 一种所述的高粘附力乳酸杆菌菌株在发酵生产酸奶中的应用。
[0016] 一种益生菌饲料添加剂包括所述的高粘附力乳酸杆菌。具有高粘附力的乳酸杆菌 ZJ617能抑制动物肠道内致病菌作用，提高动物免疫力。
[0017] 作为优选，所述的益生菌饲料添加剂还包括载体，所述的高粘附力乳酸杆菌与载 体的质量比为2-3:15-30。本发明提供的益生菌微生物饲料添加剂，用于水产饲料中，其添 加量为饲料总重量的〇. 5-2% ;用于全价猪饲料中，其添加量为饲料总重量的2-5%。本发明 可提高动物生长性能，增加饲料利用率，降低饲料成本，增加动物摄食量，提高免疫机能，减 少动物肠道疾病死亡率，达到改善肉质品质的目的。
[0018] 作为优选，所述的载体为微晶高岭石、贝壳粉、甘薯淀粉及玉米淀粉中的任意一种 或两种以上的混合物。微晶高岭石、贝壳粉、甘薯淀粉、玉米淀粉是益生菌增殖所需要的营 养源，提高有益菌存活率，刺激宿主本身有益菌生长繁殖，并对菌体本身起到保护和附着作 用。
[0019] 具体的,本发明提供一种配方,乳酸杆菌ZJ617与载体按3:16的质量比混合，载体 为微晶高岭石、贝壳粉、甘薯淀粉及玉米淀粉的混合物，质量比为1:1:1-2:1-2。所述乳酸杆 菌ZJ617和载体在300?350转/min，搅拌10?20min，混合均匀，制得益生菌微生物饲料 添加剂。
[0020] 本发明的有益效果是：具有高粘附能力的乳酸杆菌菌株ZJ617,是为研究益生菌 或乳酸杆菌的粘附机制提供有效的高粘附力模式菌株，同时在开发新型微生态制剂、应用 微生物饲料添加剂、增强酸奶品质、改善人和动物微生物稳态都具有重要的实践意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是乳酸杆菌的镜检图片；
[0022] 图2是分离获得乳酸杆菌肠道来源分布示意图；
[0023] 图3是乳酸杆菌的生化鉴定部分结果；
[0024] 图4是乳酸杆菌16S rDNA的全长片段扩增电泳图谱；
[0025] 图5是分离获得85株乳酸杆菌16SrDNA的进化树图谱；
[0026] 图6是高粘附菌株ZJ617和低粘附菌株ZJ610的镜检图；
[0027] 图7是乳酸杆菌对大肠杆菌的竞争抑制结果图（CFU/well X IO4);
[0028] 图8是乳酸杆菌对大肠杆菌的排斥结果图（CFU/well X IO4);
[0029] 图9是乳酸杆菌对大肠杆菌的去除性抑制结果图（CFU/well X IO4);
[0030] 图10是乳酸杆菌对沙门氏菌的竞争抑制作用（CFU/well X IO4);
[0031] 图11是乳酸杆菌对沙门氏菌的排斥抑制作用（CFU/well X IO4);
[0032] 图12是乳酸杆菌和去表面蛋白乳酸杆菌对沙门氏菌的驱除抑制作用（CFU/ well X104)。
【具体实施方式】
[0033] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合 附图及较佳实施例，对依据本发明提供的具有高粘附力的乳酸杆菌ZJ617对病原菌粘附肠 道细胞的竞争、排斥、驱除性抑制的功效进行说明，详细说明如后。
[0034] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0035] 实施例1 :
[0036] 本发明从28日龄的断奶仔猪肠道获得粘液和食糜，后涂板厌氧培养，单个克隆进 行纯化培养获得纯菌落，获得乳酸杆菌85株乳酸杆菌(部分菌株如图1 )，其中空肠食糜36 株、回肠食糜3株、空肠粘液18株和回肠粘液28株(如图2)。
[0037] 获得的纯菌进行美兰染色，利用显微镜根据形态初步筛选出乳酸菌，后使用23种 糖发酵生化管确认乳酸杆菌的种类，生化管分别是乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、 木糖、海藻糖、棉子糖、果糖、鼠李糖、半乳糖、纤维二糖、密二糖、松三糖、甘露糖、山梨醇、阿 拉伯醇、水杨素、七叶苷、葡萄糖酸盐、精氨酸水解、D-核糖、苦杏仁苷生化管(部分结果如图 3)。通过生化鉴定，根据显色反应证实所获细菌为乳酸杆菌。
[0038] 提取85株乳酸杆菌的基因组DNA，通过正向引物和反向引物对乳酸杆菌的 16srDNA的全长进行扩增（图4)，并测序。
[0039] 正向引物的核苷酸序列选自SEQ ID No. I-SEQ ID No. 4中的一种，即 5'-CACGGATCCAGTTTGAT(C/T) (A/C)TGGCTCAG-3';反向引物的核苷酸序列选自 SEQ ID No.5 *SEQIDNo.6JP5'-GTGAAGCTTAGGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3'。
[0040] 乳酸杆菌16S rDNA全长片段扩增结果，长度为1500bp左右，与预期结果相同。 测得序列用BLAST软件与GenBank(EF088327)和RDP数据库中的基因序列进行相似性分 析，并与GenBank中相近的16S rRNA基因序列在Clustal X (1. 8)程序包中进行多重序列 匹配排列（Multiple alignments)分析，经过与Genbank比对发现我们所获得的乳酸杆 菌主要为三种，约氏乳酸杆菌（Lactobacillus johnsonill strain)l株，唾液乳酸杆菌 (Lactobacillus salivarius strains) 54 株，罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri strains) 30 株。
[0041] 采用编号ZJ对菌株进行命名。采用MAGA3. 1程序包中的Neighbor-Joining法构 建系统发生树（图5)。
[0042] 本发明选择用于后续进行人结肠癌细胞系Caco-2细胞粘附试验的乳酸杆菌40 株。
[0043] 建立Caco-2细胞培养体系，细胞生长于含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中， 5%C0 237°C培养。将细胞接种于6孔板培养板（I X IO6个/孔)，培养细胞丰度达到80%，用 磷酸缓冲液PBS冲洗3次，加入不含胎牛血清的DMEM/F12培养基，于5%C0 23 7°C条件下培 养，构建出模拟体内乳酸杆菌粘附Caco-2细胞的最佳粘附模型。分别对上述选择的40株 乳酸杆菌进行Caco-2细胞能力分析。结果发现，其中乳酸杆菌ZJ617具有高粘附能力，为 12. 35CFU/Cac〇-2,显著高于其他菌株，如低粘附菌株ZJ610。高粘附菌株ZJ617和低粘附 菌株ZJ610见图6,统计结果见表1。
[0044] 表1.乳酸杆菌粘附数量
[0045]
【权利要求】
1. 一株高粘附力乳酸杆菌菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏日期2013年12月9日，保藏编号CGMCC No. 8542。
2. -种益生菌饲料添加剂包括如权利要求1所述的高粘附力乳酸杆菌。
3. 根据权利要求2所述的益生菌饲料添加剂，其特征在于：还包括载体，所述的高粘附 力乳酸杆菌与载体的质量比为2-3:15-30。
4. 根据权利要求3所述的益生菌饲料添加剂，其特征在于：所述的载体为微晶高岭石、 贝壳粉、甘薯淀粉及玉米淀粉中的任意一种或两种以上的混合物。
5. -种乳制品包括如权利要求1所述的高粘附力乳酸杆菌。
6. -种权利要求1所述的高粘附力乳酸杆菌菌株在发酵生产酸奶中的应用。
【文档编号】A23K1/16GK104293689SQ201410043216
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】汪海峰, 刘建新, 高侃, 章文明, 张宏福, 王翀 申请人:浙江农林大学