一种优良白色茶树菇的育种方法
【专利摘要】本发明属于茶树菇领域，更具体涉及一种优良白色茶树菇的育种方法。该方法通过白色茶树菇与浅灰褐色品系的茶树菇进行杂交，其杂交后代再与白色茶树菇进行第二次杂交，便可获得白色茶树菇杂交子。通过本发明获得的白色茶树菇杂交子，携有浅灰褐色品系茶树菇的基因，可将浅灰褐色品系茶树菇的优良性状遗传到白色茶树菇，从而对白色茶树菇的性状进行改良。
【专利说明】—种优良白色茶树菇的育种方法
[0001]【技术领域】
本发明属于茶树菇领域，更具体涉及一种优良白色茶树菇的育种方法。
[0002]【背景技术】 茶树燕cyIindracea )属担子菌亚门层菌纲伞菌目粪锈伞科田头燕属，是一种木生食用菌，又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柱状环绣伞等，生长于温带至亚热带地区，营养价值很高，其味道鲜美、盖肥柄脆、清香可口、风味独特、营养丰富，深受人们喜爱，同时还是民间传统药用菌，具有利尿渗湿、健脾止泻、清热平肝功效，享有“中华神菇”之称。
[0003]茶树菇原为野生真菌，我国主要分布于江西、福建、浙江、贵州、云南、台湾等省的山区油茶林中，子实体初期为暗红褐色或浅褐色，后变为褐色或浅土黄褐色。自然界中，遗传与变异是物种进化的动力，食用菌中颜色的变异时有发生，我们熟悉的金针菇，原为黄色，后出现白色变异种；毛木耳常见的颜色是红褐色或带紫色，在自然界出现白色变型，即子实体白色的毛木耳(王朝江，池惠荣，吕孟雨.我国木耳属一新记录白色变型[J].吉林农业大学学报，1998，20 (增刊):207.)。茶树菇子实体颜色也出现了新性状，颜色由褐色变为白色，目前关于茶树菇子实体白色变型的遗传还未清楚，也未见茶树菇白色品种的选育。
[0004]据王筱凡(王筱凡.茶树菇农艺性状分析及EST-SSR标记的应用[D].南昌大学，2012)对17个茶树菇菌株的菌丝长势、菇体颜色、抗逆性、开伞度、产量及生物学效率等多项农艺性状进行评比实验发现，白色品种“白菇”和“As-F”的各项农艺性状均比浅灰褐色品系的弱。这可能是目前市场上茶树菇以浅灰褐色品系为主的原因。然后消费者对于白色具有天生的偏好性，如白色金针菇逐渐代替黄色金针菇，成为金针菇栽培的主流品种。因此培育优良白色的茶树菇品种具有潜在的商业应用价值。
[0005]
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种优良白色茶树菇的育种方法。
[0006]本发明采取的技术方案如下:
本发明的育种方法包括以下步骤:
(O亲本选择:选择白色茶树菇和性状优良的浅灰褐色品系的茶树菇；
(2)白色茶树菇原生质体制备与分离，获得白色茶树菇单核化菌株；
(3)白色茶树菇单核化菌株交配型测定:随机选择一个白色茶树菇单核化菌株，其交配型标记为A1B1，与余下的单核化菌株在PDA固体培养基上进行配对，待两个单核化菌株的菌丝接触3天后，观察锁状联合，出现锁状联合的表示两个单核化菌株发生亲和反应，则另一个单核化菌株的交配型标记为A2B2，若没有观察到锁状联合则表示两个单核化菌株未发生亲和反应，此时两个单核化菌株的交配型均为AlBl ；
(4)第一次杂交与筛选:选择长势良好的交配型AlBl以及A2B2的单核化菌株分别与浅灰褐色品系的茶树菇进行双-单杂交，获得杂交子，经出菇试验从中选择综合性状较好的杂交子Hl ；
(5)第二次杂交与筛选:通过出菇试验，获得Hl的单孢菌株，将Hl的单孢菌株与没有获得杂交子Hl的另一种交配型的白色茶树菇单核化菌株进行单-单杂交，经出菇试验，便可获得白色茶树菇杂交子。
[0007]所述白色茶树菇原生质体制备与分离，步骤如下:将白色茶树菇在PDA固体培养基上活化二代后，转接PDA液体培养基中，在25°C下静置培养，挑取菌丝团于1.5mL经灭菌的离心管，并加入0.6mol/L甘露醇0.5mL,于4°C、5000rpm离心5min,去上清液,加入2%溶壁酶0.5mL, 28°C恒温水浴培养4h，每半小时振荡一次；酶解4h后取出，酶解液用塞有脱脂棉注射器过滤菌丝；收集过滤液并加入等量甘露醇,于4°C、3500rpm离心15min，去上清液，加入400uL甘露醇，4°C、3500rpm离心15min，再去上清液，加入200uL甘露醇；在400倍显微镜下观察原生质体，并稀释至每个视野中只有4-5个原生质体，吸取150~180uL均匀涂布在倒有再生培养基的培养皿上，于25°C恒温培养2.5~4d ;在100倍显微镜下将萌发的原生质体挑起于PDA固体培养基，25°C恒温培养；其中再生培养基:5.0g麦芽糖、5.0g酵母膏、10.0g 葡萄糖、109.3g KCl、20.0g 琼脂、1000 mL 水。
[0008]本发明具有以下优点:
1、首次开展白色茶树菇的杂交育种。
[0009]2、通过白色茶树菇与浅灰褐色品系的茶树菇进行杂交，其杂交后代再与白色茶树菇进行第二次杂交，便可获得白色茶树菇杂交子。
[0010]3、通过本发明获得的白色茶树菇杂交子，携有浅灰褐色品系茶树菇的基因，可将浅灰褐色品系茶树菇的优良性状遗传到白色茶树菇，从而对白色茶树菇的性状进行改良。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为第二次杂交杂交子出菇筛选，其中杂交子hcll9子实体为白色，杂交子hcl22子实体为浅褐色。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
[0013]实施例1:一种白色茶树菇的育种方法，包括以下步骤:
1、亲本选择
从市场购得主栽的浅灰褐色品系的茶树菇古茶I号、古茶2号和白色茶树菇菌株(王筱凡.茶树菇农艺性状分析及EST-SSR标记的应用[D].南昌大学，2012)。
[0014]2、白色茶树菇原生质体制备与再生
将白色茶树菇在PDA固体培养基上活化二代后，转接PDA液体培养基中，在25°C下静置培养5天。待菌丝长在接种块周围长至肉眼可见约5mm时，挑取菌丝团于1.5mL经灭菌的离心管并加入0.6mol/L甘露醇0.5mL,于4°C、5000rpm离心5min。去上清液,加入2%溶壁酶0.5mL，28°C恒温水浴培养4h，每半小时振荡一次。酶解4h后取出，酶解液用塞有脱脂棉注射器过滤菌丝。收集过滤液并加入等量甘露醇，于4°C、3500rpm离心15min，去上清液，加入400uL甘露醇，4°C、3500rpm离心15min，再去上清液，加入200uL甘露醇。在400倍显微镜下观察原生质体，并稀释至每个视野中只有4-5个原生质体。吸取150uL均匀涂布在倒有再生培养基的培养皿上，于25°C恒温培养2.5~4d。在100倍显微镜下将萌发的原生质体挑起于PDA固体培养基，25°C恒温培养。再生培养基:5.0g麦芽糖、5.0g酵母膏、10.0g 葡萄糖、109.3g KCl、20.0g 琼脂、1000 mL 水。[0015]3、原生质体单核化菌株获得
再生的原生质体菌丝长至2~3cm时，取前端菌丝于400倍显微镜下进行锁状联合观察，观察了 50个再生的原生质体，有16个再生的原生质体没有观察到锁状联合，即得到16个单核化菌株，余下34个再生菌株有锁状联合，丢弃。
[0016]4、白色茶树菇单核化菌株交配型测定
随机选择一个白色茶树菇单核化菌株，其交配型记为A1B1，与余下15个单核化菌株在PDA固体培养基上进行配对，待两个单核化菌株的菌丝接触3d后，取接触点的菌丝观察锁状联合，有10个配对观察到锁状联合，则这10个单核化菌株的交配型是A2B2，有5个配对未观察到锁状联合，则这5个单核化菌株的交配型均为AlBl。
[0017]5、第一次杂交与筛选
选择长势良好的交配型为AlBl和交配型为A2B2的单核化菌株各I个，分别记为Ml和M2。将Ml分别与古茶I号、古茶2号进行双-单杂交，获得杂交子Hl和H2，同时将M2分别与古茶I号、古茶2号进行双-单杂交，获得杂交子H3和H4。对杂交子H1、H2、H3和H4进行出菇试验，4个杂交子的子实体颜色均为浅褐色，4个杂交子中Hl出菇最快，出菇比较整齐，产量也较高，因此选择Hl作为第二轮杂交的亲本。
[0018]6、茶树菇杂交子Hl单孢菌株获得
茶树菇杂交子Hl经出菇试验，获得Hl的子实体，进行孢子弹射，将弹射的孢子稀释涂布于PDA固体培养基，待孢子萌发后在100倍显微镜下将萌发的孢子挑起于PDA斜面培养基，25°C恒温培养，待菌丝长至2~3cm时，取前端菌丝于400倍显微镜下进行锁状联合观察，保留未观察到锁状联合的单孢菌株，共获得63个单孢菌株。
[0019]7、第二次杂交与筛选
从杂交菌株Hl获得的33个单孢菌株分别与白色茶树菇的单核化菌株M2进行配对杂交，共获得63个杂交子，对33个杂交子进行出菇试验，33个杂交子均长出子实体，见图1，经统计其中30个杂交子子实体颜色呈白色，33个杂交子子实体颜色呈褐色，即获得30个白色品系的茶树菇杂交子，对获得的白色茶树菇杂交子进一步出菇试验，子实体仍表现为白色，无褐色出现，表明其白色性状稳定。
[0020]获得的白色茶树菇杂交子菇体洁白，菌柄较长、较粗，菌盖中等大小，开伞程度中等。菌丝萌发快，长势好，抗逆性较强，28~31d长满菌袋，满袋后6~8d开始形成原基，原基形成后4~6d可以采收，出菇整齐，产量较高。与亲本白色茶树菇菌株相比，菌丝长势、抗逆性、开伞度、产量及生物学效率等多项农艺性状均较强，与浅灰褐色品系的茶树菇除颜色差异明显外，在生长速度、抗逆性、出菇期、朵形和产量等方面差异不大。
[0021]通过此法可对白色茶树菇进行性状改良，培育白色茶树菇新品种。获得的白色茶树菇杂交子朵形好，出菇整齐，产量较高，长势好，抗逆性较强，可应用于栽培生产。
[0022]主要试剂与培养基:
甘露醇、溶壁酶购买自Sigma公司。
[0023]PDA固体培养基:200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂，1000mL水。
[0024]PDA液体培养基:200g马铃薯，20g葡萄糖，1000mL水。
[0025]再生培养基:5.0g麦芽糖、5.0g酵母膏、10.0g葡萄糖、109.3g KCl、20.0g琼脂、1000 mL 水。
【权利要求】
1.一种优良白色茶树菇的育种方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)亲本选择:选择白色茶树菇和性状优良的浅灰褐色品系的茶树菇； (2)白色茶树菇原生质体制备与分离，获得白色茶树菇单核化菌株； (3)白色茶树菇单核化菌株交配型测定:随机选择一个白色茶树菇单核化菌株，其交配型标记为A1B1，与余下的单核化菌株在PDA固体培养基上进行配对，待两个单核化菌株的菌丝接触3天后，观察锁状联合，出现锁状联合的表示两个单核化菌株发生亲和反应，则另一个单核化菌株的交配型标记为A2B2，若没有观察到锁状联合则表示两个单核化菌株未发生亲和反应，此时两个单核化菌株的交配型均为AlBl ； (4)第一次杂交与筛选:选择长势良好的交配型AlBl以及A2B2的单核化菌株分别与浅灰褐色品系的茶树菇进行双-单杂交，获得杂交子，经出菇试验从中选择综合性状较好的杂交子Hl ； (5)第二次杂交与筛选:通过出菇试验，获得Hl的单孢菌株，将Hl的单孢菌株与没有获得杂交子Hl的另一种交配型的白色茶树菇单核化菌株进行单-单杂交，经出菇试验，便可获得白色茶树菇杂交子。
2.根据权利要求1所述的优良白色茶树菇的育种方法，其特征在于:所述白色茶树菇原生质体制备与分离，步骤如下:将白色茶树菇在PDA固体培养基上活化二代后，转接PDA液体培养基中，在25°C下静置培养，挑取菌丝团于1.5mL经灭菌的离心管，并加入0.6mol/L甘露醇0.5mL,于4°C、5000rpm离心5min，去上清液，加入2%溶壁酶0.5mL, 28°C恒温水浴培养4h，每半小时振荡一次；酶解4h后取出，酶解液用塞有脱脂棉注射器过滤菌丝；收集过滤液并加入等量甘露醇，于4°C、3500rpm离心15min，去上清液，加入400uL甘露醇，4°C、3500rpm离心15min，再去上清液，加入200uL甘露醇；在400倍显微镜下观察原生质体，并稀释至每个视野中只有4-5个原生质体，吸取150~ISOuL均匀涂布在倒有再生培养基的培养皿上，于25°C恒温培养2.5~4d ;在100倍显微镜下将萌发的原生质体挑起于PDA固体培养基，25°C恒温培养；其中再生培养基:5.0g麦芽糖、5.0g酵母膏、10.0g葡萄糖、109.3gKCl、20.0g 琼脂、1000 mL 水。
【文档编号】A01H1/04GK103828600SQ201410063648
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】刘新锐, 谢宝贵, 王圣铕 申请人:福建农林大学